菊糖對(duì)蚯蚓糞肥性狀的影響及調(diào)控過(guò)程①

曹惠翔，李 帥，楊 敏，黃 婷，李 媛，甘泉峰，謝軍偉，趙耕毛

菊糖對(duì)蚯蚓糞肥性狀的影響及調(diào)控過(guò)程①

曹惠翔，李 帥，楊 敏，黃 婷，李 媛，甘泉峰，謝軍偉，趙耕毛*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

通過(guò)蚯蚓堆肥試驗(yàn)，探討菊糖對(duì)蚯蚓的益生作用及高活力蚯蚓糞肥的形成過(guò)程，可為灘涂生態(tài)農(nóng)牧化模式構(gòu)建及障礙土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。以牛糞、赤子愛(ài)勝蚓()和菊糖為材料，設(shè)置純牛糞養(yǎng)殖蚯蚓(EM)和添加菊糖的牛糞養(yǎng)殖蚯蚓(IEM)處理，養(yǎng)殖周期為40 d，每隔10 d采樣分析，研究了牛糞–蚯蚓腸道內(nèi)容物–普通蚯蚓糞肥/菊糖型蚯蚓糞肥性質(zhì)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。結(jié)果表明：添加菊糖與否的腐熟牛糞經(jīng)蚯蚓取食、消化、排泄等過(guò)程所形成的菊糖型蚯蚓糞肥和普通蚯蚓糞肥，其基本性質(zhì)較為一致：pH趨于中性，電導(dǎo)率顯著下降，氮元素被吸收利用，有機(jī)質(zhì)加速分解礦化，磷、鉀元素進(jìn)一步釋放。但添加菊糖提高了有機(jī)質(zhì)的降解效率與鉀素釋放，40 d時(shí)IEM處理蚯蚓糞肥的有機(jī)質(zhì)含量比EM處理低9.4%，全鉀含量高13.0%。EM處理的脲酶、堿性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶活性總體呈先升后降的趨勢(shì)，其峰值出現(xiàn)在20 ～ 30 d；而IEM處理縮短了酶活性峰值的出現(xiàn)時(shí)間(除脲酶活性外)，10 d時(shí)堿性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶活性均達(dá)到峰值，其值較EM處理分別提高113.0% 和61.0%。養(yǎng)殖10 d時(shí)，普通蚯蚓糞肥和菊糖型蚯蚓糞肥微生物多樣性顯著增加，菊糖型蚯蚓糞肥功能菌數(shù)量呈倍數(shù)增長(zhǎng)。添加菊糖提高了前、中期(10、20 d)蚯蚓糞肥中放線菌門(mén)(Actinobateria)的相對(duì)豐度，其中20 d時(shí)較EM處理增加40.7%。可見(jiàn)，菊糖能夠調(diào)控蚯蚓堆肥進(jìn)程與蚯蚓糞肥性狀，蚯蚓堆肥20 d后獲得的菊糖型蚯蚓糞肥生物活性高、品質(zhì)佳。

蚯蚓糞肥；菊糖；酶活性；群落結(jié)構(gòu)；微生物多樣性

我國(guó)濱海地區(qū)的鹽漬土面積約占全國(guó)鹽漬土總面積的40%，是我國(guó)五大鹽漬土區(qū)域之一。土壤鹽漬化是土地治理中的一大難題，目前我國(guó)可耕面積面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，濱海鹽堿地作為重要的后備土地資源，其治理與開(kāi)發(fā)對(duì)保護(hù)我國(guó)糧食安全具有重要意義[1]。濱海鹽堿地鹽漬化程度高、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏且生物活力較差，新墾灘涂鹽堿地資源亟待加速治理改造[2]。有機(jī)類肥料能夠改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤微生物活性，促進(jìn)鹽漬化土壤向良性轉(zhuǎn)化，為鹽堿土改良提供了新的切入點(diǎn)[3]。

蚯蚓糞是有機(jī)物料經(jīng)蚯蚓消化系統(tǒng)作用后產(chǎn)生的生物有機(jī)肥，其具有排水性高、持水量大和通氣性好等特點(diǎn)[4]，且含有豐富的養(yǎng)分和有益微生物，具有較強(qiáng)的供肥保肥及改良土壤的能力[5-6]。蚯蚓糞在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抑制植物土傳病害和緩解土壤鹽脅迫方面發(fā)揮著重要作用[7-8]。研究表明，蚯蚓糞肥較普通有機(jī)肥在土壤改良和促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面的效果更好[9]。減肥減藥、以生物有機(jī)肥替代化肥是綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向，蚯蚓糞肥的生產(chǎn)利用具有廣闊的發(fā)展前景。但是目前蚯蚓堆肥缺乏統(tǒng)一規(guī)范性，蚯蚓糞肥的品質(zhì)得不到有效保障，因此生產(chǎn)高品質(zhì)蚯蚓糞肥成為實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。

