Percoll分離法和SDS沉淀法聯(lián)合MALDI-TOF MS在快速鑒定血流感染病原菌中的應(yīng)用

劉沫然 鄭玉婷 李紅柳 肖銦 杜欣 才奇博

作者單位：161000 黑龍江齊齊哈爾，齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科（劉沫然、鄭玉婷、李紅柳、杜欣、才奇博），腫瘤一科（肖銦）

近年來(lái)，由于臨床各類侵入性操作的增加以及抗菌藥物的不合理應(yīng)用，會(huì)削弱患者機(jī)體免疫功能，增加血流感染的發(fā)生率［1］。血流感染具有病情發(fā)展迅速且危及生命等特點(diǎn)，會(huì)引發(fā)機(jī)體嚴(yán)重?fù)p傷，也是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit，ICU）患者死亡的重要原因之一，現(xiàn)已引起臨床的高度重視與關(guān)注［2-3］。傳統(tǒng)血培養(yǎng)鑒定具有易操作、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)一般需16～24 h［4］。然而對(duì)血流感染患者而言，時(shí)間就是生命，及早鑒定出病原菌對(duì)提高患者存活率具有重要意義。細(xì)胞分離液Percoll是一種硅膠顆粒，含有乙烯吡咯烷酮，不能穿透生物膜，因此多用于病毒、細(xì)菌和細(xì)胞分離［5］。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）沉淀法利用溫和的表面活性劑純化菌體，去除干擾因素，從而提高細(xì)菌鑒定率?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDITOF MS）是一種新型的細(xì)菌鑒定技術(shù)，不僅可以鑒定純培養(yǎng)的菌落，還可以直接鑒定培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性的體液、尿液、血液標(biāo)本，與傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法比較，明顯縮短了細(xì)菌鑒定時(shí)間［6-7］。本研究收集2022年1—11月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院接收的300份血培養(yǎng)報(bào)警陽(yáng)性標(biāo)本，探討Percoll分離法和SDS沉淀法聯(lián)合MALDI-TOF MS在快速鑒定血流感染病原菌中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1樣本收集 收集2022年1—11月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院接收的300份血培養(yǎng)報(bào)警陽(yáng)性標(biāo)本（報(bào)警時(shí)間＜48 h），剔除同日同一位患者重復(fù)報(bào)警的標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 安圖AUTOF-MS1000基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司，BD 9120全自動(dòng)血培養(yǎng)儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，DL96A全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)購(gòu)自珠海迪爾生物工程股份有限公司，HF151細(xì)菌培養(yǎng)箱由上海力申科學(xué)儀器有限公司提供。SDS溶液購(gòu)自北京中諾泰安科技有限公司，Percoll細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)藍(lán)瓊脂平板和血瓊脂平板均購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.3研究方法

1.3.1菌種鑒定 將收集的血培養(yǎng)報(bào)警陽(yáng)性標(biāo)本立即接種到血瓊脂平板和中國(guó)藍(lán)瓊脂平板，在35 ℃需厭氧環(huán)境中培養(yǎng)16～24 h后，對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)行染色鏡檢，通過(guò)MALDI-TOF MS對(duì)細(xì)菌進(jìn)行直接鑒定。

1.3.2Percoll分離法 取3 mL 0.9%氯化鈉溶液和3 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)容物，加入15 mL離心管中，混勻后以1 000 r/min（離心半徑為8 cm）離心10 min，將上清液移至另一支離心管中，以5 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入0.4 mL超純水，轉(zhuǎn)移至提前加入2 mL Percoll液的離心管中，氯化鈉溶液與Percoll溶液的體積比為7︰3，以5 000 r/min離心5 min，棄上清液，轉(zhuǎn)移余下的液體至平底EP管，以13 000 r/min離心2 min，棄上清液，重復(fù)洗滌2次，直至洗滌液清亮。

1.3.3SDS沉淀法 取3 mL 0.9%氯化鈉溶液和3 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)容物，加入15 mL離心管中，混勻后以1 000 r/min離心10 min，將上清液移至另一支離心管中，加入1 mL 0.05% SDS溶液，將管內(nèi)溶液顛倒混勻，以5 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1.5 mL超純水，混勻后轉(zhuǎn)移至平底EP管，以13 000 r/min離心2 min，棄上清液，重復(fù)洗滌2次，洗滌后盡可能排干多余水分。

1.3.4MALDI-TOF MS直接鑒定法 取1 μL富集菌體，涂布在金屬靶板（96孔）上，在室溫環(huán)境下干燥處理，加入1 μL 70%甲酸，室溫環(huán)境下干燥處理，加入1 μL基質(zhì)液覆蓋，室溫環(huán)境下干燥處理，將靶板置于MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀上，進(jìn)行細(xì)菌鑒定分析，詳細(xì)記錄鑒定結(jié)果。

1.3.5傳統(tǒng)血培養(yǎng)鑒定法 將采集的陽(yáng)性標(biāo)本接種到中國(guó)藍(lán)瓊脂平板和血瓊脂平板上，在需厭氧環(huán)境下孵育16～24 h，孵育溫度為35 ℃，獲得純菌落后，進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 26.0 軟件，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Percoll分離法與SDS沉淀法鑒定結(jié)果比較300份標(biāo)本中分離出210株革蘭陰性（Gram negative，G-）菌、78株革蘭陽(yáng)性（Gram positive，G+）菌以及12株念珠菌。Percoll分離法對(duì)G+菌、G-菌和念珠菌的鑒定率均明顯高于SDS沉淀法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 Percoll分離法與SDS沉淀法對(duì)菌株的鑒定結(jié)果

