幾種中藥內(nèi)生菌對(duì)梨黑斑病菌的抑制作用研究

崔文寧

（衡水學(xué)院 河北 衡水 053000）

梨黑斑病因傳播性強(qiáng)等特征使其成為世界各地都重視的病害之一[1]。梨黑斑病具有發(fā)病部位廣、危害時(shí)間長的特點(diǎn)，主要危害梨的葉、芽和果實(shí)。尤其是嫩芽及幼嫩葉片易感病，病害擴(kuò)散影響梨樹長勢(shì)[2]。目前，主要用化學(xué)方法對(duì)梨黑斑病進(jìn)行干預(yù)，然而化學(xué)殺菌劑存在很多隱患，并且長期使用單一的殺菌劑可能會(huì)導(dǎo)致病原菌變異，使梨黑斑病菌對(duì)藥物產(chǎn)生抗性。因此，急需尋找一種更安全的防治梨黑斑病的方法，代替或者輔助化學(xué)防治[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料。梨黑斑病菌、20種中藥內(nèi)生細(xì)菌均由衡水學(xué)院園林實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基制作。①PDA培養(yǎng)基：先稱取200 g土豆，洗凈去皮切成小塊，然后加水煮爛，用紗布過濾雜質(zhì)，加熱，加12 g瓊脂，同時(shí)不斷攪拌并加入葡萄糖30 g，待溫度稍冷卻，加入1 000 ml的無菌水，再等量分配到錐形瓶中，高溫滅菌20 min后取出，放于無菌環(huán)境中備用。②NA培養(yǎng)基：將33 g瓊脂粉加入到1 000 ml蒸餾水中，加熱后于121℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min。③牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：用適量的熱水將牛肉膏溶解后，依次加入蛋白胨、NaCl。充分溶解后分裝入錐形瓶，再于121℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min。

1.2.2 梨黑斑病菌的分離。取梨病健交界處的組織于PDA培養(yǎng)基上，后置于恒溫箱中培養(yǎng)至獲得純的菌株。

1.2.3 中藥內(nèi)生細(xì)菌的分離。先取中藥組織進(jìn)行殺菌處理，再用無菌研缽研磨成均勻漿液，后將研磨液倒于NA培養(yǎng)基上，置于恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2.4 梨黑斑病菌菌絲生長的室內(nèi)抑菌效果初篩。在激活的梨黑斑菌邊緣打取菌餅，再用接種鏟將其倒置接種到PDA平板中心。再用無菌接種環(huán)分別在中心病原菌上下2.5cm處畫一條線，每株菌設(shè)3個(gè)重復(fù)并設(shè)對(duì)照。于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，測(cè)量菌落生長，后每隔24h測(cè)量1次，直到對(duì)照長滿為止，計(jì)算抑制率。

1.2.5 梨黑斑病菌菌絲生長的室內(nèi)抑菌效果復(fù)篩。用直徑為0.6 cm的打孔器在梨黑斑病菌附近準(zhǔn)確取樣，再用接種鏟將其倒置接種到PDA平板的中央，在距離病原菌周圍3 cm的地方放置3個(gè)無菌濾紙片，形成個(gè)等邊三角形，在濾紙上滴入20μL配置好的OD值為0.600菌液，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察并測(cè)量菌落生長情況，之后每隔24 h測(cè)量1次，直至對(duì)照長滿，并計(jì)算抑菌率。抑菌率計(jì)算公式：菌絲生長抑制率(%)＝[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。使用Excel2019繪制和分析數(shù)據(jù)，并使用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨黑斑病菌拮抗中藥內(nèi)生菌的篩選。梨黑斑病菌菌絲生長的室內(nèi)抑菌效果初篩得到數(shù)據(jù)如表1所示。由表1可知，這20種內(nèi)生菌中，益母草葉6、益母草葉2、益母草葉4、益母草葉1、知母根6和益母草葉8這6種內(nèi)生菌對(duì)梨黑斑病菌有較顯著抑制作用，抑制率最高達(dá)到92.55%。這6種細(xì)菌之間差異不顯著，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；而益母草根2、益母草根4、知母根5、知母葉2、知母根3、知母葉1、知母根4這7種細(xì)菌抑菌效果不明顯，抑菌率低于30%，分別為2.74%、7.84%、7.84%、9.41%、14.15%、17.25%、26.27%，這7種細(xì)菌的抑菌效果較差，舍去；其余7種細(xì)菌抑菌率在30%～80%，抑菌效果一般，舍去。

表1 中藥內(nèi)生細(xì)菌對(duì)梨黑斑病菌菌絲生長抑制效果

2.2 中藥內(nèi)生細(xì)菌對(duì)梨黑斑病菌菌絲生長的拮抗性能比較。根據(jù)初篩結(jié)果，選用的6種對(duì)病菌抑制效果較好的內(nèi)生菌，以濾紙片法測(cè)定對(duì)病菌進(jìn)行了復(fù)篩，結(jié)果如表2所示。由表2可知，這6種中藥內(nèi)生細(xì)菌對(duì)梨黑斑病菌都具有抑制作用，其中益母草葉4抑制效果最好，平均抑菌率高達(dá)到60.39%，而益母草葉6和益母草葉2抑制效果一般，平均抑菌率分別為42.75%、40.39%。益母草葉4與其他幾種內(nèi)生細(xì)菌之間差異顯著。益母草葉1、知母根6和益母草葉6三者之間無顯著差異，但三者與益母草葉8和益母草葉2差異顯著。

表2 初篩得到的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)梨黑斑病菌菌絲生長抑制效果

3 結(jié)論與討論

內(nèi)生細(xì)菌在防治植物病害和促進(jìn)植物健康生長方面具有非常巨大的應(yīng)用潛力[4]。內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)一步構(gòu)成植物內(nèi)部自然的防御體系，可起到全面化、多元化的預(yù)防和促進(jìn)作用[5]。本次試驗(yàn)中大部分內(nèi)生細(xì)菌對(duì)梨黑斑病菌有著較好的抑菌效果，其中益母草葉4對(duì)抗菌群產(chǎn)生的防御最強(qiáng)，抑菌率達(dá)60.39%，能夠達(dá)到比其他處理更加穩(wěn)定的效果，而益母草葉1、知母根6、益母草葉6對(duì)病原菌抑制效果較好，益母草葉2和益母草葉8對(duì)病原菌抑制效果不明顯，還需進(jìn)一步試驗(yàn)研究。所以，益母草葉4對(duì)梨黑斑病菌能起到抑制作用，這為進(jìn)一步研究中藥內(nèi)生菌防治梨黑斑病菌奠定了一定基礎(chǔ)。