高壓氧對去卵巢大鼠骨微結(jié)構(gòu)改善及骨代謝的影響機(jī)制探究

白登彥 王 冠 張海軍 朱 濤 趙志鵬

1.甘肅省第二人民醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730000；2.西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）在臨床上大多是由于骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，世界衛(wèi)生組織（WTO）將OP定義為骨微機(jī)構(gòu)損傷，骨量持續(xù)減少導(dǎo)致骨脆性變高的臨床骨病。美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）提出OP是骨強(qiáng)度降低引發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)性的骨骼臨床疾病。OP在一定程度上能夠減少骨載荷承受力、骨脆性增加，增加骨折發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和各種慢性的疼痛[1]。在免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等多組織和器官的協(xié)作下，導(dǎo)致OP的發(fā)生。臨床診斷中，骨量減少、骨代謝標(biāo)志物減少都是診斷OP的標(biāo)準(zhǔn)。研究表明[2]，高壓氧療可能對骨微結(jié)構(gòu)改善及成骨細(xì)胞生成有一定促進(jìn)作用，但具體機(jī)制仍不明確。本次實(shí)驗(yàn)通過研究去卵巢大鼠OP模型，在高壓氧的干預(yù)措施下，旨在探究高壓氧對去卵巢大鼠骨代謝平衡的影響機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物

選取30只SPF級Wistar雌性大鼠[購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號：SCXK（甘）2020-0001]，體重（170±20）g，同等條件下喂養(yǎng)1周后進(jìn)行OP造模。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 藥品及試劑

BALP ELISAKit（批號：E201902）、CBF-α1 ELISAKit（批號：E201906）、E2 ELISAKit（批號：E201908）、CTX-I ELISAKit（批號：E201906）、PINP ELISAKit（批號：E201905）、OC ELISAKit（批號：E201901） ，北京方程生物有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器

微型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CT影像系統(tǒng)（西門子，德國）；骨密度儀（韓國，型號： EXA-PRESTO） ；酶聯(lián)免疫檢測儀（BIO-RAD，美國）；高壓氧艙（上海七零一所）。

1.4 動(dòng)物分組與造模

將30只大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、高壓氧組，每組大鼠各10只?？瞻捉M不進(jìn)行任何干預(yù)，其他兩組大鼠通過去卵巢法建立骨質(zhì)疏松模型大鼠[3]。造模成功后，高壓氧組大鼠每天進(jìn)行高壓氧療30 min，艙壓固定為0.25 MPa，吸純氧。三組大鼠其余飼養(yǎng)條件等相同，持續(xù)干預(yù)4周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

1.5.1 骨代謝標(biāo)志物BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC、E2含量測定大鼠處死后心臟取血2 ml，設(shè)置離心R為10 cm，轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心10 min，取上清液，ELISA法檢測血清中雌二醇E2、核結(jié)合因子-α1（core binding factor-α1，CBF-α1）、骨特異性堿性磷酸酶（Bone specific alkaline phosphatase，BALP）、Ⅰ型 膠 原 羧 基 末 端 肽（Cterminal type Ⅰcollagen telopeptide，CTX-Ⅰ）、Ⅰ型前膠原氨基端前肽（procollagen typeⅠamino-terminal peptide，PⅠNP）、骨鈣素（osteocalcin，OC）含量水平。

1.5.2 骨微結(jié)構(gòu)及骨密度測定大鼠腹主動(dòng)脈取血，分離大鼠右側(cè)股骨，對股骨干骺端進(jìn)行CT掃描，CT參數(shù)設(shè)定為：65 kV，384 mA，分辨率18 μm。掃描完成后三維重組感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），提取骨微結(jié)構(gòu)重建圖，骨骼分析軟件Advanced Bone Analysis（ABA）對骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)包括相對骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、連接密度（Conn.D）、骨結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（SMI）及骨密度（BMD）進(jìn)行計(jì)量學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（oneway- ANOVA），兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨密度及骨代謝標(biāo)志物比較

與空白組比較，大鼠造模成功后模型組BMD及BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC、E2含量顯著降低（P＜ 0.05）；高壓氧干預(yù)4周后，與模型組對比，高壓氧組大鼠BMD、BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC、E2含量不同程度升高（P＜ 0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BMD及骨代謝標(biāo)志物含量比較（±s）

表1 各組大鼠BMD及骨代謝標(biāo)志物含量比較（±s）

注 與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05；BMD：骨密度，BALP：骨特異性堿性磷酸酶，CBF-α1：核結(jié)合因子-α1，CTX-Ⅰ：Ⅰ型膠原羧基末端肽，PⅠNP：Ⅰ型前膠原氨基端前肽，OC：骨鈣素，E2：雌二醇

2.2 各組大鼠骨小梁微結(jié)構(gòu)比較

與空白組比較，造模后模型組大鼠骨相對骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、連接密度（Conn.D）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（SMI）均出現(xiàn)不同程度改變（P＜ 0.05）；高壓氧干預(yù)4周后，與模型組對比，高壓氧組大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D、Tb.Sp、SMI參數(shù)發(fā)生不同程度改變（P＜ 0.05），骨強(qiáng)度及彈性顯著增加。見表2。

