細(xì)圓藤醇提物急性毒性研究及抗炎鎮(zhèn)痛有效部位篩選

劉玟君，李金洲，陳子雋，覃春梅，周夢(mèng)潁，陳 勇

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，南寧 530200；2.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 深圳 518100；3.桂林市人民醫(yī)院，廣西 桂林 541002）

細(xì)圓藤［Pericampylus glaucus（Lam.）Merr.］為防已科細(xì)圓藤屬植物，又名為廣藤、車線藤、土藤等，全株均可入藥。其藤部味苦，性涼，有祛風(fēng)鎮(zhèn)靜的功能，民間用來(lái)治療小兒驚風(fēng)、破傷風(fēng)。根部為喉科藥，可止咳，又能治毒蛇咬傷、瘡癤等［1］。近年來(lái)，有學(xué)者研究細(xì)圓藤的化學(xué)成分，分析發(fā)現(xiàn)其含有綠原酸、千金藤啶堿、表木栓醇、蜂蜜酸、棕櫚酸、硬指酸、白樺脂酸及胡蘿卜甙［2，3］。且從細(xì)圓藤中分離出的某種脂肪酸類化合物對(duì)人體慢性髓性白血病K562細(xì)胞增值有一定的抑制作用［4］。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)細(xì)圓藤的研究主要集中于葉子，并發(fā)現(xiàn)葉子具有抗腫瘤、抗鼻咽癌、抗炎、抗HIV、解熱鎮(zhèn)痛等藥理作用［5-8］，但未見(jiàn)報(bào)道細(xì)圓藤的醇提物急性毒性試驗(yàn)。本研究對(duì)細(xì)圓藤的醇提物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，得出細(xì)圓藤的安全范圍，為其臨床用藥提供參考，對(duì)其抗炎鎮(zhèn)痛的有效部位進(jìn)行篩選，也為進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

76電子天平（EL204，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S2，金壇市醫(yī)療儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠）；智能熱板鎮(zhèn)痛儀（成都泰盟軟件有限公司）。

1.2 主要藥材與試劑

細(xì)圓藤藥材采于廣西壯族自治區(qū)欽州縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)陸海琳副教授鑒定為防已科細(xì)圓藤屬植物細(xì)圓藤的地上部分（藤和葉子）。瓊脂（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)731U022）；冰醋酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160606）；醋酸地塞米松片（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)191030201）；羅通定片（四川迪菲特藥業(yè)有限公司，批號(hào)190402）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種（KM）小鼠，體量18～22 g，雌雄兼用，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和每只攝食3 g，除灌胃及觀察時(shí)間外，其余時(shí)間均為動(dòng)物照明。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)圓藤醇提物不同部位的制備

1）細(xì)圓藤醇提物的制備。稱取細(xì)圓藤粗粉2.7 kg，加10倍量75%乙醇，回流提取3次，每次2 h，過(guò)濾，合并濾液。提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無(wú)醇。冷凍干燥得細(xì)圓藤醇提物227.06 g。取細(xì)圓藤醇提物適量，去離子水配成每毫升含2.35 g生藥的溶液，置冰箱備用。

2）細(xì)圓藤不同部位的制備。取細(xì)圓藤乙醇提取物浸膏275 g，用溫水超聲溶解，依次用等倍量的石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取，分別得到石油醚浸膏（9.462 g）、乙酸乙酯部位浸膏（50.319 g）、正丁醇部位浸膏（72.174 g）、水部位浸膏（72.319 g），灌胃前根據(jù)其急毒試驗(yàn)，按照臨床用量的20倍分別用水配制成相同濃度的溶液（膏重/體重）。

1.4.2 半數(shù)致死量（LD50）試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［9］，選取體重18～22 g的SPF級(jí)KM小鼠70只，雌雄各占50%，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，按體重隨機(jī)平均分為空白對(duì)照組、細(xì)圓藤醇提取物高、中、低劑量組。分別以細(xì)圓藤醇提物可給灌胃的最大混懸濃度2.35 g/mL（每毫升含2.35 g生藥）為起始濃度，按1∶10遞減，即細(xì)圓藤醇提取物以2.350 0、0.235 0、0.023 5 g/mL的藥物濃度進(jìn)行灌胃。上述各給藥組均按小鼠最大給藥體積40 mL/kg灌胃1次，空白對(duì)照組給予等體積去離子水灌胃。給藥前禁食不禁水12 h，給藥4 h后正常喂養(yǎng)，連續(xù)觀察14 d。找出各組零致死量Dn和全致死量Dm進(jìn)行LD50值測(cè)定。如果試驗(yàn)無(wú)法測(cè)出細(xì)圓藤水提取物和醇提取物的半數(shù)致死量，則進(jìn)行最大給藥量試驗(yàn)。

