新城疫流行病學(xué)與新型疫苗研究進(jìn)展

曾建平 惠安縣凈峰鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 福建惠安 362142

1 新城疫簡(jiǎn)述

新城疫（Newcastle disease，ND）的病原是副黏病毒科新城疫樣病毒屬（Avulavirus）的禽副黏病毒I型（APMV-1），是在全球野生以及家養(yǎng)禽類中很嚴(yán)重的傳染性疫病，特別是對(duì)雞發(fā)病率高、病死率高，給養(yǎng)雞場(chǎng)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。盡管采用了廣泛的疫苗接種防范方法，ND仍然對(duì)全球家禽業(yè)構(gòu)成巨大威脅。并且ND被OIE列為必須通報(bào)的動(dòng)物疾病，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為一類動(dòng)物疫病，是《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020）》確定的優(yōu)先防治病種及種禽場(chǎng)凈化病種之一[1-3]。

2 新城疫病毒的特征

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是近似球形的病毒粒子，直徑一般為100～400 nm。病毒囊膜表面覆蓋有纖突，包膜為雙層結(jié)構(gòu)膜，是由宿主細(xì)胞的脂類與病毒糖蛋白結(jié)合衍生而來(lái)的。NDV為單股負(fù)鏈RNA病毒，可編碼6種病毒特異性結(jié)構(gòu)蛋白，依次為3′-Leader-NP-P-M-F-HN-L-5′，全長(zhǎng)約為15 kb[4]，其中F蛋白與NDV的致病性密切相關(guān)，是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行該病毒遺傳變異分析及分子流行病學(xué)調(diào)查的一個(gè)重要依據(jù)。就禽而言，NDV侵染后，會(huì)導(dǎo)致胸腺和法氏囊淋巴細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和死亡，從而淋巴細(xì)胞缺失，抑制了體液免疫和細(xì)胞免疫。研究發(fā)現(xiàn)，NDV對(duì)法氏囊的破壞會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞喪失產(chǎn)生IgG的能力，從而引起免疫抑制[5-7]。同時(shí)，NDV會(huì)與其他免疫抑制性病毒共感染，從而引起嚴(yán)重的免疫抑制，造成免疫水平低下，抗體水平不高，進(jìn)而給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大損失。

3 新城疫流行病學(xué)

新城疫已在全球范圍內(nèi)暴發(fā)，主要集中在亞洲許多國(guó)家以及中東和非洲等[8]。新城疫于1926年在印度尼西亞爪哇島首次被發(fā)現(xiàn)[9]，而我國(guó)是在1946年首次檢測(cè)到新城疫病毒[2]，主要是由于從國(guó)外引進(jìn)新品種雞時(shí)傳入的。目前該病己呈世界性分布[10]，近20年持續(xù)發(fā)展，宿主范圍仍在不斷擴(kuò)大，幾乎蔓延到所有的禽類和鳥(niǎo)類，如鴿、鵪鶉、鴕鳥(niǎo)、雞、鴨、鵝等，甚至在部分較為原始的農(nóng)村散養(yǎng)戶也可分離到NDV[11-14]。

新城疫是由禽副黏病毒I型（APMV-1）引起的，APMV-1病毒株可分成兩類（I類和II類），并進(jìn)一步分類為基于遺傳差異的基因型。I類病毒通常存在于野生水禽中，并且具有低毒力；II類病毒在遺傳和表型上更多樣化，并且具有更廣泛的毒力[15]。II類病毒最初分為15種基因型，然而，自2012年以來(lái)又增加了4種基因型[16-18]?；蛐虸I、III、IV、V的病毒導(dǎo)致了20世紀(jì)20年代至60年代的第一次及第二次人畜共患病。來(lái)自基因型III、IV、Ⅸ和Ⅹ的病毒與基因型Ⅰ和基因型Ⅱ的病毒相關(guān)，但只在世界有限的地區(qū)傳播?；蛐蚔、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和XI出現(xiàn)于20世紀(jì)60年代之后，被認(rèn)為是“晚期”基因型[19]。目前，來(lái)自基因型VII的病毒尤其令人擔(dān)憂，因?yàn)橐恍┎《驹诮臃N疫苗的家禽中表現(xiàn)出較高的死亡率。20世紀(jì)80～90年代分離到的NDV毒株則以基因型VII為主，這也是在我國(guó)首次分離到的VII型新城疫病毒，至今仍然是在我國(guó)禽類中流行的優(yōu)勢(shì)基因型[20]。基因型XIV包含2006-2008年在西非和中非分離獲得的劇毒vNDV。基因型XV[17]是從中國(guó)的雞和鵝中分離獲得的毒株。有證據(jù)表明，自1926年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)vNDV以來(lái)，來(lái)自多種基因型的vNDV毒株在不同地點(diǎn)和不同宿主中同時(shí)進(jìn)化一直在繼續(xù)[15]。

