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      依托泊苷脂質(zhì)微球注射液熱原及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法

      2022-03-16 07:06:50
      中國(guó)醫(yī)藥科學(xué) 2022年3期
      關(guān)鍵詞:熱原檢查法內(nèi)毒素

      孫 丹

      遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院藥理室,遼寧沈陽(yáng) 110036

      依托泊苷是肺癌患者臨床化學(xué)治療的重要一線藥物,尤其針對(duì)廣泛期、預(yù)后較差的小細(xì)胞肺癌,其聯(lián)合順鉑方案的治療有效率高,已沿用數(shù)十年。市售依托泊苷一般會(huì)具有骨髓抑制等明顯不良反應(yīng),并且水中的溶解度差(溶解度為58.7 mg/L)[1-2],常會(huì)誘發(fā)刺激等不良反應(yīng)[3]。最近幾年來逐步開展的有關(guān)依托泊苷脂質(zhì)體類藥物新劑型研究,都在力求降低該品種的毒副作用,同時(shí)最大限度保留其抗癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的相關(guān)藥效[2]。

      依托泊苷脂質(zhì)微球注射液包含依托泊苷、脂溶性介質(zhì)、水和表面活性劑,這些成分使依托泊苷在油水兩相的界面膜中都會(huì)有一定比例的分布,從而可提高在油水均難溶的依托泊苷在乳劑介質(zhì)中的穩(wěn)定性和載藥量,并可降低其毒性及血管刺激性,同時(shí)可提高藥物的化學(xué)穩(wěn)定性及療效,使得該制劑在臨床應(yīng)用中具有高效性、低毒性和低刺激性的優(yōu)勢(shì)。目前來看,國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)上市的脂質(zhì)體注射劑類型還比較少,其產(chǎn)業(yè)化規(guī)模、生產(chǎn)工藝水平同國(guó)外相關(guān)制劑相比還有一定差距,質(zhì)量控制中的熱原檢查項(xiàng)也未有文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]。本研究通過按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則[6-7]中收載的“熱原檢查和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”,旨在探討依托泊苷脂質(zhì)微球注射液2種藥典方法的可操作性與可行性,從而找出適用于該品種的相關(guān)檢查方法,以控制藥品質(zhì)量。

      1 儀器與材料

      ZRY-2D智能熱原儀(天津天大天發(fā)科技公司),ET-96內(nèi)毒素凝膠法測(cè)定儀(天津天大天發(fā)科技公司),vortex-5渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造公司),omh180烘箱(賽默飛世爾科技公司)。

      細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):150601-201885,規(guī)格:80 EU/支);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水,湛江博康海洋生物有限公司,批號(hào):151210,2 ml/支);鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司,批號(hào): 1307031,規(guī)格:0.1 ml/支,靈敏度:0.06 EU/ml;福州市新北生化工業(yè)有限公司,規(guī)格:0.1 ml/支,批號(hào):14111112,靈敏度:0.06 EU/ml)。依托泊苷脂質(zhì)微球注射液(沈陽(yáng)藥科大學(xué),批號(hào):20131101、20131102、20131103,規(guī)格:50 ml∶50 mg)。

      日本大耳白兔,體重2.6~3.0 kg,雄雌不限,雌兔無孕,由沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(遼)2014-0002。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 熱原檢查

      本品臨床最大給藥量為靜脈滴注,一日按體表面積100~150 mg/m2。參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“9301注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”[8],熱原檢查設(shè)定限值可參照臨床劑量計(jì)算,樣品的注射體積每千克體重一般不少于0.5 ml,不超過10 ml。另樣品每平方米體表面積的劑量乘以0.027即可換算為每千克的體重劑量(M),故樣品臨床用量為4.05 mg/kg,熱原檢查實(shí)驗(yàn)給藥體積設(shè)定為最大給藥劑量的2倍,即8 ml/kg·BW。

      按《中華人民共和國(guó)藥典》2015版四部通則中“1142熱原檢查法”[6]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取檢體溫合格的家兔,每批3只,耳靜脈注射本品,8 ml/kg·BW,給藥后測(cè)定體溫,共測(cè)定6次,每次間隔30 min,以6次測(cè)量體溫中最高溫度值減去基礎(chǔ)測(cè)量體溫值,即為該只家兔體溫升高溫度。結(jié)果表明,三批樣品中每只家兔體溫升高值均低于0.6 ℃,3只家兔的體溫升高數(shù)值總和均低于1.3℃。熱原檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定。見表1。

