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    2010-2019年中國(guó)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) ORF5基因的遺傳進(jìn)化與重組分析

    2022-03-16 02:47:56覃新云劉桂秀呂其壯鄧家華覃婷龍金桃陳旭健

    覃新云 劉桂秀 呂其壯 鄧家華 覃婷 龍金桃 陳旭健

    關(guān)鍵詞: 豬繁殖與呼吸綜合征病毒;ORF5基因;遺傳進(jìn)化分析;重組分析

    中圖分類號(hào): S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 1000-4440(2022)01-0285-04

    Key words: porcine reproductive and respiratory syndrome virus;ORF5 gene;genetic evolutionary analysis;recombination analysis

    豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),俗稱“豬藍(lán)耳病”,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種急性、具有高度傳染性疾病,其主要臨床癥狀表現(xiàn)為持續(xù)高熱、母豬繁殖障礙以及仔豬呼吸困難和高死亡率[1-2]。PRRS最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)的北卡羅來(lái)納州,隨后世界各國(guó)陸續(xù)報(bào)道,中國(guó)于1996年首次報(bào)道該病。2006年出現(xiàn)了由高致病性PRRSV引起的“豬無(wú)名高熱癥”疫情的大面積暴發(fā)和流行,導(dǎo)致豬群高發(fā)病率及高死亡率,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

    PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒,其基因組長(zhǎng)度約14 500 bp,編碼區(qū)至少包括10個(gè)開放閱讀框(ORF)[4]。其中,ORF5基因可以編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5,該蛋白質(zhì)是一種糖基化囊膜蛋白質(zhì),也是PRRSV 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原[5]。研究結(jié)果證實(shí),GP5蛋白是PRRSV中最容易發(fā)生變異的蛋白質(zhì)之一,常被用作評(píng)價(jià)PRRSV病毒是否發(fā)生變異的主要依據(jù)之一,ORF5基因也因此成為序列分析的典型基因,可作為PRRSV基因分型的重要依據(jù),在PRRSV流行性株遺傳變異研究中發(fā)揮重要作用[6]。當(dāng)前在中國(guó)境內(nèi)的PRRSV可分為2個(gè)血清型,即PRRSV2 (以VR-2332毒株為代表)和PRRSV1 (以Lelystadvirus毒株為代表),其中PRRSV2又可分為5個(gè)基因亞型(lineage 1、lineage 3、lineage 5、lineage 8、lineage 9),lineage 1包含NADC30、JL580等毒株;lineage 3包含QYYZ、GM2等近年來(lái)在華南地區(qū)流行的低致病毒株;lineage 5包含PRRSV2代表毒株VR-2332;lineage 8包含以TJ、JXA1、TA-12等高致病毒株和以CH-1a等為代表的經(jīng)典毒株及2011年于新疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)的lineage 9[7-11]。

    為研究中國(guó)近年來(lái)PRRSV流行毒株和變異特征,本研究從GenBank中隨機(jī)取回分離于中國(guó)2010-2019年的877株P(guān)RRSV的ORF5基因序列,并對(duì)其進(jìn)行遺傳進(jìn)化和重組分析,以期為監(jiān)測(cè)中國(guó)豬群中PRRSV的變異情況和防控PRRS提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 PRRSV ORF5基因序列的收集

    從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)取回877株2010-2019年分離于中國(guó)29個(gè)省、市和自治區(qū)的PRRSV的ORF5全基因序列作為分析樣本,同時(shí),收集24株各PRRSV基因亞型的代表毒株和22株鄰國(guó)毒株作為參考毒株。為了更好地呈現(xiàn)分析結(jié)果,在877株毒株中隨機(jī)選取98株代表毒株用于后續(xù)分析。

    1.2 PRRSV ORF5基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

    采用Neighbour-joining (NJ)方法,參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行參數(shù)設(shè)置,利用軟件MEGA v.10.0.5繪制本研究獲得的877株P(guān)RRSV的ORF5基因序列與參考毒株ORF5基因序列的分子進(jìn)化樹,應(yīng)用徐錚等[13]提出的基因分型方法對(duì)毒株進(jìn)行類群劃分并分析其進(jìn)化關(guān)系及各基因亞型在中國(guó)的流行情況。

    1.3 PRRSV ORF5基因序列分析

    利用DNAstar中的MegAlign程序?qū)⑹占腛RF5基因序列與參考毒株的ORF5基因序列進(jìn)行核苷酸同源性分析,并對(duì)ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析,其中以PRRSV2代表毒株VR-2332為氨基酸序列比對(duì)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)毒株[6,8]。

