不同基因型水稻適應(yīng)低磷和水分脅迫的生理調(diào)控特征

田 倉，吳龍龍，張 露，黃 晶，朱練峰，虞軼俊，張均華，武美燕，曹小闖，金千瑜

(1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程中心，湖北 荊州 434025；2.中國水稻研究所水稻生物學(xué)國家重點實驗室，杭州 311400；3.浙江省耕地質(zhì)量與肥料管理總站，杭州 310020)

【研究意義】磷是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素之一，在能量傳遞、信號傳導(dǎo)、光合作用、酶促反應(yīng)、物質(zhì)代謝和抗逆調(diào)控中起著重要的作用[1]。但是，由于土壤中磷的移動性差和擴散速率低等特性，造成磷易被土壤固定、生物有效性低[2]，磷肥當季利用效率只有5%～20%[3]，造成了嚴重資源、環(huán)境和健康壓力。適宜的水分管理能夠促進土壤磷形態(tài)轉(zhuǎn)化及其向根表遷移，并可通過“蒸騰流”提高養(yǎng)分的吸收和運輸效率[2]；而磷營養(yǎng)也能夠通過提高植物對干旱適應(yīng)性及其水分利用效率提高作物產(chǎn)量[5]。同時，水分與磷素在提高作物水分和磷利用效率過程中存在顯著的互作機制?！厩叭搜芯窟M展】水稻在長期的進化過程中，可主動形成了一套高效吸收利用磷素的生理和分子調(diào)控機制，如構(gòu)建良好根系形態(tài)結(jié)構(gòu)以擴大對外部磷的吸收；促進根際環(huán)境有機磷的水解，增強水稻根系對磷的高效吸收利用；改變體內(nèi)各生理反應(yīng)適應(yīng)低磷脅迫，提高自身的磷利用效率[6-7]。生理水平上，低磷和水分脅迫顯著誘導(dǎo)水稻體內(nèi)MDA升高、活性氧代謝失衡，導(dǎo)致細胞膜脂過氧化，抑制水稻的生長發(fā)育[8-9]。水稻可通過提高體內(nèi)脯氨酸含量、增強體內(nèi)抗氧化保護酶(SOD、POD、CAT)活性，來維持細胞膜的穩(wěn)定性和提高植株的抗脅迫能力，減輕逆境脅迫傷害[10]。前人通過對水稻[11]、小麥[12]、玉米[13]、大豆[14]等研究發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫可顯著抑制植株根系、地上部干重及總重；且水分脅迫下，水稻可以通過磷營養(yǎng)改善根系水分，提高根部水勢，增加蒸騰蒸發(fā)量進而促進地下部生長和磷吸收[15]。郭玉春和李永夫等[16-17]研究表明，缺磷條件下水稻可通過顯著提高根系酸性磷酸酶含量促進土壤磷酸鹽溶解，增加土壤有效磷含量?！颈狙芯壳腥朦c】水稻生長發(fā)育受品種遺傳背景和環(huán)境條件的共同影響。前期研究發(fā)現(xiàn)，與粳稻“Nipponbare”(Nip)相比，秈稻“Kasalath”(Kas)根中特有耐缺磷基因Pstol1可通過促進水稻根系生長、提高磷吸收和耐低磷脅迫適應(yīng)能力[33]。當前，人們對不同基因型水稻低磷和水分脅迫響應(yīng)特征仍不清楚，進一步了解水稻適應(yīng)性調(diào)控機制可為在缺磷土壤中篩選磷高效水稻品種提出新的理論依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用水培培養(yǎng)方法，研究不同磷水平和水分脅迫對不同基因型水稻生長發(fā)育、磷吸收利用的影響及其適應(yīng)性生理調(diào)控特征，以期為通過抗逆新品種選育提高集約化稻田水磷資源利用效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

