香砂六君子湯調(diào)控CircRNA-0067835對(duì)脾虛高脂血癥大鼠膽固醇外排的影響

孟嘉偉,宋囡,王瑩,陳絲,王群,趙秋宇,賈連群

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 沈陽(yáng) 110847)

近三十年來(lái),中國(guó)人的血脂水平逐步升高,顯著增加了以血脂異常為基礎(chǔ)的心血管疾病的發(fā)病率[1]。采取有效的治療手段將減輕血脂異常引起的相關(guān)疾病負(fù)擔(dān)。血脂異常屬于中醫(yī)學(xué)“痰濕”“痰濁”“痰瘀” 等范疇?！夺t(yī)宗必讀》云:“脾為生痰之源”[2]?？杀砻髌⑴c膏脂痰濕的生成之間存在著密切關(guān)系。脾為升清降濁的重要樞紐。脾虛,意味著脾的運(yùn)化功能受損,被視為加重血脂異常的關(guān)鍵病機(jī)之一[3]。課題組前期在此病機(jī)的基礎(chǔ)上,選取健脾降濁法作為治療的主要方法,選取益氣化痰,理氣暢中的經(jīng)典方劑香砂六君子湯治療脾虛高脂血癥大鼠。并對(duì)香砂六君子湯治療劑量進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)正常劑量(5.67 g·kg-1·d-1)和高劑量(11.34 g·kg-1·d-1)治療高脂血癥效果明顯,香砂六君子湯在調(diào)節(jié)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)及糾正失功能高密度脂蛋白等方面療效顯著[4-5]。目前,非編碼RNA的深入研究為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)開(kāi)啟了疾病防治的新征程。微小核苷酸(miRNAs)作為非編碼RNA中重要的一部分,隨著相關(guān)研究的不斷深入,臨床和實(shí)驗(yàn)研究揭示了miRNAs在肝脂肪變性發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵作用[6-8]。環(huán)狀RNA(CircRNA)可以通過(guò)“海綿化”目標(biāo)miRNA和調(diào)節(jié)miRNA靶向轉(zhuǎn)錄本的表達(dá),在生物過(guò)程中起著重要作用[9]。本實(shí)驗(yàn)選用高脂血癥大鼠探討香砂六君子湯是否可以通過(guò)調(diào)控CircRNA-0067835/miR-155，調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體-γ(PPARγ)所介導(dǎo)的肝臟膽固醇外排,從而改善高脂血癥,為中醫(yī)藥在臨床中的作用機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

30只SPF級(jí)SD大鼠,8周齡,體質(zhì)量(190±20) g,由遼寧長(zhǎng)生生物科技股份有限公司提供,于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)濕度維持40%～70%,溫度維持18～22 ℃,采取12 h/12 h模式進(jìn)行晝夜明暗交替。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(遼)2015-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查編號(hào):21006092017056。

1.2 藥物

1.3 主要試劑及儀器

TC、TG、LDL-C、HDL-C試劑盒(四川邁新生物技術(shù)有限公司,批號(hào):CH0103152、CH0105151、CH0105162、CH0105161);蘇木素-伊紅(HE)染色液(碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):C0105);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,批號(hào):CW2582M、CW2601M);動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司,批號(hào):RE-03014);PPARγ、肝X受體(LXR)、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ABCG1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(美國(guó)Proteintech公司,批號(hào):16643-1-AP、14351-1-AP、13578-1-AP、10494-1-AP);腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)抗體(美國(guó)Immunoway公司,批號(hào):YN2847)。

Dmilled型普通光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司);TBA-120FR型全自動(dòng)生化分析儀(日本Toshiba公司);ST16R型冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);MultiskanTMFC型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);BioSpec-nano型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)。

2 方法

2.1 分組與造模

對(duì)30只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、高脂組、脾虛高脂組、香砂六君子湯高劑量組及香砂六君子湯正常劑量組,每組6只。脾虛高脂組、香砂六君子湯高劑量組及正常劑量組大鼠建立脾虛模型,采用不節(jié)飲食加游泳至力竭的造模方法:飽食1 d,禁食2 d,不控制飲水；與此同時(shí),每日放置大鼠于35～37 ℃水中游泳,直至力竭,連續(xù)15 d。根據(jù)文獻(xiàn)對(duì)大鼠脾虛證進(jìn)行評(píng)估[10],當(dāng)大鼠出現(xiàn)游泳耐力下降、體質(zhì)量減輕、食量減少、糞便時(shí)軟時(shí)溏、倦怠懶動(dòng)、毛色枯槁無(wú)光澤等表現(xiàn)時(shí),證明脾虛模型造模成功。

