LncRNA UNC5B-AS1靶向miR-339-5p調(diào)控人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖和凋亡

張 健，張吉炯

(黃石市中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科, 湖北 黃石 435000)

肺癌(lung cancer)起源于氣管、支氣管黏膜或腺體，是一種惡性腫瘤。根據(jù)組織病理學(xué)特點(diǎn)不同，可分為非小細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌。全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率、病死率都極高且呈上升趨勢(shì)[1]。LncRNA是一類真核生物中長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA分子，它具有多種生物學(xué)功能，在一系列疾病都發(fā)現(xiàn)了lncRNA表達(dá)異常，比如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、腎臟疾病、糖尿病和腫瘤等[2]。miRNAs(microRNAs)是一類長(zhǎng)度約19～24 nt的非編碼單鏈RNA，廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌及病毒的基因組中，調(diào)控生物體生長(zhǎng)發(fā)育和疾病發(fā)生等過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)[3]。有研究表明，lncRNA可通過(guò)調(diào)控miRNA的表達(dá)從而影響細(xì)胞生物學(xué)行為[4]。但是lncRNA UNC5B-AS1能否通過(guò)靶向miR-339-5p調(diào)控肺癌的發(fā)生發(fā)展尚未可知。本研究旨在研究lncRNA UNC5B-AS1靶向miR-339-5p對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

組織來(lái)源：收集2018年3月至2019年1月到黃石市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科進(jìn)行治療的30例肺癌患者作為研究對(duì)象，其中男13例，女17例，年齡40～70歲，術(shù)中收集患者肺癌組織及癌旁組織，備用。此研究經(jīng)黃石市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：20180123)，并取得所有家屬及患者的知情同意。

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Invitogen公司)；胰蛋白酶(上海生工生物工程公司)；Lipofectamine 2000(北京天根生化科技公司)；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司)；CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(CST公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)(Sigma-Aldrich公司)；Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax抗體(Abcam公司)；二抗(Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：取對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制備單細(xì)胞懸液，按2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，細(xì)胞匯合度至70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine 2000將si-NC、si-UNC5B-AS1、miR-NC、miR-339-5p mimics轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h，si-UNC5B-AS1與anti-miR-NC、si-UNC5B-AS1與anti-miR-339-5p共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h，分別作為si-NC組、si-UNC5B-AS1組、miR-NC組、miR-339-5p組、si-UNC5B-AS1+anti-miR-NC組、si-UNC5B-AS1+anti-miR-339-5p組。收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-qPCR 檢測(cè)細(xì)胞UNC5B-AS1和miR-339-5p表達(dá)：Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量，反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min(循環(huán)1次)，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(循環(huán)40次)。UNC5B-AS1：上游引物5′-TCGCTACATCCA CTCTCACC-3′，下游引物 5′-CTTCCAGATCCCACCA CAGT-3′；miR-339-5p：上游引物5′-GGGTCCCT GTCCTCCA-3′，下游引物 5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；GAPDH：上游引物5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTC AAC-3′，下游引物：5′-GGGGTCATTGATGGCAACAA TA-3′；U6：上游引物5′-AAAGCAAATCATCGGACG ACC-3′，下游引物5′-GTACAACACATTGTTTCCTCG GA-3′。2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將A549細(xì)胞按照5×103個(gè)/孔接種到96孔板，每個(gè)孔10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h，之后用酶標(biāo)儀在490 nm的波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(A)值。

1.2.4 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取1.0×106個(gè)細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞2次，加入500 μL結(jié)合緩沖液。分別向流式管中加入5 μL annexin V-FITC和5 μL PI染液，室溫避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：利用LncBase Experimental v.2生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)UNC5B-AS1與miR-204-3p的結(jié)合位點(diǎn)。分別構(gòu)建野生型載體UNC5B-AS1-WT與突變型載體UNC5B-AS1-MUT，將載體共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h，根據(jù)熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒計(jì)算細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.6 Western blot檢測(cè)cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)：收集A549細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA檢測(cè)蛋白濃度，水浴加熱變性。分離蛋白、轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜孵育，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，滴加ECL顯影，ImageJ軟件分析各條帶吸光度(A)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 癌旁組織和肺癌組織中UNC5B-AS1和miR-339-5p的表達(dá)