1.4.3 最大給藥量試驗(yàn) 取KM小鼠60只，雌雄各占50%，按體重隨機(jī)平均分為空白對(duì)照組、細(xì)圓藤水提取物組和醇提物組。給藥組分別按照細(xì)圓藤水提物和醇提取物可供灌胃的最大混懸濃度2.35 g/mL，最大給藥體積40 mL/kg體重灌胃，空白對(duì)照組按同樣給藥方法用去離子水灌胃。1 d內(nèi)灌胃給藥1次，試驗(yàn)小鼠給藥4 h后，按常規(guī)飼養(yǎng)（每天固定飼料喂養(yǎng)1次），連續(xù)觀察14 d。期間觀察并記錄小鼠飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)、皮毛膚色和大小便等，觀察有無(wú)中毒癥狀及死亡現(xiàn)象出現(xiàn)。第14天時(shí)，處死全部小鼠，解離出心、肝、脾、肺、腎，觀察有無(wú)病變情況，并對(duì)其稱重，計(jì)算其臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體重（g）。

1.4.4 細(xì)圓藤鎮(zhèn)痛活性部位的篩選

1）熱板法。參考文獻(xiàn)［10］，取用KM種小鼠，雌性，體重18～22 g，進(jìn)行熱板試驗(yàn)。將小鼠置于（55±0.5）℃的熱板儀上，記錄各組小鼠足底接觸熱板至出現(xiàn)舔后足（潛伏期）作為痛閾指標(biāo)，凡30 s內(nèi)仍不出現(xiàn)舔足者棄之不用，挑選痛閾在5～30 s內(nèi)的小鼠72只用于試驗(yàn)。將之前篩選痛閾合格的60只KM種小鼠隨機(jī)分為空白組（去離子水）和陽(yáng)性對(duì)照組（羅痛定0.074 g/kg）、細(xì)圓藤石油醚部位（0.235 g/kg）、細(xì)圓藤乙酸乙酯部位（1.240 g/kg）、細(xì)圓藤正丁醇部位（1.784 g/kg）、細(xì)圓藤水部位（1.785 g/kg）共6個(gè)組，灌胃（ig）給藥，每天1次，連續(xù)7 d，末次ig給藥后30、60、90、120 min各重復(fù)測(cè)定舔足潛伏期，記錄痛閾值，比較給藥前后痛閾的變化，痛閾值提高百分率=［（用藥后平均痛閾值-用藥前平均痛閾值）/用藥前平均痛閾值］×100%。

2）小鼠醋酸扭體試驗(yàn)。參考文獻(xiàn)［11］，將72只KM種小鼠隨機(jī)分組，分組同“1.4.4”中的熱板法，每組12只，灌胃（ig）給藥，每天給藥1次，連續(xù)7 d，第7天給藥60 min后腹腔給予0.6%冰醋酸溶液（10 mL/kg），記錄15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)，并按下列公式計(jì)算細(xì)圓藤的鎮(zhèn)痛能力（抑制率）。

1.4.5 瓊脂肉芽致小鼠炎癥試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［12］，取KM小鼠72只，隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為模型組、地塞米松組（50 mg/kg）及細(xì)圓藤不同部位（分組同“1.4.4”中的熱板法）。所有小鼠均在背部皮下注射2%瓊脂，每只0.3 mL，給藥組于第2天開(kāi)始灌胃（ig）給藥，每天1次，連續(xù)7 d，模型組給予等量去離子水，第8天將小鼠脫頸椎處死，剝離瓊脂肉芽塊，并稱濕重，計(jì)算腫脹抑制率，抑制率=［（模型組瓊脂肉芽重量-給藥組瓊脂肉芽重量）/模型組瓊脂肉芽重量］×100%。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 半數(shù)致死量試驗(yàn)結(jié)果