以粳稻“Nipponbare”(Nip)、秈稻“Kasalath”(Kas)和旱稻502(Uplandrice，U502)為供試材料，水稻種子在 30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中催芽48 h，然后置于人工氣候室生長。試驗采用水培培養(yǎng)法，待幼苗長到3葉期(10～14 d)時采用1/2濃度營養(yǎng)液培養(yǎng)，3 d后采用完全營養(yǎng)液培養(yǎng)。營養(yǎng)液組成如下：1.43 mmol/L NH4NO3(2.86 mmol/L N)、0.32 mmol/L KH2PO4、0.34 mmol/L K2SO4、1.00 mmol/L CaCl2、1.70 mmol/L MgSO4、 9.10 μmol/L MnCl2、0.52 μmol/L (NH4)6MoO24、18.00 μmol/L H3BO3、0.15 μmol/L ZnSO4、0.16 μmol/L CuSO4、36.00 μmol/L FeCl3和70.00 μmol/L 檸檬酸。繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，進行不同磷濃度和水分處理，試驗設(shè) 2個磷水平，即低磷(Low P-LP，0.016 mmol/L)、正常磷(Normal P-NP，0.32 mmol/L)，除磷外其它營養(yǎng)元素完全相同；2個水分處理，以10% PEG 6000 模擬中度水分脅迫(PEG，約-0.33 MPa)，以不加10% PEG 6000 營養(yǎng)液為非水分脅迫對照處理。采用1 L塑料桶培養(yǎng)，每桶種5株，以海綿固定水稻幼苗，每處理種植5桶。水稻幼苗置于人工氣候室中，白天/晚上溫度控制28 ℃/23 ℃，光量子通量密度(PPFD)600 μmol/(m2·s)，光照周期 12 h (7:00—19:00)。每3 d更換1次營養(yǎng)液，營養(yǎng)液 pH(5.50±0.05)。每次更換營養(yǎng)液時交換各盆的位置，以消除邊際效應(yīng)。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 水稻干物重 脅迫處理7 d后，各處理隨機選取4株長勢一致的水稻幼苗，分成地下部和地上部，105 ℃殺青30 min，隨后75 ℃烘干至恒重后稱重、粉碎；同時，另外取4株水稻地上、地下部新鮮樣品用以水稻生理指標測定。

1.2.2 植株磷含量和酸性磷酸酶活性 水稻地上部、根系全磷含量采用鉬銻抗比色法測定[18]。葉片和根系酸性磷酸酶活性采用對硝基苯磷酸二鈉法[19]，具體如下：首先稱取 0.10 g鮮樣，加入4 mL醋酸鈉緩沖液 (pH 5.8)研磨提取，離心(12 000 r/min，20 min)，取上清液0.4 mL加入1 mL 0.05 mol/L對硝基磷酸二鈉(p-NPP)30 ℃下黑暗反應(yīng)30 min，然后加入1 mL 2 mol/L NaOH終止反應(yīng)，405 nm處測定吸光值，同時作對硝基苯酚(p-NP)的標準曲線。

1.2.3 水稻生理指標測定 脅迫處理7 d后，水稻丙二醛含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定[20]：稱取0.10 g樣品，加入4 mL Na2HPO4-NaH2PO4磷酸緩沖液(pH 7.8)，離心(4000 r/min，10 min)，取1 mL上清液加入2 mL 0.5% TBA，混合后沸水浴15 min，用酶標儀測定450、532和600 nm處吸光值，按公式C(μmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450計算丙二醛含量。

水稻脯氨酸含量采用磺基水楊酸提取酸性茚三酮顯色法測定[20]：首先稱取0.10 g水稻鮮樣，加入2 mL 3%的磺基水楊酸浸提，吸取1 mL提取液，加入1 mL的冰醋酸和酸性茚三酮，沸水浴30 min，冷卻后加入1 mL甲苯萃取，測定萃取液在520 nm處的吸光度，通過標曲查得脯氨酸含量；花青素含量采用分光光度法測定，稱取0.10 g研磨好的鮮樣，加入l mL甲醇溶液(含1% HCl體積比)，提取12 h后，加入1 mL H2O和2 mL氯仿，混勻，離心(3000 r/min，2 min)，530 nm處測定吸光值，用測得的吸光度值表示花青素的相對含量[18]。

新鮮水稻葉片和根系水勢采用W4P 露點水勢儀進行測定。

1.2.4 抗氧化保護酶活性 過氧化物酶(POD,Peroxidase)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[20]，用pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4磷酸緩沖液研磨、離心(3000 r/min,10 min)，取0.3% H2O21 mL、0.2%愈創(chuàng)木酚0.95 mL、pH 7.0的磷酸緩沖液1 mL，在470 nm處測吸光值。超氧化物歧化酶(SOD,Superoxide dismutase)活性采用氮藍四唑NBT法測定[20]，pH 7.8的Na2HPO4-NaH2PO4磷酸緩沖液研磨、離心(10 000 r/min,20 min)。過氧化氫酶(CAT,Catalase)活性采用紫外分光光度法測定[20]，用pH 7.8的Na2HPO4-NaH2PO4磷酸緩沖液提取、離心(4000 r/min,10 min)，在240 nm處用分光光度計測定吸光值。