菊糖是由D-果糖經(jīng)β(1→2)糖苷鍵鏈接而成的線性直鏈多糖，末端常帶有一個(gè)葡萄糖殘基。菊糖作為植物中的儲(chǔ)備性多糖廣泛存在于多種植物體內(nèi)，能夠有效改善人體腸道微生物的組成和結(jié)構(gòu)[10]。菊糖幾乎不被胃酸水解和消化，人和動(dòng)物體內(nèi)都缺乏分解菊糖的酶類，但菊糖可被腸道內(nèi)大量有益菌群代謝利用，從而改善腸道環(huán)境，促進(jìn)腸道理想微生態(tài)形成[11]。有研究表明，菊糖可以促進(jìn)腸道內(nèi)的雙歧桿菌()增殖，增強(qiáng)胃腸道蠕動(dòng)，提高腸胃功能，增加消化和食欲，提高機(jī)體免疫力[12-13]。盡管有大量研究報(bào)道了菊糖對(duì)人體腸道菌群具有益生作用，但菊糖作為一種新型綠色無(wú)殘留的飼料添加劑在蚯蚓堆肥中是否發(fā)揮益生作用尚未有研究報(bào)道。

本研究通過(guò)為期40 d的蚯蚓堆肥試驗(yàn)，探究菊糖在蚯蚓堆肥過(guò)程中所發(fā)揮的益生作用，旨在揭示牛糞–蚯蚓腸道內(nèi)容物–普通蚯蚓糞肥/菊糖型蚯蚓糞肥性質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，為高品質(zhì)蚯蚓糞肥的制備及品質(zhì)調(diào)控提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

赤子愛(ài)勝蚓()種苗由宿遷市啟龍農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，菊糖購(gòu)買于江蘇碧青園海洋生物科技有限公司，牛糞取自奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，新鮮牛糞堆制在陽(yáng)光充足的地方，自然發(fā)酵至無(wú)臭松軟的狀態(tài)，相對(duì)持水量約為70%。腐熟牛糞的基本性質(zhì)如表1所示。

表1 腐熟牛糞的基本性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以采集的腐熟牛糞作為蚯蚓的培養(yǎng)基質(zhì)，設(shè)置純牛糞養(yǎng)殖蚯蚓(EM)和添加菊糖的牛糞養(yǎng)殖蚯蚓(IEM)2個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)。IEM處理的菊糖添加量為25 g(純度高于97% 的白色粉末狀固體)，每個(gè)處理均含牛糞基質(zhì)5 kg，蚯蚓200條左右，單條蚯蚓均重為0.45 g。蚯蚓分組后分別放置于室內(nèi)已裝好培養(yǎng)基質(zhì)的長(zhǎng)410 mm×寬310 mm×高145 mm的長(zhǎng)方形周轉(zhuǎn)箱(內(nèi)置兩塊塑料擋板做隔斷，平均分為3個(gè)重復(fù)小區(qū))內(nèi)，用打孔報(bào)紙遮蓋進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2 d向周轉(zhuǎn)箱內(nèi)噴灑等量的水以維持基質(zhì)濕度，室內(nèi)溫度為26 ～ 28℃，試驗(yàn)周期為40 d。

