靶向剪切力敏感關鍵分子的動脈粥樣硬化防治研究

趙川榕，周 菁

(北京大學 基礎醫(yī)學院 生理學與病理生理學系；教育部分子心血管重點實驗室；國家衛(wèi)生健康委員會心血管分子生物學與調節(jié)肽重點實驗室；心血管受體研究北京市重點實驗室，北京 100191)

血流動力學因素中不規(guī)則的剪切力與粥樣硬化等血管病理改變密切相關：在大動脈彎曲和分叉處的擾流，對血管內壁產生較低、多向且不規(guī)則的剪切力，通過誘導血管炎性反應和內皮細胞過度增殖與凋亡等內皮功能障礙，可促進動脈粥樣硬化的形成；而在大動脈長、直段的層流所產生的單向且規(guī)則的高剪切力，可以刺激內皮細胞產生支持細胞生存和屏障功能的因子，并抑制凝血、白細胞浸潤和血管平滑肌細胞增殖，可以避免產生動脈粥樣硬化[1]。血流擾動如何誘導內皮功能障礙及該過程中涉及的關鍵分子和途徑，是血管力學生物學研究中備受關注的問題。內皮細胞通過機械傳感和機械轉導，可以有效地將力學信號轉化為化學信號，從而激活一系列對機械力敏感的轉錄因子，改變基因的表達，最終影響內皮細胞的反應、結構和功能[2]。這些受到流體剪切力調控的因子，可能是動脈粥樣硬化等內皮細胞功能障礙性疾病的預防和治療的關鍵靶點[3]。近年來有許多研究表明，多種藥物可以通過剪切力敏感的因子通路調節(jié)和改善內皮細胞的功能。因此，本文就部分剪切力敏感的轉錄因子或轉錄輔助因子作為預防和治療動脈粥樣硬化的未來藥物開發(fā)的新方向進行綜述。

1 經典轉錄因子調控通路及靶向治療

1.1 KLF家族

KLF2和KLF4是Krüppel樣因子(Krüppel-like factor, KLF)家族含有鋅指結構的轉錄因子，介導內皮細胞中抗炎、抗氧化和抗血栓基因的表達調控。持續(xù)的高速層流剪切力(12 dyn/cm2)和單向的脈沖剪切力[(12±4)dyn/cm2]能夠通過MEK5/ERK5/MEF2信號通路持續(xù)誘導KLF2及其相關基因KLF4的表達[4]。KLF2是一種血管保護性轉錄因子，在維持內皮細胞穩(wěn)態(tài)和靜態(tài)表型方面起著關鍵作用。KLF4同樣也是非常重要的血管保護性轉錄因子，它也調控了內皮細胞中和KLF2重疊的一些基因例如一氧化氮合成酶3(NOS3)、凝血調節(jié)蛋白(THBD)、纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI1)、血管細胞黏附因子1(VCAM1)的表達[5]。

已經報道的能夠激活或增加KLF2或KLF4表達的藥物有他汀類、白藜蘆醇、異羥肟酸(SAHA)、植物多酚鞣酸(TA)、植物黃酮漆黃素，以及糖尿病的特效藥二甲雙胍等[6]。

1.2 NF-κB

核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)是一種普遍存在的轉錄因子，參與炎性反應、免疫和發(fā)育過程。在內皮細胞中，主要表達的是由p50和p65組成的二聚體形式，當其定位于細胞質時，與抑制蛋白(I-κB)結合，呈不激活的狀態(tài)[7]。低而振蕩的擾流誘導NF-κB激活，可以與位于多種基因啟動子上的剪切力響應元件(SSRE)結合，激活下游多種基因的表達上調。NF-κB對內皮細胞炎性反應具有直接的調控作用，許多轉錄因子信號傳導通路都會通過影響NF-κB的活性而達到影響內皮細胞炎性反應的作用[8]。因此NF-κB通路在剪切力調控的內皮細胞炎性反應中具有非常重要的意義。

天然的NF-κB選擇性或特異性抑制劑被證明是有前途的抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗血管增生和凋亡的有效治療途徑，可以減少動脈粥樣化的形成并防止其并發(fā)癥，例如番茄紅素、芹黃素、穿心蓮內酯、長春西汀、雷公藤甲素、川皮苷等[8]。除此之外，許多化合物例如地高辛、糖皮質激素、阿司匹林、雷帕霉素等也能夠通過抑制NF-κB的活性從而抑制內皮細胞的炎性反應。NF-κB作為內皮細胞炎性反應的重要通路，是各類心血管系統(tǒng)疾病保護與治療藥物的主要研究靶點之一。