1.3 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft EXCEL 2010和SPSS數(shù)據(jù)分析軟件包進行數(shù)據(jù)整理和方差分析，不同處理間顯著性檢驗采用LSD0.05(Least significant difference test)進行比較。采用Origin 8.0進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水分和磷水平處理對不同基因型水稻生物量的影響

如表1所示，不同基因型水稻生物量對水分脅迫、磷水平的響應(yīng)特征不同。與非水分脅迫相比，水分脅迫顯著降低Nip水稻幼苗地上部、根系(正常磷水平除外)、整株生物量以及低磷水平下根冠比。水分脅迫對Kas水稻根系生物量無顯著影響，但顯著降低地上部生物量，進而顯著增加其根冠比。不同的是，水分脅迫對U502水稻幼苗地上部、根系(除低磷水平)和整株生物量均無顯著影響，但水分脅迫顯著提高低磷水平下水稻根冠比。

無論水分脅迫與否，低磷較正常磷水平顯著降低Nip和Kas水稻幼苗地上部和整株生物量，顯著提高Nip和Kas水稻根冠比，且水分脅迫和低磷水平復(fù)合脅迫處理水稻地上部、根系和整株生物量最低。與正常磷水平相比，低磷水平顯著降低U502水稻地上部、根系和整株生物量。

2.2 不同水分和磷水平處理對不同基因型水稻水勢和氧化損傷的影響

如圖1所示，水分脅迫顯著降低Nip、Kas和U502的水稻葉片和根系水勢。無論水分脅迫與否，磷水平對Nip水稻葉片和根系、Kas水稻根系水勢均無顯著影響；但是，Kas水稻葉片水勢在水分脅迫條件下隨磷水平降低而顯著降低。相反，除了非水分脅迫根系外，低磷較正常磷水平均顯著降低了U502水稻葉片和根系水勢。

如圖2所示，水分脅迫顯著提高了Nip和Kas葉片和根系MDA含量，對U502葉片和根系MDA含量無顯著影響。除了非水分脅迫下Kas水稻根系，不論是否水分脅迫，低磷較高磷處理均顯著提高了Nip、U502和Kas水稻根系MDA含量，且LP+PEG處理均顯著高于其他各處理。相反，磷水平對Nip和Kas水稻葉片MDA含量無顯著影響，但顯著增加了Kas水稻葉片MDA含量。

2.3 不同水分和磷水平處理對不同基因型水稻磷含量的影響

如表2所示，與非水分脅迫相比，水分脅迫顯著降低Kas水稻地上部、根系(除了正常磷水平)和整株總磷含量；同時，顯著降低了正常磷水平Nip水稻地上部、根系和整株磷含量，增加了低磷水平下U502水稻根系和整株總磷含量，但對低磷水平Nip水稻、正常磷水平U502水稻地上部和整株磷含量均無顯著影響。正常磷水平下，水分脅迫對Nip和U502水稻地上部和根系磷分配比例無顯著影響，但顯著增加了低磷水平Nip和U502水稻根系磷分配比例；相反，水分脅迫對低磷水平Kas水稻各器官磷分配無顯著影響，但顯著增加正常磷水平Kas水稻根系磷分配比例。

圖2 不同水分和磷水平處理對水稻MDA含量的影響Fig.2 Effects of the different water regimes and phosphorus levels on the MDA contents of rice

表2 不同水分和磷水平處理對水稻磷含量和分配的影響

無論水分脅迫與否，低磷較正常磷水平均顯著降低了Nip、Kas和U502水稻地上部和整株磷含量，但磷水平對不同基因型水稻根系磷含量影響不同。非水分脅迫下，低磷較正常磷處理顯著降低了Nip和U502水稻根系磷含量，水分脅迫下磷水平對其根系磷含量無顯著影響；相反，低磷較正常磷處理顯著降低了水分脅迫下Kas水稻根系磷含量，但對非水分脅迫下根系磷含量無顯著影響。無論水分脅迫與否，低磷較正常磷水平均顯著加了Nip、Kas和U502水稻根系磷分配比例，降低其地上部磷分配比例。3個品種均表現(xiàn)在低磷和水分復(fù)合脅迫下根系磷分配比例最高，葉片磷分配比例最低。

如圖3所示，無論低磷、正常磷水平下，水分脅迫均顯著增加了Nip、Kas和U502水稻葉片酸性磷酸酶活性。非水分脅迫下，低磷較高磷水平顯著增加3個水稻葉片酸性磷酸酶活性；水分脅迫下低磷水平顯著增加了U502葉片酸性磷酸酶活性，但對Nip和Kas水稻無顯著影響。與葉片不同，水分脅迫顯著降低了正常磷水平下Nip和Kas水稻根系酸性磷酸酶活性，低磷水平下Nip、Kas和U502水稻根系酸性磷酸酶活性顯著增加。無論水分脅迫與否，低磷較正常磷處理均顯著增加了Nip、Kas和U502水稻根系酸性磷酸酶活性，且低磷水平下Kas水稻根系酸性磷酸酶活性均明顯高于Nip和U502。