隨后建立高脂血癥模型,除空白對(duì)照組外其余4組飼喂高脂飼料14周,期間自由攝食,不限制飲水。

2.2 給藥

從建立高脂血癥模型的第10周開(kāi)始灌胃給藥。根據(jù)前期研究[4-5]以及香砂六君子湯人體的臨床等效劑量換算[11]，香砂六君子湯正常劑量組及香砂六君子湯高劑量組分別給予香砂六君子湯5.67、11.34 g·kg-1·d-1灌胃,其他3組灌胃等體積的生理鹽水,給藥4周后取材。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 血脂水平檢測(cè) 取材前12 h停止供食,飲水不限,麻醉后取腹主動(dòng)脈血,檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

2.3.2 HE染色觀察肝臟組織病理形態(tài) 采用4%組織細(xì)胞固定液浸泡肝臟組織,達(dá)24 h以上,梯度脫水,包埋組織、切石蠟成5 μm厚片放置蒸餾水中浸泡2 min,HE染色5 min后,流水沖洗10 min,于95%乙醇中脫水處理2 min,二甲苯5 min,透明,重復(fù)洗滌2次,滴加中性樹(shù)膠封片,晾干,觀察。

2.3.3 油紅O染色觀察肝臟脂質(zhì)沉積 將肝組織置于4%多聚甲醛中,依次于15%、30%蔗糖中脫水,包埋,制作冰凍切片,油紅O染色10 min,75%乙醇分化2 s,1 min水洗后蘇木素復(fù)染2 min,流水沖洗返藍(lán),甘油明膠封片后觀察。

2.3.4 qPCR檢測(cè)各組大鼠肝臟CircRNA-0067835、miR-155、PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1基因表達(dá)情況 用試劑盒提取各個(gè)樣品的RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,設(shè)定PCR反應(yīng)條件,用SYBR Green Mater Mix試劑檢測(cè)各待測(cè)基因的mRNA或miRNA水平;PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 15 min。用2-ΔΔCt法分析基因相對(duì)表達(dá)量，ΔCt值為目的基因Ct值與內(nèi)參基因(GAPDH,U6)Ct值的差值,ΔΔCt為各實(shí)驗(yàn)組ΔCt與空白對(duì)照組ΔCt的差值。qPCR引物由通用公司設(shè)計(jì)合成,序列見(jiàn)表1。

1.1 一般資料 選取自2013年2月至2018年2月漳州市第三醫(yī)院收治的的80例繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)患者為研究對(duì)象，按隨機(jī)數(shù)字表法分為手術(shù)組與研究組，每組各40例。手術(shù)組男性24例，女性16例；年齡51～76歲，平均年齡(64.5±2.3)歲。研究組男性19例，女性21例；年齡55～78歲，平均年齡(63.3±1.9)歲。兩組的性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

表1 qPCR引物序列Fig.1 The qPCR primer sequence

2.3.5 Western blot法檢測(cè)PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)情況 稱取肝臟組織0.1 g于EP管中,加入1 mL裂解液,在冰上使用研磨機(jī)充分研磨組織,靜置30 min后,在12 000 r·min-1、4 ℃、10 min的條件下進(jìn)行離心,取上清。采用BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。按比例加入上樣緩沖液,100 ℃下將試劑變性5 min,以每組60 μg為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出樣本的上樣體積,放板,注入電泳液,加入對(duì)應(yīng)體積,開(kāi)始電泳。電泳結(jié)束后,開(kāi)始轉(zhuǎn)膜,100 V、80 min恒壓濕轉(zhuǎn),5%脫脂奶粉搖床封閉1 h,加入配比稀釋的一抗,4 ℃過(guò)夜孵育。次日,TBST清洗10 min,重復(fù)4次,洗掉一抗。按照1∶8 000比例稀釋二抗,孵育1 h,TBST清洗10 min,重復(fù)4次,洗掉二抗。曝光。應(yīng)用Alpha View軟件進(jìn)行分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血脂水平比較