1.3 YY1

鋅指轉錄因子陰陽-1(Yin Yang 1, YY1)是一種多功能蛋白，可以根據輔助因子、上下游啟動子和染色質結構激活或抑制基因表達。人類YY1由414個氨基酸殘基組成，包括一個反式激活和抑制結構域和4個C2H2型鋅指結構域[9]。預測YY1參與了大約10%的哺乳動物基因的轉錄控制，這表明YY1在基因調控網絡中起著重要作用。YY1可以與多種轉錄因子相互作用，包括SP1、HOXA11和HDACs[10]。近期有研究[11]指出，在低且振蕩的擾流條件下，通過磷定量蛋白組學分析發(fā)現，YY1第118位絲氨酸呈現高磷酸化，從而促進內皮細胞的增殖與動脈粥樣硬化的發(fā)生。因此內皮細胞中磷酸化的YY1可能是一個很有前景的分子靶點，用于治療與內皮功能障礙相關的血管疾病，如動脈粥樣硬化。

四溴肉桂酸(TBCA)與阿托伐他汀均能夠抑制YY1的磷酸化，并減少動脈粥樣硬化斑塊的形成[11]。而其他YY1抑制劑如NO供體S-亞硝基-N-乙?；?DL-青霉胺(SNAP)和3,3-二(氨乙基)-1-羥基-2-羰基-1-三氮烯(DETA NONOate)、樺木酸、利妥昔單抗、以及蛋白酶體抑制劑NPI-0052均能夠抑制YY1的表達，從而抑制腫瘤生長或增強治療的敏感性[12]，但并未見在血管病變如動脈粥樣硬化中的報道。

1.4 ATF3

活化轉錄因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是ATF/cAMP反應元素結合(CREB)蛋白家族的成員[13]。ATF3在靜息的內皮細胞中表達水平較低，但可以受到多種刺激如細胞因子和趨化因子的誘導。適當的ATF3活性對細胞的正常生理非常重要，而ATF3功能障礙與各種病理生理反應相關，如炎性反應、凋亡、氧化應激和內質網應激，以及疾病包括心血管疾病[14]。有研究[15]顯示，在體外平行板流動腔系統(tǒng)中對人冠脈內皮細胞施加振蕩型剪切力[(0±5)dyn/cm2]和層流型剪切力(15 dyn/cm2)并不能影響ATF3的表達，但在模擬血管斑塊狹窄處的高剪切力(75 dyn/cm2)作用下，ATF3的表達會明顯增加。對冠心病患者的血管尸檢發(fā)現，ATF3的表達與動脈粥樣硬化斑塊的進展和穩(wěn)定性具有相關性，表現在ATF3表達與內膜、壞死灶厚度負相關，與纖維帽厚度正相關，與炎性反應因子、VCAM1、MMP-9負相關，且ATF3可能通過調節(jié)動脈粥樣硬化斑塊的炎性反應來影響動脈粥樣硬化斑塊的結構穩(wěn)定性[16]。因此在斑塊發(fā)生早期對ATF3進行干預可能會是防治動脈粥樣硬化的有效措施。

有研究顯示PP2(SRC通路抑制劑)、KN93(CaMK Ⅱ通路抑制劑)和IWP-2(Wnt/β-catenin通路抑制劑)可以降低ATF3的轉錄水平，并減少腫瘤細胞的生長[17]。但在心血管系統(tǒng)中，在不同的轉錄調控過程中，ATF3可能在抑制因子和激活因子之間轉換[18-19]。此外，對ATF3本身的調控是復雜的，因為ATF3的活性不僅受到表達的調節(jié)，還受到翻譯后修飾的調節(jié)，如泛素化和SUMO化[20]。因此還需要更多的研究去確認ATF3在動脈粥樣硬化進展中的角色。