兩個(gè)處理的培養(yǎng)基質(zhì)經(jīng)蚯蚓取食消解后每隔10 d采樣1次，包括零時(shí)間對(duì)照10月19日(CK)、10月29日(EM10、IEM10)、11月8日(EM20、IEM20)、11月18日(EM30、IEM30)、11月28日(EM40、IEM40)，共采集5次基質(zhì)樣品。每次采樣采用五點(diǎn)取樣法在周轉(zhuǎn)箱內(nèi)隨機(jī)鉆取樣品，采集的樣品混勻后取部分鮮樣測(cè)定功能菌數(shù)量和微生物生物量碳氮含量，剩余樣品一部分放置于–60℃冰箱保存，用于測(cè)定微生物群落結(jié)構(gòu)，另一部分風(fēng)干后過(guò)100目篩網(wǎng)，室溫存儲(chǔ)，用于測(cè)定其基本性質(zhì)和酶活性。EM和IEM兩個(gè)處理的蚯蚓腸道內(nèi)容物分別在11月8日(EG20、IEG20)、11月28日(EG40、IEG40)采集兩次。采樣時(shí)每個(gè)處理隨機(jī)挑選15 ～ 20條蚯蚓，用純水沖洗干凈蚯蚓體表后，于–60℃超低溫冰箱短暫冷凍致死后通過(guò)解剖針和解剖刀取其腸道內(nèi)容物，收集樣品放置于–60℃超低溫冰箱保存用于測(cè)定微生物群落結(jié)構(gòu)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

基質(zhì)基本性質(zhì)測(cè)定：pH和電導(dǎo)率采用水土比5∶1()，用pH計(jì)和電導(dǎo)率儀測(cè)定；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法–稀釋熱法測(cè)定；全氮采用濃硫酸–過(guò)氧化氫消煮，連續(xù)流動(dòng)分析(Seal-AA3)法測(cè)定；全磷、全鉀采用硝酸–鹽酸–高氯酸(1∶3∶2，)消煮，ICP-OES測(cè)定。

基質(zhì)生物學(xué)性質(zhì)測(cè)定：微生物生物量碳氮采用氯仿熏蒸–K2SO4浸提法測(cè)定；脲酶、堿性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶活性采用solarbio?的相應(yīng)酶活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定；功能菌數(shù)量分別采用阿須貝氏培養(yǎng)基、硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基、根瘤菌培養(yǎng)基、有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法測(cè)定，每個(gè)樣本稀釋為10–3、10–4和10–53個(gè)連續(xù)梯度，每一稀釋度2個(gè)平行2個(gè)空白，方法參照國(guó)標(biāo)GB4789.2—2016[14]進(jìn)行，有效活菌數(shù)為上述5種功能菌的菌落總數(shù)。

基質(zhì)及蚯蚓腸道內(nèi)容物總DNA提取與PCR擴(kuò)增以及16S rRNA測(cè)序：采用QIAamp-DNA試劑盒提取樣品的總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，根據(jù)提取DNA的純度和濃度，選擇樣品進(jìn)行后續(xù)測(cè)序。用引物338F: 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806R: 5'-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3' 擴(kuò)增細(xì)菌16S核糖體RNA基因V3 ～ V4區(qū)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序在上海Majorbio Bio-Pharm Technology (Shanghai, China)的Illumina Mised平臺(tái)上進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2013、SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較，顯著性水平為<0.05。使用UPARSE軟件(version 7.0 )根據(jù)97% 的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU(operational taxonomic unit, 操作分類單元)聚類，利用RDP Classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)。利用Mothur1.30.2 進(jìn)行Alpha多樣性計(jì)算，包括群落豐富度指數(shù)(Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù))、群落多樣性(Shannon指數(shù))以及群落系統(tǒng)發(fā)育多樣性(PD指數(shù))。物種Venn圖與群落柱形圖使用R語(yǔ)言(version 3.3.1)工具統(tǒng)計(jì)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚯蚓糞肥基本性質(zhì)變化

腐熟牛糞(CK)經(jīng)過(guò)蚯蚓取食消解后轉(zhuǎn)化為普通蚯蚓糞肥(EM)和菊糖型蚯蚓糞肥(IEM)，兩個(gè)處理(EM、IEM)的pH變化較小，40 d時(shí)分別由初始的8.18降低到7.88和7.96；而電導(dǎo)率、全氮含量急劇降低(10 d)，之后變化趨于穩(wěn)定，養(yǎng)殖40 d時(shí)分別較腐熟牛糞降低39.1% 和42.0%、27.8% 和30%(表2)。EM和IEM處理的有機(jī)質(zhì)含量呈先升后降的趨勢(shì)，10 d內(nèi)顯著增加，之后持續(xù)減少，40 d時(shí)分別較腐熟牛糞顯著降低7.9%和16.6%，IEM處理的有機(jī)質(zhì)分解更徹底，二者差異顯著()；全磷含量總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，40 d時(shí)分別較腐熟牛糞顯著提高8.0% 和10.1%；全鉀含量在10 d內(nèi)有所減少，此后持續(xù)增加，40 d時(shí)IEM較EM處理的全鉀含量提高了13.0%，且IEM處理的全鉀含量在各時(shí)期均顯著高于EM處理。