近幾年有較多學(xué)者發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多臨床案例都呈現(xiàn)非典型性感染，且常與其他病毒或細(xì)菌呈現(xiàn)共感染，如與大腸桿菌[21]、雞傳染性貧血病毒（CIAV）[22]、馬立克氏病病毒（MDV）[23]、傳染性法氏囊病病毒（IBDV）共感染[24]等，從研究結(jié)果來(lái)看，NDV在雞群中仍廣泛存在，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害是非常嚴(yán)重的。

4 新城疫診斷技術(shù)

近年來(lái)，新城疫已不再表現(xiàn)典型的臨床癥狀，僅憑患雞的臨床癥狀很難作出準(zhǔn)確的判斷。所以，應(yīng)借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)來(lái)進(jìn)行確診，如通過(guò)病毒分離和鑒定、ELISA試驗(yàn)、免疫熒光、瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)及血清學(xué)診斷等方法來(lái)判定。然而，這些方法通常速度較慢，需要配備有生物安全防護(hù)設(shè)施的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。在發(fā)展中國(guó)家，ND診斷中最常用的分子檢測(cè)法是RT-PCR，具有較高的靈敏度。qPCR檢測(cè)通常被用于直接從臨床樣本中進(jìn)行NDV篩查和病理分型的標(biāo)準(zhǔn)方法[25-26]。Pham等[27]開(kāi)發(fā)了一種基于LAMP的檢測(cè)方法，用于直接從臨床樣本中檢測(cè)NDV，它操作更簡(jiǎn)單且成本低廉。微陣列雜交技術(shù)、生物傳感器診斷及高通量測(cè)序技術(shù)等尖端技術(shù)的出現(xiàn)，可以同時(shí)監(jiān)測(cè)、檢測(cè)和表征數(shù)百至數(shù)千個(gè)目標(biāo)，而不會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度和特異性[28-29]。

5 新型疫苗

盡管現(xiàn)有疫苗對(duì)任何NDV毒株感染可在一定程度上有減輕臨床癥狀、降低病死率的保護(hù)作用，但免疫疫苗后并不能阻止強(qiáng)毒株的散播，這使得NDV強(qiáng)毒株持續(xù)存在。因此，必須極其謹(jǐn)慎地使用減毒活疫苗，需要最先進(jìn)的疫苗來(lái)解決這些弱點(diǎn)。

5.1 疫苗種類

5.1.1 DNA疫苗 當(dāng)DNA疫苗中的重組質(zhì)粒被應(yīng)用到動(dòng)物宿主中時(shí)，克隆的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。研究證明，用殼聚糖包裹的編碼NDV F基因的DNA疫苗對(duì)SPF雞進(jìn)行免疫，雞的黏膜、體液和細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)增強(qiáng)[30]。因此，DNA疫苗是應(yīng)對(duì)當(dāng)前新城疫挑戰(zhàn)的安全替代平臺(tái)，該類疫苗的主要優(yōu)點(diǎn)是其安全性高及誘導(dǎo)CD4+和CD8+免疫反應(yīng)的能力。但是DNA疫苗也有其缺點(diǎn)，包括免疫原性差、生產(chǎn)成本高和不適合大規(guī)模給藥等，更重要的是，DNA疫苗在沒(méi)有任何遞送載體的情況下給藥時(shí)，很容易被核酸酶降解。

5.1.2 重組病毒載體疫苗 用于對(duì)抗獸醫(yī)和醫(yī)學(xué)上重要病原體最有希望的策略之一是使用重組病毒載體疫苗。家禽中最常見(jiàn)的載體是痘苗病毒、雞痘病毒和火雞皰疹病毒[31-32]，它們具有高度免疫原性，能夠通過(guò)TLR激活誘導(dǎo)強(qiáng)炎癥性先天免疫反應(yīng)，并且可以更容易地用雞胚成纖維細(xì)胞大規(guī)模繁殖。因此，它們經(jīng)常被用作對(duì)抗癌癥和許多其他傳染病的基因遞送工具。然而，該類載體也有局限性，對(duì)該載體已有免疫敏感性時(shí)不適用。

5.1.3 病毒樣顆粒疫苗（VLPs）VLPs在形態(tài)上與病毒非常相似，能夠引發(fā)強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，這使它們成為高度安全的疫苗平臺(tái)。但是，大批量生產(chǎn)VLPs仍是現(xiàn)有的難題。此外，由于VLPs不能在接種疫苗的宿主中復(fù)制，在免疫時(shí)需要大量的VLPs與佐劑一起給藥，以達(dá)到免疫效果[33]。盡管面臨許多挑戰(zhàn)，VLPs仍然是控制NDV最有希望的安全疫苗平臺(tái)。