2 轉錄輔因子調控通路及靶向治療

2.1 YAP/TAZ

YAP和TAZ是轉錄協(xié)同調節(jié)因子，能夠響應多種機械信號(剪切力、硬度、拉伸、形狀)來調節(jié)增殖和分化。YAP/TAZ受到上游Hippo信號通路的抑制，MST1/2激酶磷酸化并激活LATS1/2激酶，使YAP/TAZ磷酸化。關鍵絲氨酸殘基的磷酸化導致YAP/TAZ滯留在細胞質中并降解。相反，去磷酸化的YAP和TAZ轉運到細胞核，結合TEAD因子，誘導下游基因表達[21]。研究表明，擾流增強了YAP的去磷酸化激活，并且與內皮細胞的炎性反應激活有關[22-24]。在臍靜脈內皮細胞中，YAP 第127位絲氨酸(YAP S127)在層流型剪切力(12 dyn/cm2)作用下磷酸化增加，在擾流剪切力[(0.5±6)dyn/cm2]作用下磷酸化減少，表明擾流能夠激活YAP，使YAP/TAZ靶基因表達增加。在小鼠體內動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)也觀察到核YAP升高和p-YAP降低。在高脂血癥小鼠中，全身YAP/TAZ缺乏(通過morpholino寡核苷酸)[24]或內皮細胞特異性YAP敲除(通過CRISPR/Cas9技術)[23]可降低ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化斑塊形成。相比之下，在內皮細胞YAP或全身TAZ或YAP/TAZ的結構性活性突變體過表達的ApoE-/-小鼠中，可促進動脈粥樣硬化[23]。這些在小鼠中進行的一系列功能激活和缺失的研究證明，YAP/TAZ/TEAD是預防動脈粥樣硬化的一個有前景的治療靶點。

維替泊芬(一種光動力治療中的光敏劑)是首個通過干擾YAP和TEAD相互作用而抑制YAP/TEAD的化學抑制劑。在以西式飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠中，維替泊芬同時伴有光激活，可延緩動脈粥樣硬化和巨噬細胞凋亡[25]。他汀類藥物辛伐他汀也可抑制YAP/TAZ的激活，促進他汀類藥物的動脈粥樣硬化保護作用[23]。洛伐他汀通過抑制YAP和TAZ來抑制血管緊張素II誘導的心血管纖維化[26]。藤黃酸(gambogic acid, GA)最近被發(fā)現是YAP/TAZ的抑制劑，它通過阻止內皮細胞的增殖、遷移、發(fā)芽和管狀形成來抑制血管內皮生長因子(VEGF)誘導的血管生成過程[27]。甲氨蝶呤抗炎治療通過抑制AMPK活性抑制了擾流誘導的內皮細胞中YAP/TAZ的激活,顯著降低了內皮細胞中的促炎因子分泌和單核細胞粘附[28]。這些臨床前研究結果表明，YAP/TAZ/TEAD抑制是治療內皮功能障礙和動脈粥樣硬化的一種有前途的策略。

2.2 Wnt/β-catenin

典型的Wnt/β-catenin通路在發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和癌癥等疾病中發(fā)揮著多種關鍵的作用。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在細胞骨架連接和轉錄輔助因子中扮演著雙重角色。在未受刺激的細胞中，胞質β-catenin通過多組分“破壞復合物”迅速降解。而各種刺激能通過Wnt配體結合其跨膜受體Frizzled(Fz)和脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)，抑制破壞復合物并穩(wěn)定β-catenin，β-catenin因此在細胞核中積累，并與T細胞因子/淋巴增強因子結合因子-1(TCF/Lef-1)轉錄因子結合，以驅動靶基因表達[29]。在心血管系統(tǒng)中，Wnt/β-catenin通路在發(fā)育過程中發(fā)揮多種重要的作用，包括內皮細胞分化、心臟瓣膜形態(tài)形成中的內皮-間質轉化、血腦屏障的建立和血管生成[30-31]。人主動脈內皮細胞中Wnt/β-catenin信號通路可被振蕩剪切力[(0±3)dyn/cm2]激活[32]。在ApoE-/-小鼠的主動脈弓內彎處能觀察到β-catenin定位細胞核中，而在外側和胸主動脈長直段則沒有明顯的β-catenin核定位[33]。這些結果表明針對Wnt/β-catenin信號通路進行干預可能會是防治動脈粥樣硬化的有效措施。

通過靶向Wnt的分泌或β-連環(huán)蛋白破壞復合物的轉換，可以對心血管系統(tǒng)疾病有一定的治療效果。例如，GNF-6231是Wnt棕櫚?；囊种苿?，它能抑制典型和非典型Wnt配體的分泌，在心肌梗死模型中，瞬時給予GNF-6231限制了纖維化心肌損傷并促進恢復[34]。同樣，端錨聚合酶拮抗劑XAV939可以降低Wnt通路中β-連環(huán)蛋白的表達，增加Axin水平，減少典型Wnt信號通路和機械損傷誘導的新生內膜形成[35]。這些數據表明，一些正在開發(fā)的用于癌癥治療的新型靶向Wnt/β-catenin通路的小分子可能被重新用于某些心血管疾病。