表2 養(yǎng)殖周期內(nèi)普通蚯蚓糞肥和菊糖型蚯蚓糞肥的基本性質(zhì)動(dòng)態(tài)變化

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同行數(shù)據(jù)不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(<0.05)；下同。

2.2 蚯蚓糞肥生物學(xué)性質(zhì)變化

腐熟牛糞經(jīng)過(guò)蚯蚓取食消解后，EM和IEM兩個(gè)處理的微生物生物量碳氮含量總體呈先升后降的變化趨勢(shì)，20 d時(shí)均達(dá)到峰值(表3)。IEM處理的微生物生物量碳氮含量在10 d時(shí)顯著高于EM處理，微生物生物量碳、氮分別較EM處理提高43.9%、96.1%，40 d時(shí)兩個(gè)處理間已無(wú)顯著性差異。

EM處理的脲酶、堿性磷酸酶和過(guò)氧化氫酶活性在20 ～ 30 d達(dá)到峰值。IEM處理的3種酶活性在10 d時(shí)較EM處理有不同程度的提高，除脲酶活性外，其堿性磷酸酶和過(guò)氧化氫酶活性均在10 d時(shí)達(dá)到峰值，分別較EM處理顯著提高113.0%、61.0%。40 d時(shí)除IEM處理的脲酶活性顯著高于EM處理外，兩個(gè)處理間的堿性磷酸酶與過(guò)氧化氫酶活性差異不顯著。

表3 養(yǎng)殖周期內(nèi)普通蚯蚓糞肥和菊糖型蚯蚓糞肥的微生物生物量碳氮含量及酶活性

2.3 蚯蚓糞肥功能菌數(shù)量的變化

通過(guò)對(duì)蚯蚓糞肥樣品進(jìn)行平板涂布法分離菌落發(fā)現(xiàn)，其5種功能菌(有機(jī)磷細(xì)菌、無(wú)機(jī)磷細(xì)菌、根瘤菌、固氮菌、硅酸鹽細(xì)菌)菌落數(shù)量級(jí)均維持在105cfu/g，有效活菌數(shù)達(dá)到106cfu/g(表4)；IEM處理的有效活菌數(shù)在10 d時(shí)達(dá)到峰值，較EM處理呈倍數(shù)增長(zhǎng)，EM處理的有效活菌數(shù)則在30 d時(shí)達(dá)到峰值，添加菊糖明顯提高了前、中期(10、20 d)蚯蚓糞肥中的有效活菌數(shù)，10、20 d時(shí)IEM處理的有效活菌數(shù)分別較EM處理增加2.22倍和1.70倍。

表4 養(yǎng)殖周期內(nèi)普通蚯蚓糞肥和菊糖型蚯蚓糞肥中的功能菌數(shù)量

2.4 蚯蚓糞肥微生物OTU數(shù)與多樣性指數(shù)的比較

CK樣品中共生成了2 695個(gè)OTU，EM和IEM處理在整個(gè)蚯蚓堆肥過(guò)程中分別含有1 491和1 413個(gè)共有OTU，這部分共有OTU構(gòu)成了蚯蚓糞肥中的核心微生物群(圖1)。EM處理的4個(gè)時(shí)期樣品與CK樣品之間的共有OTU數(shù)量分別為2 221、2 167、2 040、1 771，IEM處理的4個(gè)時(shí)期樣品與CK樣品之間的共有OTU數(shù)量分別為2 202、1 970、1 872、1 812。隨著蚯蚓養(yǎng)殖時(shí)間的增長(zhǎng)，堆肥產(chǎn)物和發(fā)酵牛糞的共有細(xì)菌OTU數(shù)量逐漸減少。

Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果表明，EM和IEM兩個(gè)處理各時(shí)期經(jīng)過(guò)蚯蚓取食消解的基質(zhì)樣品，其Sobs、Shannon、Chao1、PD指數(shù)均高于原始腐熟牛糞(CK)(表5)，且蚯蚓養(yǎng)殖前10 d的微生物多樣性增長(zhǎng)幅度最大，EM和IEM兩個(gè)處理的多樣性水平始終高于原始腐熟牛糞。

(CK：腐熟牛糞；EM：純牛糞養(yǎng)殖蚯蚓處理；IEM：添加菊糖的牛糞養(yǎng)殖蚯蚓處理；下同)