表2 各組大鼠骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較（±s）

注 與空白組比較，*P ＜ 0.05，與模型組比較，△P ＜ 0.05，BV/TV：相對骨體積分?jǐn)?shù)、Tb.N：骨小梁數(shù)量、Tb.Th：骨小梁厚度、Tb.Sp：骨小梁分離度、Conn.D：連接密度、SMI：骨結(jié)構(gòu)模型指數(shù)

組別 n BV/TV（%） Tb.N（cm-1） Tb.Th（μm） Conn.D（cm-3） Tb.Sp（cm-1） SMI空白組 10 1.341±0.01 10.321±0.51 60.042±9.82 125.032±9.26 1.643±0.01 1.601±0.03模型組 10 1.062±0.03* 5.420±0.07* 33.870±9.01* 79.156±9.37* 3.061±0.32* 3.520±0.02*高壓氧組 10 1.203±0.05△ 8.731±0.32△ 41.390±10.37△ 98.311±10.84△ 1.980±0.02△ 2.713±0.12△F值 17.642 16.155 10.862 12.317 13.161 10.552 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

導(dǎo)致OP的成因與很多學(xué)說相關(guān)，微循環(huán)障礙、代謝異常、基因多態(tài)性等因素密切相關(guān)[4-5]。伴隨經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展，老齡化趨勢隨人口數(shù)量激增越來越明顯，這也導(dǎo)致OP的發(fā)病率增加，由其導(dǎo)致的骨折風(fēng)險(xiǎn)也越來越高。

高 壓 氧 療（hyper bari coxygen therapy，HBO）是一種輔助治療方法，通過高壓氧的環(huán)境實(shí)現(xiàn)治療的作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[6-7]，在高壓氧環(huán)境中，氧分子的間距增加，此時(shí)可以極大提高血氧張力，加速新生小血管和側(cè)支循環(huán)進(jìn)行，維持人體生命活動(dòng)。而且研究還證實(shí)[8-9]，HBO可加速組織內(nèi)骨痂膠原蛋白生成速度及骨痂鈣鹽沉積。PⅠNP是骨形成初期的敏感指標(biāo)之一，CTX-Ⅰ作為骨吸收狀態(tài)下Ⅰ型膠原釋放的主要因子，其表達(dá)高低決定Ⅰ型膠原含量多少，CTX-Ⅰ的表達(dá)能夠體現(xiàn)成骨細(xì)胞的活性和骨吸收的情況，是診斷骨質(zhì)疏松癥的金指標(biāo)[10-11]。CBF-α1是影響成骨細(xì)胞分化的重要因子，CBF-α1能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，人體骨骼才能得以正常生長，維持骨骼正常發(fā)育。CBF-α1還能夠調(diào)控雙向調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分裂分化過程，加速未分化成骨細(xì)胞的表達(dá)及已分化成骨細(xì)胞的活性[12]。通常情況下，成骨細(xì)胞會(huì)分泌OC，OC的表達(dá)高低能直接反映成骨細(xì)胞的活性和功能變化[13]。骨代謝的平衡情況都可以通過CTX-Ⅰ、NTX-1、CBF-α1以及OC表達(dá)來體現(xiàn)。BALP是由下丘腦分泌一種活性因子，通過介導(dǎo)破骨細(xì)胞，影響骨吸收，是骨吸收的標(biāo)志物之一。有文獻(xiàn)表明[14-15]，BALP通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的形成，加速骨吸收，從而使骨密度增加，提高骨強(qiáng)度，加速骨吸收的速度；同時(shí)，OP的發(fā)生與發(fā)展，也與骨密度和骨小梁微結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠摘除卵巢后，其BMD顯著降低，骨小梁微結(jié)構(gòu)損傷不完整，證明OP模型成功建立。與空白組相比，OP大鼠血清中骨代謝相關(guān)標(biāo)記物BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC、E2含量顯著變化，BMD明顯降低，骨小梁顯微結(jié)構(gòu)不完整，提示OP大鼠骨量減少，骨吸收能力增多，骨形成減少，符合臨床中OP的臨床表現(xiàn)。與模型組相比，經(jīng)過高壓氧的干預(yù)治療，OP大鼠骨密度明顯增加，骨小梁微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改善，骨量流失減緩。這與權(quán)學(xué)蓮等[16]的研究結(jié)果相類似。但在本研究中，高壓氧治療延緩骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制尚不明確，有待在接下來的實(shí)驗(yàn)中探究。

綜上所述，高壓氧可減輕大鼠骨量減少骨密度的降低，加速骨質(zhì)疏松后骨質(zhì)的礦化和骨的生成，并能改善骨微結(jié)構(gòu)。這也提示，高壓氧治療可能成為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的輔助治療方案，但具體機(jī)制仍有待研究。