      表1 依托泊苷脂質(zhì)微球注射液熱原實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素

      2.2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核標(biāo)定根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[7],進(jìn)行鱟試劑的靈敏度復(fù)核。結(jié)果顯示,2個(gè)批次的鱟試劑標(biāo)定結(jié)果均在0.5~2λ之間。見表2。2個(gè)批次鱟試劑的靈敏度均符合規(guī)定。

      表2 鱟試劑靈敏度復(fù)核標(biāo)定(EU/ml)

      2.2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“9301注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”[8]進(jìn)行樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定。計(jì)算公式:L=K/M,其中M為人使用該制劑每千克體重每小時(shí)的最大給予劑量,本品為100 mg/m2×0.027=2.7 mg/kg,K為靜脈給藥途徑,人使用該制劑每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量,注射劑品種K值為5 EU/(kg·h),L=K/M=5 EU/(kg·h)/2.7 mg/(kg·h)=2 EU/mg。

      2.2.3 干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)過對(duì)體積分?jǐn)?shù)為1.25%、2.5%、5%乙醇溶液的考察,結(jié)果顯示,體積分?jǐn)?shù)為1.25%的乙醇對(duì)內(nèi)毒素檢查方法無影響,說明在實(shí)驗(yàn)過程中,要保證乙醇最后稀釋成終濃度為1.25%的乙醇溶液,才不會(huì)干擾內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)。見表3。

      表3 乙醇內(nèi)毒素檢查法考察結(jié)果

      按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[7]檢查。取3批樣品,使用靈敏度為0.06 EU/ml的鱟試劑。先使用60%乙醇代替內(nèi)毒素檢查用水稀釋樣品原液,并在渦旋混合器上振蕩5 min,經(jīng)過步驟稀釋后樣品終濃度為0.03 mg/ml(與λ=0.06 EU/ml鱟試劑相對(duì)應(yīng)的稀釋液濃度)及0.06 mg/ml(用于考察)。陰性對(duì)照(NC)為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水,陽(yáng)性對(duì)照(PC)為0.125 EU/ml內(nèi)毒素溶液,樣品陽(yáng)性對(duì)照(PPC)為含0.125 EU/ml內(nèi)毒素的相應(yīng)濃度的樣品溶液。加完樣品后,輕輕混勻,37℃±1℃保溫1 h后記錄試驗(yàn)結(jié)果。見表4。結(jié)果表明,依托泊苷脂質(zhì)微球0.03 mg/ml稀釋液(NPC)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查符合規(guī)定,初步確定該樣品0.03 mg/ml濃度為最大無干擾濃度。

      表4 依托泊苷脂質(zhì)微球注射液細(xì)菌內(nèi)毒素干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      2.2.4 干擾試驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[7]進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn),依托泊苷脂質(zhì)微球稀釋液濃度為0.03 mg/ml。將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品分別用BET水和樣品稀釋液稀釋至0.125、0.06、0.03、0.015 mg/ml濃度,平行4管,同時(shí)用上述樣品稀釋液及BET水分別做平行2管陰性對(duì)照,輕輕混勻,37℃±1℃測(cè)定儀保溫1 h后,記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。見表5。結(jié)果表明,用上述兩個(gè)廠家鱟試劑分別進(jìn)行干擾試驗(yàn),Es均在0.5~2.0λ,Et均在0.5~2.0 Es,依托泊苷脂質(zhì)微球注射液0.03 mg/ml濃度稀釋液無干擾。

      表5 依托泊苷脂質(zhì)微球注射液的干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果(λ=0.06 EU/ml)

      2.2.5 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值擬定為:每1 mg依托泊苷脂質(zhì)微球注射液中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于2 EU。按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[7]進(jìn)行檢查。使用鱟試劑的靈敏度為0.06 EU/ml,樣品濃度為0.03 mg/ml稀釋液,陰性對(duì)照為BET水,陽(yáng)性對(duì)照為0.125 EU/ml內(nèi)毒素溶液,樣品陽(yáng)性對(duì)照是以樣品0.03 mg/ml濃度稀釋液來稀釋0.125 EU/ml的內(nèi)毒素溶液,樣品加完后,注意輕輕混勻,37℃±1℃保溫1 h并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。見表6。結(jié)果表明,按照擬定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn),三批依托泊苷脂質(zhì)微球注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合設(shè)定限值規(guī)定。