表5 養(yǎng)殖周期內(nèi)普通蚯蚓糞肥和菊糖型蚯蚓糞肥的Alpha多樣性指數(shù)

2.5 蚯蚓糞肥和蚯蚓腸道細(xì)菌群落組成的變化

腐熟牛糞經(jīng)過(guò)蚯蚓的取食消解向蚯蚓糞肥轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，不同樣品的細(xì)菌群落組成相似，且隨著時(shí)間推移，不同門(mén)類的相對(duì)豐度動(dòng)態(tài)變化表現(xiàn)出一定規(guī)律性(圖2)。蚯蚓糞肥中的細(xì)菌群落在門(mén)水平上相對(duì)豐度較高的5個(gè)門(mén)分別是變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobateria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)，占總序列的80% 以上。門(mén)水平上相對(duì)豐度最高的是變形菌門(mén)，在CK樣品中的相對(duì)豐度為32.4%，在EM和IEM兩個(gè)處理中的相對(duì)豐度則隨時(shí)間推移不斷增加，40 d時(shí)較CK樣品分別提高了16.4% 和17.0%；其次為擬桿菌門(mén)，在CK樣品中的相對(duì)豐度為24.4%，在EM和IEM兩個(gè)處理中的相對(duì)豐度則隨時(shí)間推移持續(xù)減少，40 d時(shí)較CK樣品分別降低了28.7% 和34.4%；綠彎菌門(mén)的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)與擬桿菌門(mén)類似，40 d時(shí)EM和IEM兩個(gè)處理的相對(duì)豐度較CK樣品分別降低了58.2% 和57.5%。

放線菌門(mén)在CK樣品中的相對(duì)豐度為8.4%，在EM和IEM兩個(gè)處理中的相對(duì)豐度隨著時(shí)間的推移不斷增加，40 d時(shí)分別較CK樣品提高了115% 和122%。IEM處理的放線菌門(mén)相對(duì)豐度在10、20 d時(shí)分別較EM處理提高了29.3%、40.7%，在養(yǎng)殖蚯蚓的基質(zhì)中添加菊糖顯著提高了前、中期蚯蚓糞肥中放線菌門(mén)的相對(duì)豐度。

放線菌門(mén)的相對(duì)豐度在蚯蚓腸道內(nèi)容物中的占比高于同時(shí)期蚯蚓糞肥，蚯蚓生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)化作用可能促進(jìn)了蚯蚓糞肥中放線菌門(mén)相對(duì)豐度的增長(zhǎng)。擬桿菌門(mén)在蚯蚓腸道內(nèi)容物中的相對(duì)豐度遠(yuǎn)低于蚯蚓糞肥；而厚壁菌門(mén)在前者中的相對(duì)豐度則大幅高于后者，在同時(shí)期，其在IEM處理蚯蚓腸道內(nèi)容物(IEG)中的豐度要低于EM處理蚯蚓腸道內(nèi)容物(EG)。

(EG：EM處理蚯蚓腸道內(nèi)容物；IEG：IEM處理蚯蚓腸道內(nèi)容物)

3 討論

3.1 兩種蚯蚓糞肥的基本性質(zhì)