    1.4 PRRSV ORF5基因的重組分析

    為研究所收集毒株之間的基因重組情況,利用軟件RDP4.0中的7種檢測(cè)算法[RDP (R)、MaxChi (M)、BootScan (B)、GeneConv (G)、3seq (T)、SiScan (S)和Chimaera (C)]對(duì)獲得的ORF5基因進(jìn)行重組分析,并參照文獻(xiàn)[14-15]中的判定依據(jù)對(duì)檢測(cè)出的重組事件進(jìn)行界定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PRRSV ORF5基因的核苷酸同源性比對(duì)及遺傳演化分析

    分析結(jié)果顯示,PRRSV ORF5基因序列的長(zhǎng)度為600 bp、603 bp和606 bp,核苷酸同源性為59.6%~100.0%,與國(guó)內(nèi)外46株參考毒株的ORF5基因同源性為59.4%~100.0%。ORF5基因進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,877株P(guān)RRSV毒株中有15株為PRRSV1,862株為PRRSV2毒株。PRRSV2又可進(jìn)一步劃分為多個(gè)不同基因亞型,其中高致病性毒株(亞型1)有517株、經(jīng)典毒株(亞型2)有74株、廣東新變異毒株(亞型3)有62株、JXA-R疫苗樣毒株(亞型4)有29株、NADC30/NADC34樣毒株(亞型5)有115株以及分離于新疆地區(qū)的毒株(亞型9)有6株。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),除上述6種已發(fā)表的基因亞型外,又出現(xiàn)幾個(gè)與之明顯不同的分支,將其分別命名為亞型6(32株)、亞型7(4株)、亞型8(23株)。

    2.2 不同基因亞型PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列對(duì)比

    根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)前PRRSV2 GP5蛋白中存在1個(gè)信號(hào)肽、2個(gè)高變區(qū)(HVR1和HVR2)、3個(gè)跨膜區(qū)(TM1、TM2和TM3)以及5個(gè)表位結(jié)構(gòu)(DE、NE、T1、T2、TM3),另有位于第13位和151位氨基酸位點(diǎn)的2個(gè)毒力相關(guān)位點(diǎn)[6,14-15]。本試驗(yàn)從PRRSV1和PRRSV2毒株1~5基因亞型中隨機(jī)選取代表毒株與本試驗(yàn)獲得的98株代表性分析毒株的GP5蛋白氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明,中國(guó)PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列中普遍存在變異。相比于PRRSV2的代表毒株VR-2332、PRRSV1毒株和亞型7均在第33~34位氨基酸位點(diǎn)處插入2個(gè)氨基酸;相比于PRRSV1的代表毒株,亞型6和亞型7分別在第34位氨基酸位點(diǎn)、58位氨基酸位點(diǎn)處出現(xiàn)1個(gè)氨基酸缺失。而Genotype 1和Subgenotype 7毒株均在33~34位氨基酸位點(diǎn)處插入2個(gè)氨基酸,其余的突變主要表現(xiàn)為各氨基酸位點(diǎn)的點(diǎn)突變。

    2.3 PRRSV ORF5基因的重組分析

    重組分析共檢測(cè)到11個(gè)重組事件,其中,2個(gè)是明確的重組事件,9個(gè)是潛在的重組事件[16-18]。在明確的重組事件中,重組事件2的重組體是毒株MH422060(NCBI登錄號(hào):HLJ/HEB/2016/1031b),其主要親本是毒株KX815428(NCBI登錄號(hào):15SC3),次要親本是毒株MK450614(NCBI登錄號(hào):2018113Zhangshu6),重組區(qū)域大約發(fā)生在ORF5基因序列的270~570 bp。

    3 討論

    近年來(lái),中國(guó)陸續(xù)報(bào)道新的突變毒株,使得中國(guó)的PRRSV流行毒株更加多樣化,變異進(jìn)程加快,防控更加復(fù)雜化[16,19-21]。雖然中國(guó)已采取疫苗免疫的方法進(jìn)行防控,但高致病性毒株減毒活疫苗的無(wú)序使用造成減毒活疫苗病毒的大量傳播,使得PRRS仍然是嚴(yán)重危害中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一[22]。通過(guò)對(duì)PRRSV基因組特征和遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),基于選擇壓力的變化和病毒自身進(jìn)化的需要,PRRSV不斷發(fā)生變異和重組,尤其是在NSP2和GP5? 2個(gè)最易變異的蛋白質(zhì)上面,這給PRRS的防治帶來(lái)了更大困難,因此PRRSV NSP2和ORF5基因也常被用作PRRSV各流行毒株間遺傳進(jìn)化分析的靶基因。