與癌旁組織比較，肺癌組織中UNC5B-AS1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-339-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 癌旁組織和肺癌組織中UNC5B-AS1和miR-339-5p的表達(dá)

2.2 干擾UNC5B-AS1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和蛋白表達(dá)的影響

與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組細(xì)胞UNC5B-AS1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；細(xì)胞活力在24、48和72 h的A值和cyclin D1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，p21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖1,表2)。

表2 干擾UNC5B-AS1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和蛋白表達(dá)的影響

*P<0.05 compared with si-NC group

2.3 干擾UNC5B-AS1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與si-NC組比較，si-UNC5B-AS1組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖2，表3)。

表3 干擾UNC5B-AS1表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

A.apoptosis-related protein expression diagram; B.apoptosis flow cytometry diagram; 0.05 compared with si-NC group

2.4 miR-339-5p過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期蛋白的影響

與miR-NC組比較，miR-339-5p組細(xì)胞miR-339-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；細(xì)胞活力在24、48和72 h的A值和cyclin D1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，p21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖3，表4)。

表4 miR-339-5p過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期蛋白的影響

0.05 compared with miR-NC group

2.5 miR-339-5p過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與miR-NC組比較，miR-339-5p組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖4，表5)。

表5 miR-339-5p過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

<0.05 compared with miR-NC group

2.6 UNC5B-AS1靶向調(diào)控miR-339-5p的表達(dá)

UNC5B-AS1與miR-339-5p的結(jié)合位點(diǎn)(圖5)。結(jié)果顯示，野生型載體UNC5B-AS1-WT細(xì)胞中，miR-339-5p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)(表6)。

表6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

圖5 UNC5B-AS1與miR-339-5p結(jié)合位點(diǎn)

2.7 抑制miR-339-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾UNC5B-AS1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與(si-UNC5B-AS1+anti-miR-NC)組比較，(si-UNC5B-AS1+anti-miR-339-5p)組細(xì)胞活力在24、48和72 h的A值、cyclin D1蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；細(xì)胞凋亡率顯著、p21蛋白、Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖6，表7)。

表7 抑制miR-339-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾UNC5B-AS1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

0.05 compared with si-UNC5B-AS1+anti-miR-NC group

3 討論

肺癌是對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤,發(fā)病率和病死率增長(zhǎng)最快。據(jù)報(bào)道近50年來(lái)，男性肺癌發(fā)病率和病死率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性占第二位[5]。LncRNA可以通過(guò)靶向miRNA影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，與癌旁組織比較，肺癌組織中UNC5B-AS1表達(dá)水平顯著升高，miR-339-5p表達(dá)水平顯著降低。有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果研究一致。LncRNA UNC5B-AS1在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展[6]；LncRNA UNC5B-AS1在卵巢癌組織中呈高表達(dá)，促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞增殖[7]，miR-339-5p在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中呈低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-339-5p能夠抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，與si-NC組比較，抑制UNC5B-AS1表達(dá)細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高。已有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA UNC5B-AS1在結(jié)腸癌樣本中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)lncRNA UNC5B-AS1表達(dá)，可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[9]。抑制甲狀腺癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA UNC5B-AS1表達(dá)，可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[10]。說(shuō)明抑制lncRNA UNC5B-AS1表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組比較，miR-339-5p過(guò)表達(dá)細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高。已有研究表明，上調(diào)miR-339-5p的表達(dá)可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞增殖[11]。miR-339靶向ZNF689可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲[12]。miR-339-5p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于正常水平[13]。說(shuō)明上調(diào)miR-339-5p表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與si-UNC5B-AS1+anti-miR-NC組比較，si-UNC5B-AS1+anti-miR-339-5p組細(xì)胞活力顯著升高；細(xì)胞凋亡率顯著降低。有相似的研究表明，lncRNA MIR17HG通過(guò)上調(diào)miR-142-3p而抑制非小細(xì)胞肺癌增殖[14]。LncRNA SNHG16通過(guò)調(diào)節(jié)miR-520a-3p/EphA2軸促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，為非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制和治療提供了新的靶點(diǎn)[15]。說(shuō)明干擾UNC5B-AS1通過(guò)上調(diào)miR-339-5p表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，干擾UNC5B-AS1通過(guò)上調(diào)miR-339-5p表達(dá)促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549凋亡、抑制細(xì)胞增殖。為治療肺癌提供提供了新的靶點(diǎn)。