初始基質(zhì)的pH是影響蚯蚓糞肥pH變化的一個(gè)重要因素。蚯蚓可以在pH 5 ～ 9的范圍內(nèi)存活，有研究推薦牛糞養(yǎng)殖蚯蚓過(guò)程中最理想的pH為7.5 ～ 8.0[15]。本試驗(yàn)中EM和IEM兩個(gè)處理的基質(zhì)pH由初始的8.18分別下降到7.87和7.97，位于理想pH區(qū)間，原因可能是蚯蚓糞肥生產(chǎn)過(guò)程中有機(jī)酸的積累和CO2的產(chǎn)生[16]。電導(dǎo)率(EC)反映了有機(jī)物料的鹽度，經(jīng)過(guò)蚯蚓的取食消解，EM和IEM兩個(gè)處理在40 d時(shí)的基質(zhì)EC值較原始腐熟牛糞顯著下降。蚯蚓糞肥中有機(jī)質(zhì)最終減少的原因是由于蚯蚓和微生物通過(guò)呼吸作用從基質(zhì)中消耗了碳[17]。通常情況下，在蚯蚓取食消解過(guò)程中，有機(jī)物料首先被分解為可溶性的小分子有機(jī)物，之后才是將小分子有機(jī)物繼續(xù)礦化和腐殖化的過(guò)程[18]。這也不難解釋本試驗(yàn)初期有機(jī)質(zhì)含量有稍微的增加、之后才呈逐漸降低的趨勢(shì)。有研究發(fā)現(xiàn)，在蚯蚓糞肥生產(chǎn)過(guò)程中氮含量會(huì)出現(xiàn)下降，除了被蚯蚓與微生物吸收利用，還可能是由于基質(zhì)氨化、反硝化、揮發(fā)、浸出或NH3的釋放造成的[19]。蚯蚓處理牛糞過(guò)程中，磷的釋放是由蚯蚓腸道磷酸酶和溶解磷酸鹽的微生物完成的，這類微生物存在于成熟的蚯蚓糞肥中[20]。初始基質(zhì)中存在的微生物對(duì)最終蚯蚓糞肥中磷含量的增加也起著重要作用[21]。鉀與氮、磷一起對(duì)植物的生長(zhǎng)起著重要的作用，它是植物細(xì)胞分裂和根系發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[22]，蚯蚓腸道菌群通過(guò)產(chǎn)生解鉀酸來(lái)提高鉀素釋放。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，EM和IEM兩個(gè)處理的全氮含量在10 d內(nèi)降幅最大，之后較為穩(wěn)定，除被蚯蚓與微生物吸收消耗外還可能是前期牛糞中的NH3大量揮發(fā)導(dǎo)致的；全磷和全鉀含量顯著提高的主要原因是隨著基質(zhì)降解，CO2、NH3等氣體的放出導(dǎo)致了物料干物質(zhì)量的減少，從而增加了全磷和全鉀在物料中的占比。

3.2 兩種蚯蚓糞肥的生物學(xué)性質(zhì)

蚯蚓糞肥生產(chǎn)過(guò)程是取食牛糞的蚯蚓與基質(zhì)中的微生物相互作用的生物氧化過(guò)程，從而加速有機(jī)質(zhì)的分解并改變牛糞的物理和生化特性。蚯蚓通過(guò)取食、遷移和競(jìng)爭(zhēng)等生命活動(dòng)來(lái)直接或間接影響微生物活性和多樣性[23]，促進(jìn)微生物的代謝和活動(dòng)，從而強(qiáng)化其對(duì)有機(jī)質(zhì)的降解作用[24]。同時(shí)，蚯蚓腸道富含活性微生物和酶，可以與蚯蚓糞肥中的微生物起到協(xié)同作用[25]，這也是蚯蚓糞肥較常規(guī)堆肥對(duì)有機(jī)物料的分解更徹底的原因。本研究結(jié)果顯示，兩種蚯蚓糞肥中的微生物生物量碳氮含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，10 d時(shí)IEM處理的微生物生物量碳氮含量均顯著高于EM處理，前期基質(zhì)內(nèi)豐富的養(yǎng)分資源和蚯蚓活動(dòng)促進(jìn)了微生物的大量繁殖。酶是物質(zhì)代謝的重要參與者，特定酶活性的變化可以反映特定物質(zhì)的代謝速度，也從一定程度上反映了牛糞向蚯蚓糞的分解轉(zhuǎn)化狀態(tài)。本試驗(yàn)中兩種蚯蚓糞肥中的脲酶、堿性磷酸酶和過(guò)氧化氫酶活性在不同時(shí)間階段中均出現(xiàn)過(guò)峰值，且IEM處理的堿性磷酸酶和過(guò)氧化氫酶活性峰值的出現(xiàn)時(shí)間均早于EM處理，表明菊糖的添加促進(jìn)了蚯蚓糞肥微生物活性從而加快其生物學(xué)性質(zhì)的變化。通過(guò)平板涂布法分離兩種蚯蚓糞肥中的菌落，發(fā)現(xiàn)IEM處理的5種功能菌數(shù)量在各時(shí)期均高于EM處理，且前期尤為明顯，菊糖的添加一定程度上提高了蚯蚓糞肥中的有效活菌數(shù)?，F(xiàn)有的研究表明，菊糖在調(diào)節(jié)腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)中起到重要作用[26]。菊糖對(duì)蚯蚓糞肥生物學(xué)性質(zhì)的影響可能有兩個(gè)方面的原因：一方面，菊糖能夠作為碳源被蚯蚓糞肥中的微生物直接利用，為微生物的大量繁殖提供更高的營(yíng)養(yǎng)水平；另一方面，菊糖能夠被蚯蚓取食，在蚯蚓腸道中被微生物間接利用，進(jìn)一步提高蚯蚓糞肥品質(zhì)。