2.2MALDI-TOF MS對(duì)Percoll分離法和SDS沉淀法處理后標(biāo)本的病原菌鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)血培養(yǎng)鑒定結(jié)果比較 MALDI-TOF MS對(duì)Percoll分離法處理后標(biāo)本G+菌、G-菌的鑒定率均明顯高于SDS沉淀法處理后標(biāo)本病原菌的鑒定率（均P＜0.05），MALDI-TOF MS對(duì)Percoll分離法處理后標(biāo)本真菌鑒定率與傳統(tǒng)血培養(yǎng)鑒定率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。MALDI-TOF MS對(duì)SDS沉淀法處理后標(biāo)本G+菌、G-菌的鑒定率均明顯低于傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法（均P＜0.05）。見表2。

表2 MALDI-TOF MS對(duì)Percoll分離法和SDS沉淀法處理后標(biāo)本病原菌鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)血培養(yǎng)鑒定結(jié)果比較

3 討論

血流感染是由于各種毒素和病原菌生物侵入人體血液系統(tǒng)而引發(fā)的一種血液感染，膿毒癥血流感染是一種較嚴(yán)重的全身感染性疾病，血液中不斷釋放大量毒素和代謝產(chǎn)物，會(huì)加重患者的原發(fā)病，增加病死率［8-9］。血流感染具有病情進(jìn)展迅速、病死率高、預(yù)后差等特征，病死率可高達(dá)20%以上［10］?？焖勹b定血流感染病原菌對(duì)患者疾病的早期診斷及治療具有重要意義。傳統(tǒng)血培養(yǎng)是臨床診斷血流感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，尤其是對(duì)于非典型微生物、苛氧菌等，診斷時(shí)間更長(zhǎng)，不能滿足臨床診治需求［11-12］。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）、病原菌核酸技術(shù)熒光原位雜交雖然也能明確病原菌類型，但菌種受限于已知類型，具有對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)要求高、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高等不足［13］。MALDI-TOF MS技術(shù)給血流感染的病原菌類型鑒定提供了廉價(jià)、高效、可靠的方法。

由于MALDI-TOF MS檢測(cè)法對(duì)蛋白的純度及豐度要求較高，因此在進(jìn)行MALDI-TOF MS法檢測(cè)前需要先分離培養(yǎng)物中的菌體，將血漿蛋白和細(xì)胞去除，最大限度降低對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾［14-15］。本研究對(duì)選定的血液樣品在MALDI-TOF MS檢測(cè)前先通過(guò)Percoll分離法和SDS沉淀法快速提取血培養(yǎng)陽(yáng)性病原菌，結(jié)果顯示，Percoll分離法對(duì)G+菌、G-菌、念珠菌的鑒定率均明顯高于SDS沉淀法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明Percoll分離法對(duì)提取血培養(yǎng)陽(yáng)性病原菌的鑒定率高于SDS沉淀法。本研究結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS對(duì)Percoll分離法處理后標(biāo)本的病原菌鑒定率明顯高于SDS沉淀法處理后標(biāo)本病原菌鑒定率，表明將MALDI-TOF MS法與Percoll分離法結(jié)合可提高對(duì)病原菌的鑒定率，鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)血培養(yǎng)鑒定結(jié)果較接近。分析原因可能是SDS沉淀法在提取和鑒定病原菌的過(guò)程中，雖然使用的SDS溶液濃度較低，但仍會(huì)影響脆弱擬桿菌等部分G-菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致SDS沉淀法檢測(cè)的部分G-菌發(fā)生黏液化，從而導(dǎo)致病原菌聚集成團(tuán)，最終降低鑒定診斷的準(zhǔn)確度［16-17］。SDS沉淀法處理后病原菌的鑒定率降低，考慮可能與部分細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，G-菌與G+菌比較細(xì)胞壁更薄，含有大量蛋白質(zhì)及脂類物質(zhì)，因此，洗滌過(guò)程中更易被SDS溶液破壞。雖然與SDS沉淀法比較，Percoll分離法提高了鑒定率，但該方法也存在一定不足，如增加了洗滌過(guò)程的復(fù)雜性，在洗滌過(guò)程中容易丟失部分菌體［5］。MALDI-TOF MS檢測(cè)法步驟更簡(jiǎn)便，結(jié)果更精確，對(duì)經(jīng)Percoll分離法處理的標(biāo)本進(jìn)行鑒定時(shí)，可更加直接、快速、準(zhǔn)確地鑒定病原菌類型，提高鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)血培養(yǎng)鑒定結(jié)果的符合率，為血流感染患者的早期診斷與治療提供了科學(xué)的參考依據(jù)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性［18-19］。梁林等［20］研究表明，Percoll分離法結(jié)合MALDI-TOF MS對(duì)G-菌的鑒定率（84.5%）明顯高于SDS沉淀法結(jié)合MALDI-TOF MS（60.6%），與本研究結(jié)果接近，驗(yàn)證了Percoll分離法結(jié)合MALDI-TOF MS在血流感染病原菌的快速鑒定中鑒定率更高。

綜上所述，將Percoll分離法結(jié)合MALDI-TOF MS應(yīng)用于血流感染病原菌的快速鑒定中，可提高鑒定率，鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)血培養(yǎng)鑒定結(jié)果接近，符合率較高，因此臨床實(shí)用價(jià)值較高，值得推廣、參考、借鑒，給更多血流感染患者的早期診治帶來(lái)福音。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突