HPLC法測定復(fù)元膠囊中五味子醇甲的含量*

周鳳盈，王殿奎，耿春輝，孫 琛，王夏青

(衡水市綜合檢驗(yàn)檢測中心，河北 衡水 053000)

復(fù)元膠囊是由五味子、人參、黃芪、熟地黃、山茱萸等二十一味中藥制成，該藥具有健脾補(bǔ)腎，益氣活血，祛濕醒腦等功效。臨床上主要治療腦供血不足、腦轉(zhuǎn)耳鳴，癡呆等癥。癡呆又稱阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)，目前，美國已將AD納入無法預(yù)防、無法治愈的十大死亡病種之一[1]。該藥經(jīng)多年應(yīng)用于臨床，療效確切[2-3]。五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí),具有補(bǔ)腎養(yǎng)心、益氣生津、收斂固澀等功效。五味子醇甲(C24H32O7)是從五味子的干燥成熟果實(shí)中提取出的一類木脂素類，據(jù)現(xiàn)代藥物學(xué)分析研究發(fā)現(xiàn)五味子中所含的化學(xué)成分主要有木脂素類，也是發(fā)揮五味子多種功效的有效成分[4]，五味子醇甲作為中藥五味子的主要活性成分之一，在各個系統(tǒng)具有廣泛的藥理作用，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用最為顯著，對神經(jīng)退行性疾病AD 具有潛在的預(yù)防和治療作用[5]，《中國藥典2020年版一部》[6]將五味子醇甲(C24H32O7)作為五味子的定量指標(biāo)。復(fù)元膠囊目前的標(biāo)準(zhǔn)僅對何首烏、丹參、冰片進(jìn)行定性鑒別，而無定量方法，不能有效地控制藥品質(zhì)量。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定采用高效液相色譜(HPLC)法對復(fù)元膠囊中五味子活性成分五味子醇甲(C24H32O7)的含量進(jìn)行分析。此方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，操作簡便，可作為復(fù)元膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Waters e2695高效液相色譜儀(檢測器：2489紫外檢測器)；XS205DU電子天平 梅特勒-托利多科技(中國)有限公司 精度：0.01 mg；KQ-300VDE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試 藥

甲醇(色譜純)，默克股份兩合公司；其他試劑均為分析純；水為純化水；五味子醇甲對照品(批號：110857-201815 純度：99.7%)，中國食品藥品檢定研究院；復(fù)元膠囊,由河北省衡水市中醫(yī)院制劑室(批號分別為20220309、20220507、20220802，規(guī)格：0.3 g)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SunFire C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測器型號：Waters 2489；流動相：甲醇-水(65∶35)，檢測波長為250 nm；流速: 1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL，按上述色譜條件照《中國藥典2020年版四部》[7](通則0512)高效液相色譜法進(jìn)行測定，理論板數(shù)按五味子醇甲峰計均高于3000；五味子醇甲峰與其前后相鄰峰的分離度均大于1.5。

2.2 對照品貯備液的制備

精密稱取五味子醇甲對照品適量，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含0.4096 mg的對照品貯備液。

2.3 對照品溶液的制備

精密量取2.2項下對照品貯備液5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻備用。

2.4 供試品溶液的制備

取供試品內(nèi)容物約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再次稱定，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.5 陰性對照溶液制備

按復(fù)元膠囊的處方比例和工藝手法制成不含五味子的陰性樣品，按2.4項下的方法制成陰性對照溶液。

2.6 檢測限與定量限

精密量取2.3項下對照品溶液，用甲醇稀釋至濃度依次由高到低的溶液，將對照品各色譜峰測出的信號與空白樣品測出的信號比較，以測得五味子醇甲(C24H32O7)的檢測限(S/N=3)和定量限(S/N=10)，結(jié)果見表1。

2.7 線性關(guān)系的考查

精密量取2.2項下對照品貯備液各1，2.5，5，7.5，10 mL，分別置100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；按2.1項下的色譜條件測定，進(jìn)樣量10 μL；對照品溶液濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計算，得回歸方程。結(jié)果表明：五味子醇甲(C24H32O7)在4.096～40.96 μg/mL線性范圍內(nèi)，所測對照品溶液的濃度與被測組分峰面積均存在良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系、檢測限及定量限測定結(jié)果Table 1 Linear relationship, detection limit and quantitative limit determination results

2.8 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.3項下對照品溶液10 μL，按2.1項下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積值分別為2119341、2127342、2116523、2116971、2119798、2115639，平均值為 2119269，RSD為0.2%(n=6)。結(jié)果表明儀器具有良好的精密度。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品(批號：20220309)，照2.4項下供試品溶液制備方法配制6份供試品溶液，按2.1項下的色譜條件測定，以外標(biāo)法計算五味子醇甲(C24H32O7)的含量分別為0.2049 mg/g、0.2037 mg/g、0.2057 mg/g、0.2043 mg/g、0.2061 mg/g、0.2044 mg/g，平均含量為0.2048 mg/g，RSD為0.4%(n=6)。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取2.4項下供試品溶液(批號：20220309)10 μL，分別在0、3、6、9、12、24 h測定峰面積值的變化，結(jié)果峰面積值分別為2118254、2117623、2118598、2117835、2118046、2118919，平均值為2119879，RSD為0.2%(n=6)。結(jié)果表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知五味子醇甲(C24H32O7)含量的供試品(批號：20220309)內(nèi)容物6份，每份稱重約為2.5 g，分別精密加入2.2項下的對照品貯備液1250 μL，照 2.4項下的方法制備供試品溶液，按2.1項下的色譜條件測定，計算平均回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of sample recovery test