3.3 兩種蚯蚓糞肥及蚯蚓腸道的微生物群落結(jié)構(gòu)

食物和環(huán)境是影響動(dòng)物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素[27-28]。蚯蚓腸道內(nèi)含有豐富的黏液，較高的濕度和穩(wěn)定的pH，是微生物的理想棲息地[29]。放線菌被認(rèn)為是蚯蚓腸道菌群中最占優(yōu)勢(shì)的微生物之一，研究表明，蚯蚓腸道中含有活躍的放線菌，且其中大多數(shù)是鏈霉菌，可通過(guò)釋放幾丁質(zhì)酶和抗生素來(lái)降解植物病原菌，限制病原微生物的生長(zhǎng)[30-32]。蚯蚓糞中的鏈霉菌可對(duì)大多數(shù)真菌病原體產(chǎn)生拮抗作用[33-34]。腸道中的變形菌門(mén)可以發(fā)酵食物成分，幫助宿主消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)宿主體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)和能量代謝[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓腸道中存在大量的放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)等菌群，這與Aira等[36]的研究結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)蚯蚓腸道作用后，蚯蚓糞肥中的放線菌門(mén)豐度得到了提高，說(shuō)明一部分蚯蚓腸道菌群會(huì)伴隨著蚯蚓排泄作用進(jìn)入到糞肥基質(zhì)中，之后在糞肥中也可能會(huì)進(jìn)一步地增殖[37]。

蚯蚓糞肥含有不同性質(zhì)的微生物種群，與嗜熱堆肥相比，這些微生物種群更加多樣化。在蚓糞基質(zhì)中，微生物與蚯蚓活動(dòng)有著密切的聯(lián)系，蚯蚓的生命活動(dòng)促進(jìn)有機(jī)物料進(jìn)行生化降解，而此進(jìn)程又進(jìn)一步提高了微生物的活性。蚯蚓取食消解牛糞后，通過(guò)蚯蚓腸道增加了黏液和酶，提高了其比表面積，以便微生物作用分解[38]。蚯蚓與微生物之間的這種相互關(guān)系對(duì)優(yōu)質(zhì)肥料的生產(chǎn)具有重要作用。本試驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)蚯蚓取食消解產(chǎn)生的兩種蚯蚓糞肥微生物多樣性和功能菌群數(shù)量遠(yuǎn)高于原始腐熟牛糞，且兩種蚯蚓糞肥細(xì)菌群落組成的改變具有明顯的時(shí)間效應(yīng)，優(yōu)勢(shì)微生物的增加或減少具有連續(xù)性。變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在兩種蚯蚓糞肥中屬于優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，且在蚯蚓堆肥過(guò)程中前兩者的相對(duì)豐度持續(xù)增加，而擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度則不斷下降。優(yōu)勢(shì)微生物在牛糞向蚯蚓糞肥的轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著重要作用，擬桿菌門(mén)包含多種具有較強(qiáng)水解能力的細(xì)菌，可水解淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)等[39]。擬桿菌門(mén)的逐步減少說(shuō)明基質(zhì)中可降解的有機(jī)物逐漸達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)；放線菌門(mén)則是難降解有機(jī)物的主要降解者，養(yǎng)殖后期基質(zhì)中豐富的放線菌通常被認(rèn)為是蚯蚓糞肥達(dá)到成熟期的重要指標(biāo)[40]。Aira等[41]及Sampedro和Domínguez[42]報(bào)道了蚯蚓腸道和糞便中的微生物群能夠消化以多糖為代表的小分子有機(jī)物和以纖維素為代表的大分子復(fù)雜有機(jī)物，微生物菌群之間也存較強(qiáng)的相互作用，進(jìn)而促進(jìn)了蚯蚓養(yǎng)殖系統(tǒng)中基質(zhì)的快速分解礦化。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，純牛糞中添加菊糖提高了前、中期(10、20 d)蚯蚓糞肥中放線菌門(mén)的相對(duì)豐度，菊糖作為碳源可能被特定微生物選擇性吸收利用，而關(guān)于菊糖對(duì)蚯蚓糞肥中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