圖3 不同水分和磷水平處理對水稻酸性磷酸酶活性的影響Fig.3 Effects of the different water regimes and phosphorus levels on the activities of acid phosphatase of rice

圖4 不同水分和磷水平處理對水稻脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of the different water regimes and phosphorus levels on the contents of proline of rice

2.4 不同水分和磷水平處理對不同基因型水稻脯氨酸和花青素的影響

如圖4所示，與非水分脅迫相比，水分脅迫顯著增加正常磷水平下Nip、Kas和U502以及低磷水平下Kas水稻葉片脯氨酸含量。與正常磷水平相比，低磷處理顯著增加非水分脅迫下Nip和Kas葉片脯氨酸含量，但對水分脅迫下Nip、Kas和U502葉片脯氨酸均無顯著影響。同時，水分脅迫均顯著增加了Nip、Kas和U502根系脯氨酸含量；且除了非水分脅迫下Nip根系外，低磷較正常磷處理均顯著增加Nip、Kas和U502水稻根系脯氨酸含量。

如圖5所示，水分脅迫顯著增加了Nip和Kas(除正常磷水平)葉片花青素含量；磷水平對非水分脅迫下Nip和Kas(除正常磷水平)葉片花青素無顯著影響，但顯著增加了水分脅迫下Nip水稻葉片花青素。不同的是，水分脅迫對U502水稻葉片花青素含量無顯著影響，但低磷處理葉片花青素含量顯著高于正常磷處理。

圖5 不同水分和磷水平處理對不同基因型水稻花青素含量的影響Fig.5 Effects of the different water regimes and phosphorus levels on the contents of anthocyanin of rice

2.5 不同水分和磷水平處理對不同基因型水稻抗氧化酶活性的影響

如圖6所示，水分脅迫顯著增加了Nip和Kas葉片和根系的SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性，僅顯著增加U502葉片和根系中SOD酶活性。無論水分脅迫與否，低磷較正常磷處理顯著增加了Kas水稻葉片和根系SOD和POD酶活性以及U502水稻葉片和根系SOD、POD和CAT酶活性；低磷較正常磷處理顯著增加了Nip水稻根系SOD、POD和CAT酶活性。同時，水分脅迫條件下，低磷較正常磷處理顯著增加了U502水稻葉片SOD和POD酶活性。

3 討 論

生物量是植物對逆境脅迫的綜合反應(yīng)[21]。本研究結(jié)果表明，不論是否水分脅迫，低磷水平均顯著抑制了Nip、Kas和U502水稻的生長和干物質(zhì)量累積，進一步分析磷水平的高低水稻地上部生物量緊密相關(guān)。前期也有研究指出，低磷脅迫抑制了水稻地上部的生長，導(dǎo)致總生物量降低，水稻根冠比增大[22]。這與本文部分研究結(jié)果基本一致，但不同基因型水稻生長發(fā)育對不同水分、磷水平的響應(yīng)不同，且水分脅迫進一步加劇了低磷對Nip和Kas水稻生長的抑制作用。雖然水分脅迫、低磷均顯著抑制了Kas水稻地上部生物量，但其可通過調(diào)整水稻根系-地上部生物量分配來顯著提高水稻根冠比。有研究發(fā)現(xiàn)低磷脅迫下植物通過增加根系來擴大對磷的吸收，在此過程中植物也可通過NO、H2S和激素等信號分子的調(diào)控作用改變體內(nèi)磷吸收、轉(zhuǎn)運等生理生化反應(yīng)，擴大對外界磷的吸收和提高體內(nèi)(如細胞壁)磷的再利用能力，進而以適應(yīng)低磷脅迫[23]。

圖6 不同水分和磷水平處理對不同基因型水稻抗氧化酶活性的影響Fig.6 Effects of the different water regimes and phosphorus levels on the activities of antioxidant enzymes of rice

雖然水分脅迫對U502的生物量無顯著影響，但顯著提高了低磷水平U502水稻根冠比，后者在促進水分和磷吸收方面具有重要作用，這也是水稻應(yīng)對低磷脅迫的主動適應(yīng)調(diào)控機制之一。不同的是，水分脅迫對低磷或高磷水平下U502水稻地上部、地下部和整株生物量均無顯著影響，這也進一步驗證了前人旱稻較常規(guī)水稻具有較高的抗水分脅迫能力這一結(jié)論[24]。