      表6 依托泊苷脂質(zhì)微球注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果(安度斯λ=0.06 EU/ml)

      3 討論

      參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則中“9301注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”[8],熱原檢查限值參照臨床使用劑量計(jì)算,對(duì)于重癥用藥、需聯(lián)合用藥的藥品,一般為人用每千克體重每小時(shí)最大給予供試品劑量的2~5倍。依托泊苷脂質(zhì)微球注射液適用于與其他抗腫瘤藥物如順鉑等合用,治療支氣管肺癌及睪丸癌。也可用于惡性淋巴瘤、急性非淋巴細(xì)胞性白血病、尤文氏癌和消化道惡性腫瘤的聯(lián)合化療。故熱原檢查試驗(yàn)劑量設(shè)定為8 ml/kg,相當(dāng)于臨床人用劑量的2倍,從嚴(yán)保障臨床用藥安全性。

      預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)直接使用BET水稀釋依托泊苷脂質(zhì)微球注射液進(jìn)行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn),但從結(jié)果來看樣品稀釋液對(duì)鱟試劑有增強(qiáng)型的干擾作用。故參照文獻(xiàn)[9]實(shí)驗(yàn)方法,以60%乙醇溶液溶解本品,再進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。具體操作使用0.67 ml 60%乙醇溶液加入1 ml樣品原液,振蕩5 min。接下來按照一般樣品稀釋步驟進(jìn)行,即保證乙醇溶液終體積分?jǐn)?shù)為1.25%。本品內(nèi)毒素限值擬定為計(jì)算限值,即2 EU/mg,三批樣品的內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合制定限值規(guī)定。但本品有干擾作用,需用60%乙醇溶解本品,同時(shí)鱟試劑中含有多種蛋白質(zhì),而乙醇則使蛋白質(zhì)變性,從而干擾鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝膠反應(yīng)[10],這就決定了供試品中乙醇含量不能過高,且還需選用高靈敏度的鱟試劑才能排除干擾。

      因各生產(chǎn)企業(yè)在鱟試劑生產(chǎn)過程中原料、工藝、批次、質(zhì)量控制等方面的不同,本實(shí)驗(yàn)前期選用不同品牌鱟試劑進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究使用的兩家鱟試劑干擾較小,適用于該品種的檢查。

      和傳統(tǒng)熱原檢查法相比較[11-14],細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法因其具有多種優(yōu)點(diǎn)而被各國(guó)藥典采用,并逐步替代家兔熱原檢查法控制注射劑內(nèi)毒素的相關(guān)安全性。現(xiàn)在已經(jīng)有越來越多的藥品施行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。但與此同時(shí),某些中藥、抗生素、生物制品、氨基酸相關(guān)注射劑、醫(yī)療器械等品種,因其與內(nèi)毒素產(chǎn)生的致熱協(xié)同反應(yīng)或干擾作用或因樣品材料的特殊、復(fù)雜性,仍需使用家兔法對(duì)特殊樣品進(jìn)行熱原控制[15]。

      依托泊苷為植物成分鬼臼毒素的衍生物,臨床上主要用于小細(xì)胞肺癌、惡性生殖細(xì)胞瘤、惡性淋巴瘤、白血病等癌癥的治療。其具有廣譜抗癌癥活性及較高的治療指數(shù),尤其對(duì)小細(xì)胞肺癌的治療效果非常好,能提高2年生存率并改善患者生存質(zhì)量。但依托泊苷在臨床使用過程中最常見不良反應(yīng)為Ⅲ~Ⅳ度血液學(xué)不良反應(yīng)、發(fā)熱及感染,成因主要是藥理作用通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ,導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)被破壞造成永久損傷,引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡而起到治療作用。故骨髓抑制為藥物的主要毒性,其中嗜中性白細(xì)胞會(huì)顯著減少。而肝臟、腎臟、心臟及神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)比較少[16]。需要嚴(yán)格控制藥品質(zhì)量,以排除因藥品質(zhì)量問題引起的發(fā)熱反應(yīng),保證臨床用藥安全。以目前對(duì)依托泊苷脂質(zhì)微球的研究發(fā)展程度來看,以后必然會(huì)出現(xiàn)越來越多相關(guān)制劑,本研究盡早制訂其熱原、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn),為以后該品種的發(fā)展盡一份綿薄之力。

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