1)牛糞被蚯蚓取食消解后產(chǎn)生的兩種蚯蚓糞肥性質(zhì)較為一致，但各項(xiàng)理化指標(biāo)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)有所不同，最終表現(xiàn)為pH趨于中性，EC顯著下降，氮元素被同化利用，有機(jī)質(zhì)加速分解礦化，磷鉀元素得到不同程度的富集。在蚯蚓堆肥基質(zhì)中添加菊糖提高了有機(jī)質(zhì)的降解效率與鉀的富集。

2)添加菊糖能夠縮短蚯蚓糞肥中過(guò)氧化氫酶和堿性磷酸酶活性峰值的出現(xiàn)時(shí)間，較普通蚯蚓糞肥提前10 ～ 20 d達(dá)到峰值，從而加速有機(jī)物料的分解礦化進(jìn)程，促進(jìn)高品質(zhì)蚯蚓糞肥的形成。

3)蚯蚓的取食消解活動(dòng)為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了優(yōu)良的環(huán)境條件，顯著提高了微生物多樣性，且對(duì)特定的微生物類群豐度具有選擇性調(diào)控作用。添加菊糖提高了蚯蚓消解活動(dòng)產(chǎn)物—— 蚯蚓糞肥的功能菌群數(shù)量和生物活性。本研究明確了菊糖在蚯蚓糞肥生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)揮的益生作用，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蚯蚓糞肥提供了理論依據(jù)。

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Effect of Inulin on Characters of Earthworm Manure and Its Regulation Process

CAO Huixiang, LI Shuai, YANG Min, HUANG Ting, LI Yuan, GAN Quanfeng, XIE Junwei, ZHAO Gengmao*

(College of Resources and Environmental Sciences/Jiangsu Provincial Key Laboratory of Marine Biology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The probiotic effect of inulin on earthworms and the formation process of earthworm manure with high vigor were discussed through the experiment of earthworm composting in order to provide theoretical basis for the construction of ecological agriculture, pastoral mode and the remediation of obstacle soil in tidal shoal. Cattle manure,and inulin were used in this study as materials to explore the dynamic change processes of cattle manure, earthworm intestinal contents, common earthworm manure and inulin type earthworm manure, respectively, by using pure cattle manure breeding earthworm (EM) and inulin added cattle manure breeding earthworm (IEM). The breeding cycle was lasted for 40 days,samples were taken and analyzed every 10 days. The results showed that the basic properties of inulin type earthworm manure and common earthworm manure formed by the decomposed cow manure with or without inulin were similar: pH tended to be neutral, electrical conductivity decreased significantly, nitrogen was absorbed and utilized, organic matter was accelerated to decompose and mineralize, and phosphorus and potassium were further released. However, the addition of inulin improved the degradation efficiency of organic matter and the release of potassium. After 40 days, the organic matter content of earthworm manure in IEM treatment was 9.4% lower than that in EM treatment, while the total potassium content in IEM treatment was 13.0% higher than in EM treatment. The activities of urease, alkaline phosphatase and catalase in EM treatment increased at first and then decreased, and the peak value appeared on 20–30d. However, IEM treatment shortened the time of peak of enzyme activity (except ureaseactivity), alkaline phosphatase and catalase activities reached their peaks at 10 days, and their values were increased by 113.0% and 61.0% respectively compared with EM treatment. After 10 days of breeding, the microbial diversities of common earthworm manure and inulin type earthworm manure increased significantly, and the number of functional bacteria of inulin type earthworm manure increased multiple times. The addition of inulin increased the relative abundance of Actinobacteria in earthworm manure at the early and middle periods (10 and 20 days), and increased by 40.7% compared with EM treatment at 20 days. In conclusion, inulin can regulate the process of earthworm composting and the properties of earthworm manure. The inulin-type earthworm manure obtained after 20 days of vermicomposting has high biological activity and good quality.

Earthworm manure; Inulin; Enzymatic activity; Community structure; Microbial diversity

S154

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.01.008

曹惠翔, 李帥, 楊敏, 等. 菊糖對(duì)蚯蚓糞肥性狀的影響及調(diào)控過(guò)程. 土壤, 2022, 54(1): 55–63.

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(2019YFD0900702, 2020YFD0900703)、國(guó)家自然科學(xué)基金中美聯(lián)合項(xiàng)目(20191J006)和山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2019JZZY020614)資助。

(seawater@njau.edu.cn)

曹惠翔(1996—)，男，山東煙臺(tái)人，碩士研究生，主要從事灘涂生態(tài)學(xué)研究。E-mail:2018103009@njau.edu.cn