與水稻生物量變化趨勢一致，低磷較正常磷水平顯著抑制了不同基因型水稻地上部和整株磷含量，但增加了其根系磷分配比例。與Nip和U502水稻相比，低磷水平下Kas水稻具有更大的根系生物量，其主要原因是后者水稻根中存在耐缺磷基因 Pstol1，可使Kas水稻在缺磷土壤中有更大的根系，進而吸收更多的磷[25]。進一步對水稻根系、地上部酸性磷酸酶活性進行分析，發(fā)現(xiàn)低磷脅迫顯著增加了水稻葉片酸性磷酸酶活性，從而促進體內(nèi)有機磷轉(zhuǎn)化為無機磷供生長循環(huán)利用[26]。因此低磷脅迫下不同基因型水稻根和葉片酸性磷酸酶活性增強、根系生物量和磷分配比例增加等調(diào)控策略對緩解因自身磷供應(yīng)不足造成的不利影響均有積極的作用。無論低磷、高磷，水分脅迫均顯著降低了Nip和Kas水稻地上部和整株磷含量，且低磷水平下水分脅迫顯著提高了Nip和U502水稻根系磷含量及其磷分配比例，分析這可能與水分脅迫對根系生物量抑制作用導(dǎo)致的磷濃度“濃縮效應(yīng)”有關(guān)。同時，水分脅迫均顯著提高了Nip和Kas水稻葉片和低磷水平下根系酸性磷酸酶活性，但降低了正常磷水平下根系酸性磷酸酶活性，這與胡文濤等[18]的研究結(jié)果一致。

生理水平上，水分和低磷脅迫能通過擾亂光合作用電子傳遞誘導(dǎo)產(chǎn)生對細胞有害的活性氧累積(ROS)，造成質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化和氧化脅迫[27]。相應(yīng)地，植物本身建立一套由酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)組成的防御體系，以維持體內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài)平衡[28]，進而主動適應(yīng)逆境脅迫。本試驗中，水分脅迫顯著降低了Nip和Kas水稻根系和葉片水勢，并提高了MDA和脯氨酸含量水平；相反，水分脅迫雖然也顯著降低U502水稻葉片和根系水勢，但對MDA含量無顯著影響。這可能與U502作為旱稻具有較高的抗水分脅迫能力，其生物膜受損程度低；U502水稻體內(nèi)較高水平的抗?jié)B透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如脯氨酸和花青素，也能一定程度提高其抗逆能力[29-30]。有研究表明，逆境脅迫過程中植物葉片累積的花青素可通過降低葉片光抑制，增強光合作用和抗氧化能力增強其逆境適應(yīng)能力[31]。另一方面，除滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外，植物還需要相互協(xié)調(diào)體內(nèi)抗氧化酶防御系統(tǒng)減少逆境脅迫造成的氧化損傷，如SOD、POD、CAT等[32]。水分、低磷脅迫可導(dǎo)致作物體內(nèi)ROS活性增大，伴隨著水分脅迫下Nip和Kas水稻MDA含量升高，其體內(nèi) POD、SOD和CAT酶活性顯著升高，可有效抑制膜內(nèi)不飽和脂肪酸酸分解產(chǎn)物MDA的累積，這是植物主動適應(yīng)外界環(huán)境脅迫時啟動的應(yīng)激反應(yīng)。本研究中，U502水稻葉片和根系受水分和低磷脅迫影響較小，因此其CAT、POD酶活性沒有顯著性變化。

4 結(jié) 論

低磷水平均顯著抑制了不同基因型水稻(Nip、Kas和U502)生長和干物質(zhì)量累積，且水分脅迫進一步加劇了低磷對Nip和Kas水稻生長的抑制作用；但是，水分脅迫對U502水稻生物量無顯著影響。不同基因型水稻對低磷和水分脅迫的生理響應(yīng)特征和適應(yīng)性調(diào)控機制不同：低磷脅迫下Nip、U502和Kas水稻根系和葉片酸性磷酸酶活性顯著提高，Nip和U502水稻可通過增加根系磷含量和磷分配比例增強其低磷脅迫適應(yīng)能力；而Kas水稻可通過提高其根系生物量提高其磷吸收利用能力。同時，不同基因型水稻均可通過提高根系和葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如脯氨酸、花青素)、抗氧化酶(如SOD、POD和CAT)活性提高其抗水分脅迫能力。