5.2 新城疫病毒作為疫苗載體應(yīng)用 利用反向遺傳學(xué)系統(tǒng)對(duì)新城疫病毒基因組進(jìn)行操作，不僅可以研究新城疫病毒的分子生物學(xué)和致病機(jī)理，還可以開(kāi)發(fā)新城疫病毒作為人和動(dòng)物疾病的疫苗載體。新城疫病毒載體與其他復(fù)制型病毒載體相比有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，新城疫病毒只編碼7種蛋白質(zhì)，載體蛋白與表達(dá)的外源抗原之間的免疫反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)較?。恍鲁且卟《驹诩?xì)胞質(zhì)中復(fù)制，不會(huì)持續(xù)感染；新城疫病毒具有便于基因操作的模塊化基因組；新城疫病毒通過(guò)鼻腔途徑感染，可誘導(dǎo)黏膜和全身免疫反應(yīng)；最后，由于NDV毒株種類繁多，可作為疫苗載體，新城疫病毒載體疫苗也可用作區(qū)分“感染動(dòng)物和接種疫苗的動(dòng)物”（DIVA）疫苗。

作為二價(jià)疫苗，NDV毒株LaSota首次用于表達(dá)傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的宿主保護(hù)性免疫原VP2蛋白[34]，通過(guò)用高毒力的NDV毒株德州GB或強(qiáng)毒力的IBDV變異毒株攻擊接種的雞來(lái)評(píng)估，免疫誘導(dǎo)針對(duì)NDV和IBDV的更高水平的抗體反應(yīng)，并提供針對(duì)這兩種病毒的完全保護(hù)。結(jié)果表明，重組NDV可用作其他禽類病原體的疫苗載體。

NDV作為疫苗載體用于人類的潛力，首先是在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中確定的。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)插入人類副流感病毒3型（HPIV3）的HN蛋白作為保護(hù)性抗原，并在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中評(píng)估兩個(gè)NDV株LaSota和BC作為疫苗載體[35]，是首次證明NDV載體疫苗在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中有效性的研究。

Nakaya等[36]研究發(fā)現(xiàn)重組NDV毒株B1作為人類有效疫苗載體的潛力。體外生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和雞胚致病性試驗(yàn)表明重組NDV減毒。此外，通過(guò)靜脈途徑免疫的小鼠完全不受致命劑量流感病毒的影響，表明NDV可能是一種安全有效的疫苗載體，可用于哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類物種。

NDV被評(píng)估為嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒（SARS-CoV）的疫苗載體[37]，該研究構(gòu)建了兩種NDV載體即介晶毒株BC（NDV-BC）和慢基因毒株LaSota，其中F蛋白裂解序列被修改為毒株BC（NDV-VF）。這些NDV載體被設(shè)計(jì)成可以表達(dá)SARS-CoV刺突S糖蛋白，即主要的保護(hù)性抗原，證明NDV作為SARS-CoV局部呼吸道疫苗載體的安全性和保護(hù)效力。

5.3 NDV的佐劑效應(yīng)NDV是宿主免疫反應(yīng)的強(qiáng)刺激因子，從而提供佐劑效應(yīng)。呼吸道合胞病毒（RSV）是嬰幼兒和老年人嚴(yán)重下呼吸道疾病的主要原因[38]。使用NDV毒株B1表達(dá)呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白，NDV作為病毒載體，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的干擾素（IFN）-α/β反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，與之前感染過(guò)呼吸道合胞病毒的動(dòng)物相比，攜帶NDV的BALB/c小鼠體內(nèi)出現(xiàn)的CD8+記憶性T細(xì)胞數(shù)量更多。因此，疫苗病毒提供了針對(duì)呼吸道合胞病毒挑戰(zhàn)的保護(hù)。該項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了NDV載體通過(guò)有效的干擾素誘導(dǎo)介導(dǎo)的佐劑效應(yīng)。

6 結(jié) 語(yǔ)

隨著養(yǎng)殖業(yè)的集約化發(fā)展，國(guó)內(nèi)近幾年的養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，從而擴(kuò)大了NDV的傳播范圍，與此同時(shí)，NDV的免疫原性也逐步發(fā)生變化，出現(xiàn)了較多強(qiáng)毒株。盡管采用廣泛的疫苗接種方法，新城疫（ND）仍然對(duì)全球家禽業(yè)存在永久威脅。NDV在臨床上常與其他細(xì)菌或病毒共感染，為臨床診斷和治療增加新的難度，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的影響也越來(lái)越大，阻礙了我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的規(guī)?；l(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越重視對(duì)ND新型疫苗的研究開(kāi)發(fā)，新城疫病病毒可特異性殺死腫瘤細(xì)胞，為病毒溶瘤物的開(kāi)發(fā)帶來(lái)希望。