2.3 APEX1

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APEX1)是一種具有無嘌呤/無嘧啶位點內切酶活性的DNA修復酶，在DNA堿基切除修復途徑中發(fā)揮重要的作用，它還具有氧化還原調節(jié)的功能，能夠調控多種轉錄因子例如NF-κB、AP-1、HIF1α、p53的DNA結合活性和轉錄活性[36]。研究[37]表明，細胞核中的APEX1具有穩(wěn)定DNA并且轉錄激活的作用，而細胞質中的APEX1則具有抑制ROS產生和抗炎、抗凋亡的作用。本課題組最近的研究[38]發(fā)現，受層流(或脈沖型剪切力)作用的內皮細胞中APEX1多分布于細胞質中，而受擾流(或振蕩型剪切力)作用的APEX1向細胞核中轉位，提示APEX1 是一種剪切力信號敏感分子。敲低和抑制內皮細胞內APEX1的活性能夠抑制細胞促炎因子的表達。利用內皮特異性APEX1敲除小鼠合并AAV8-PCSK9病毒注射造就高脂血癥、ApoE-/-小鼠疊加頸動脈APEX1病毒孵育與部分結扎誘導血流擾動，明確了內皮細胞APEX1的促炎和促動脈粥樣硬化發(fā)生作用。這項研究證明，APEX1是預防和治療動脈粥樣硬化的一個有前景的治療靶點。

鑒于目前APE1/Ref-1在癌癥發(fā)病機制和DNA相互作用藥物耐藥中發(fā)揮重要作用，因此已有研究關注APEX1小分子抑制劑的鑒定[39]。APEX1核酸內切酶活性的抑制劑如甲氧基胺、甲硫恩酮、羥胺硫蒽酮等具有比較強的堿基切除修復的抑制能力，能夠增強對腫瘤殺傷以及腫瘤的放化療敏感性[40]。而APEX1氧化還原功能的抑制，具有較小的細胞毒性和較強的抑制轉錄因子的活性，成為了新型腫瘤防治藥物的開發(fā)重點。一些天然產物例如白藜蘆醇、姜黃素、大豆黃素、丹參酮IIA等被發(fā)現均能抑制APEX1與NF-κB通路，從而抑制炎性反應與腫瘤生長[40]。APEX1氧化還原特異性抑制劑E3330可以有效殺傷腫瘤細胞而對正常細胞沒有生長抑制作用，但仍具有一定的細胞毒性[41]。本課題組基于網絡藥理學方法預測出新的且低細胞毒性的APEX1氧化還原抑制劑牡荊素，并將其應用在心血管系統(tǒng)疾病中[38]。通過細胞熱轉移分析(CETSA)實驗[42]驗證了牡荊素在內皮細胞中與APEX1直接相互結合并改變APEX1的拓撲結構，改變其變性溫度。通過表面等離子體共振(SPR)實驗證明了牡荊素相較于E3330能夠更多地與APEX1相互結合。發(fā)現牡荊素能夠通過抑制APEX1的核轉位而保護血管內皮細胞免受體外振蕩型剪切力和TNFα刺激引起的炎性反應，并且抑制體內病理性擾流引起的小鼠新生內膜形成和ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化形成。這些研究結果提示，牡荊素以及一些正在開發(fā)的用于癌癥治療的APEX1抑制劑可能是治療內皮功能障礙和動脈粥樣硬化的有前途的策略。

3 總結和展望

流體剪切力作用于血管內皮細胞后，可通過機械力感受器將機械刺激轉化為生化信號，促進或抑制內皮細胞的炎性反應。過去幾十年間，已有受到流體剪切力調控的轉錄因子、轉錄輔助因子及其相關信號通路被報道。本文總結了近年來部分與內皮細胞炎性反應相關的轉錄因子信號通路，包括層流誘導的動脈保護性轉錄因子KLF2/4，擾流誘導的促動脈粥樣硬化的轉錄因子如NF-κB，新近發(fā)現可能在血管生理中具有重要作用的YY1和ATF3，轉錄輔因子如YAP/TAZ、Wnt/β-catenin和APEX1調控通路，以及針對這些轉錄因子通路的抗動脈粥樣硬化治療方案。

內皮細胞從感知機械力、傳導力學信號到產生效應的過程中有多種轉錄因子信號通路的參與。各個信號通路之間并不是完全獨立。例如NF-κB和KLF2信號在內皮細胞中相互起拮抗作用，NF-κB通過抑制MEF2的轉錄活性來降低KLF2的表達，而KLF2和KLF4反過來能夠抑制NF-κB的功能和黏附分子的表達[43]。內皮細胞功能的多樣性反映在剪切力誘導的信號傳導機制的多樣性上，但多種機制對特定類型的機械力刺激可能是協(xié)調一致的。因此整合內皮細胞中受剪切力調控的多個信號通路，并找出關鍵的轉錄因子，以此為靶點進行藥物篩選和開發(fā)，可能是靶向治療心血管疾病的有效方式。