    通過(guò)對(duì)新鑒定亞型進(jìn)行地理區(qū)分分析,我們發(fā)現(xiàn)以KY373214、MF133296等為代表的新亞型6主要在廣西、河南、四川、山東等地被檢出;以KC527830、KX815419為代表的新亞型7主要在廣東、浙江等地被檢出;以MK291407、KP998415為代表的新亞型8主要在中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)被檢出,且新亞型6與PRRSV1,新亞型7與lineage 3,新亞型8與lineage 1親緣關(guān)系較近,表明目前中國(guó)的 PRRSV呈現(xiàn)多基因亞型并存的局面,且基因亞型的種類有進(jìn)一步增多的趨勢(shì)。

    通過(guò)對(duì)PRRSV ORF5基因編碼蛋白質(zhì)的變異分析發(fā)現(xiàn),其存在多處點(diǎn)突變,個(gè)別基因型或基因亞型還存在堿基插入和缺失的情況,該情況可能導(dǎo)致已有的PRRSV疫苗免疫效果不佳或失敗,更可能導(dǎo)致新型變異毒株的出現(xiàn)。此外,與毒力有關(guān)的第13位和第151位氨基酸位點(diǎn)的比對(duì)結(jié)果顯示,這些毒力位點(diǎn)的突變有可能會(huì)導(dǎo)致PRRSV流行毒株毒力的改變,甚至?xí)霈F(xiàn)新的高致病性毒株。

    對(duì)PRRSV ORF5基因的重組分析結(jié)果表明,基于中國(guó)不同地區(qū)的877株P(guān)RRSV ORF5基因共檢測(cè)到11個(gè)可能的重組事件,但是根據(jù)Tomitaka等[18]和Li等 [16]的結(jié)果判斷原則,其中只有2個(gè)是明確的重組事件,雖然重組事件1中重組體MK689083(新亞型6)的主要親本尚不明確,但其次要親本MT036931卻是亞型4,即高致病性PRRSV減毒疫苗毒株或演化毒株。重組事件2中的重組毒株MH422060(亞型2,即經(jīng)典毒株)來(lái)源于KX815428(亞型5,即NADC30-like毒株)和MK450614(亞型1,即高致病性毒株)的重組,這與陳盛楠等[14]和Xie等[19]對(duì)中國(guó)部分地區(qū)PRRSV變異分析的結(jié)果一致,說(shuō)明中國(guó)PRRSV毒株間的重組頻頻發(fā)生是導(dǎo)致新的突變毒株出現(xiàn)的主要原因之一。特別值得注意的是,雖然利用RDP4軟件并未檢測(cè)到PRRSV1與PRRSV2毒株之間存在基因重組的情況,但通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),亞型7的第1~56個(gè)氨基酸與PRRSV2代表株高度同源,其第62~201個(gè)氨基酸卻又與PRRSV1代表株高度同源,提示亞型7可能來(lái)源于PRRSV1與PRRSV2毒株間的基因重組。眾所周知,基因重組可能會(huì)導(dǎo)致病毒的抗原表位發(fā)生變化,從而導(dǎo)致病毒發(fā)生變異,這既是病毒發(fā)生變異產(chǎn)生新的亞群的一種方式,也是疫苗特異性免疫失敗的一個(gè)重要原因[23]。對(duì)重組事件進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),所收集877株P(guān)RRSV ORF5基因的重組情況主要分布在廣東、吉林、河南、浙江、江西、黑龍江、安徽等地,其中在河南檢出最多,其次是山東,提示將來(lái)這些地方的PRRSV防控應(yīng)以重組毒株為主。

    本研究基于877株中國(guó)2010-2019年 PRRSV ORF5基因序列對(duì)中國(guó)近年來(lái)PRRSV流行毒株的變異情況進(jìn)行了分析,本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究中國(guó)PRRSV的遺傳演化,篩選新的疫苗候選株和開發(fā)新型疫苗防控PRRS具有重要意義。

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    (責(zé)任編輯:陳海霞)

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