小鼠分別灌服細(xì)圓藤水提取物和醇提取物后連續(xù)觀察14 d，小鼠均未死亡。給藥后的4 h內(nèi)觀察小鼠的呼吸功能、排泄物、精神狀態(tài)及行為狀態(tài)均未見(jiàn)明顯異常，后續(xù)觀察也未見(jiàn)異常。因此，改為測(cè)定小鼠最大耐受量（MTD）來(lái)判斷細(xì)圓藤水提液和醇提物對(duì)小鼠的急性毒性作用，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 細(xì)圓藤醇提物小鼠急性毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.2 最大給藥量試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)毒性癥狀觀察可知，進(jìn)行試驗(yàn)的60只小鼠全部存活，絕大部分小鼠解剖所見(jiàn)：胸腔、腹腔未見(jiàn)異常液體，腸道未見(jiàn)脹氣，心、肝、脾、肺、腎等主要器官形態(tài)質(zhì)地正常、未見(jiàn)顏色改變及其他病理改變，胃黏膜顏色正常，無(wú)出血點(diǎn)。根據(jù)《湖南藥物志》第一卷記載細(xì)圓藤日用量為9～15 g［13］，故以生藥量15 g作為成人（60 kg）的最大口服日用量。按照最大耐受量倍數(shù)公式［14］計(jì)算，細(xì)圓藤醇提物的最大耐受量＞94 g/kg，該藥材臨床常用量在9～15 g，本試驗(yàn)小鼠用量相當(dāng)于成人（60 kg）用量的376倍。且細(xì)圓藤醇提物2組小鼠中雌鼠及雄鼠的心、肝、脾、肺、腎的體重比值及體重增長(zhǎng)與空白組比較均無(wú)顯著差異，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3、表4。

表2 細(xì)圓藤水提物和醇提物的最大給藥量

表3 細(xì)圓藤水提物和醇提物對(duì)小鼠經(jīng)口急性毒性體重結(jié)果

表4 細(xì)圓藤水提物和醇提物對(duì)小鼠經(jīng)口急性毒性臟器系數(shù)結(jié)果

2.3 細(xì)圓藤醇提物不同部位抗炎鎮(zhèn)痛結(jié)果

2.3.1 細(xì)圓藤醇提物不同部位提取部位對(duì)熱板致痛閾值的影響 細(xì)圓藤醇提物不同部位提取物組小鼠的舔足時(shí)間均有所延長(zhǎng)，其中與空白對(duì)照組相比，細(xì)圓藤石油醚部位、水部位在給藥后90、120 min痛閾值顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）；細(xì)圓藤乙酸乙酯部位、正丁醇部位在給藥后120 min痛閾值顯著提高（P＜0.001，P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 細(xì)圓藤醇提物不同部位對(duì)小鼠熱刺激疼痛的影響

2.3.2 細(xì)圓藤醇提物不同提取部位對(duì)小鼠醋酸扭體的影響 細(xì)圓藤醇提物不同部位組均能減輕醋酸引起小鼠疼痛，其中細(xì)圓藤醇提物石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的鎮(zhèn)痛率分別為51.74%、37.63%、32.13%、40.55%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 細(xì)圓藤醇提物不同部位對(duì)小鼠醋酸扭體的影響

2.4 細(xì)圓藤醇提物不同提取部位對(duì)瓊脂肉芽腫的影響

模型組小鼠肉芽增生明顯，細(xì)圓藤醇提物不同部位組均能減輕小鼠肉芽濕重，細(xì)圓藤醇提物石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的抑制率分別為13.74%、21.35%、16.35%、32.27%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 細(xì)圓藤醇提物不同部位對(duì)瓊脂肉芽腫的影響

3 小結(jié)

本研究測(cè)得小鼠一次性口服細(xì)圓藤醇提物的最大耐受量為94 g原生藥/kg，該劑量為臨床擬用劑量（15.0 g/d即0.25 g原生藥/kg）的376倍，提示細(xì)圓藤醇提物臨床用藥是比較安全的，且通過(guò)瓊脂肉芽腫慢性炎癥模型比較細(xì)圓藤不同部位的抗炎效果，結(jié)果表明細(xì)圓藤水部位對(duì)小鼠肉芽的抑制作用最強(qiáng)，其次為乙酸乙酯部位；本研究中采用熱板法和醋酸扭體法篩選細(xì)圓藤鎮(zhèn)痛的有效部位，結(jié)果表明細(xì)圓藤不同提取部位均具有鎮(zhèn)痛效果，鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)為石油醚部位，其次為水部位。細(xì)圓藤抗炎鎮(zhèn)痛活性部位具體是通過(guò)哪種成分發(fā)揮作用及如何發(fā)揮其作用機(jī)制，還有待研究。