2.12 樣品的測定

表3 五味子醇甲(C24H32O7)的含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of Schizandrin A(C24H32O7)

取1.2項下三批樣品按2.4項下的方法制成供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，精密量取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中記錄峰面積，按外標(biāo)法計算五味子醇甲(C24H32O7)的含量，測定結(jié)果見表3。

3 討 論

3.1 專屬性

分別取2.3、2.4、2.5項下的溶液，照2.1項下的色譜條件測定，對照品主峰與供試品相應(yīng)位置峰的保留時間分別為22.257 min、22.479 min，陰性對照溶液在相應(yīng)位置無雜質(zhì)峰干擾，供試品主峰能達(dá)到很好的分離，結(jié)果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

3.2 系統(tǒng)適用性

色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復(fù)性五個參數(shù)[7]，要使上述參數(shù)均達(dá)到規(guī)定的要求，色譜條件的選擇尤為重要。在色譜條件中合適的流動相組成及比例是色譜條件的重要因素，在實(shí)驗(yàn)中參照《中國藥典 2020 版一部》[6]及參考文獻(xiàn)測定方法[8-11]，采用下列不同流動相進(jìn)行洗脫：甲醇-水(78∶22)、甲醇-水(55∶45)、甲醇-水(65∶35)、乙腈:水(34∶66)及乙腈：0.1%磷酸(34∶66)，對比了使用上述流動相進(jìn)行洗脫的分離情況，以理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復(fù)性等參數(shù)進(jìn)行考察，優(yōu)化選擇以甲醇-水(65∶35)進(jìn)行洗脫，能達(dá)到有效分離，被測成分峰形好，分離效果最佳。

3.3 供試品溶液制備方法選擇

參照《中國藥典 2020 版一部》[6]及參考文獻(xiàn)測定方法[9-12]，供試品制備時取同一供試品分別以50%甲醇、70%甲醇、甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯作為提取溶劑，超聲提取30 min后，照2.1項下的色譜條件進(jìn)行測定，測得復(fù)元膠囊中的五味子醇甲(C24H32O7)的含量分別為0.1439 mg/g、0.1832 mg/g、0.2048 mg/g、0.1647 mg/g、0.1739 mg/g，供試品中五味子醇甲(C24H32O7)含量測定結(jié)果最高的提取溶劑是甲醇，由此確定甲醇為提取溶劑；同時考察了不同的超聲時間對提取效率的影響，分別對同一供試品超聲提取20 min、30 min、40 min及50 min，照2.1項下的色譜條件進(jìn)行測定，測得復(fù)元膠囊中的五味子醇甲(C24H32O7)的含量分別為0.1559 mg/g、0.2048 mg/g、0.2046 mg/g和0.2049 mg/g，結(jié)果表明，供試品超聲提取30 min，五味子醇甲(C24H32O7)可被提取完全。

3.4 耐用性試驗(yàn)

耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度[7]。根據(jù)《中國藥典》2020年版四部[7](通則9101)的要求，本試驗(yàn)主要考察不同品牌色譜柱、柱溫、流動相的組成等變動因素對測定結(jié)果的影響。

3.4.1 色譜柱的考察

取同一供試品溶液，按照2.1項下色譜條件，采用不同品牌的色譜柱Zafex JXC-18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters SunFire C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)測定供試品中五味子醇甲(C24H32O7)的含量，結(jié)果見表4。

表4 不同色譜柱測得五味子醇甲(C24H32O7)的含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of Schisandrin A (C24H32O7) content measured by different chromatographic columns

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同品牌的色譜柱對測定五味子醇甲(C24H32O7)的含量沒有影響。

3.4.2 柱溫的考察

表5 不同色譜柱溫度測得五味子醇甲(C24H32O7)的含量測定結(jié)果Table 5 Determination results of Schizandrin A (C24H32O7) at different chromatographic column temperatures

取同一供試品溶液，采用Waters SunFire C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，按照2.1項下的色譜條件，分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃條件下測定供試品中五味子醇甲(C24H32O7)的含量，結(jié)果見表5。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在25～40 ℃范圍內(nèi)可準(zhǔn)確測定五味子醇甲(C24H32O7)的含量。

3.4.3 流動相比例的考察

取同一供試品溶液，分別選擇甲醇-水(65∶35)、甲醇-水(64∶36)、甲醇-水(67∶33)三種比例流動相，按2.1項下的色譜條件測得五味子醇甲(C24H32O7)的含量分別為0.2048 mg/g、0.2039 mg/g 、0.2050 mg/g，平均含量為0.2046 mg/g，RSD為0.3%(n=3)。

本實(shí)驗(yàn)通過對不同品牌色譜柱、柱溫、流動相的組成比例的考察，表明在色譜條件有微小變化時，供試品中五味子醇甲(C24H32O7)的含量測定結(jié)果無明顯變化，測定結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)方法耐用性良好。

4 結(jié) 論

本文通過大量的試驗(yàn)，采用高效液相色譜(HPLC)法定量測定五味子主要成分五味子醇甲(C24H32O7)的含量，通過方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明此檢驗(yàn)方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好、耐受性良好，建立復(fù)元膠囊中五味子醇甲的含量測定方法，可以有效控制復(fù)元膠囊的質(zhì)量，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供依據(jù)。