見(jiàn)表2,相較于空白對(duì)照組,高脂組和脾虛高脂組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高,HDL-C水平顯著降低(P<0.01)。相較于脾虛高脂組,香砂六君子湯高劑量組和正常劑量組TC、TG、LDL-C顯著降低,HDL-C顯著升高(P<0.01)。香砂六君子湯高劑量組和正常劑量組之間部分指標(biāo)存在顯著性差異(P<0.05,P<0.01)。

表2 各組大鼠血脂水平比較Table 2 The comparison of serum lipid levels in each group

3.2 各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)比較

空白對(duì)照組肝細(xì)胞明顯可見(jiàn)居中且圓的細(xì)胞核,肝竇表現(xiàn)正常,存在結(jié)構(gòu)清晰的細(xì)胞索;相較于空白對(duì)照組,高脂組和脾虛高脂組大鼠肝組織明顯空泡化,細(xì)胞腫大,形態(tài)疏松,一部分細(xì)胞核偏向細(xì)胞膜；相較于高脂組，脾虛高脂組肝組織空泡密度更大,泡沫化更明顯;香砂六君子湯高劑量組與正常劑量組大鼠肝臟組織的空泡顯著減少,腫脹的肝細(xì)胞得到改善,胞核趨于正常,可見(jiàn)整齊排列的細(xì)胞,香砂六君子湯高劑量組病理形態(tài)改善情況較正常劑量組明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)比較(HE,×200)Fig.1 Comparison of pathological morphology of liver tissues in each group(HE,×200)

3.3 各組大鼠肝臟組織脂質(zhì)沉積情況比較

空白對(duì)照組大鼠肝臟細(xì)胞排列規(guī)整,肝細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)橘紅色脂滴,細(xì)胞核為藍(lán)色,肝竇結(jié)構(gòu)正常;高脂組大鼠肝臟細(xì)胞腫脹明顯,肝細(xì)胞間隙變寬,視野出現(xiàn)彌漫性橘紅色脂滴,細(xì)胞核大小不等,脂質(zhì)蓄積程度明顯加重;脾虛高脂組大鼠呈現(xiàn)更加腫脹的肝細(xì)胞,脂滴密度相較于高脂組更甚,脂質(zhì)沉積情況更加嚴(yán)重,經(jīng)香砂六君子湯治療的2組肝臟細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴顯著減少,細(xì)胞核明顯變小,肝竇結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)或恢復(fù)正常,脂質(zhì)蓄積程度顯著減輕;其中,香砂六君子湯正常劑量組脂質(zhì)蓄積減輕效果不如香砂六君子湯高劑量組。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠肝臟組織脂質(zhì)沉積情況比較(油紅O,×200)Fig.2 Comparison of lipid deposition of liver tissues in each group (Oil red O, ×200)

3.4 各組大鼠肝臟CircRNA-0067835、miR-155與PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)的比較

相較于空白對(duì)照組,高脂組與脾虛高脂組大鼠肝臟miR-155表達(dá)升高(P<0.01),CircRNA-0067835與PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)降低(P<0.01);相較于脾虛高脂組,香砂六君子湯高劑量組與正常劑量組大鼠的miR-155表達(dá)降低(P<0.01),CircRNA-0067835與PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

注:與空白對(duì)照組比較,**P<0.01;與脾虛高脂組比較,▲▲P<0.01;與香砂六君子湯正常劑量組比較,圖3 各組大鼠肝臟CircRNA-0067835、miR-155與PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)的比較Fig.3 The expressions of CircRNA-0067835, miR-155 and PPARγ, LXR, ABCA1, ABCG1 mRNA in each group

3.5 各組大鼠肝臟PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)的比較

相較于空白對(duì)照組,高脂組與脾虛高脂組大鼠肝臟PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01);相較于脾虛高脂組,香砂六君子湯高劑量組與正常劑量組大鼠PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

注:與空白對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01;與脾虛高脂組比較，圖4 各組大鼠肝臟PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)的比較Fig.4 The expressions of PPARγ， LXR， ABCA1， ABCG1 in each group

4 討論

血脂異常疾病通常是由脂質(zhì)代謝紊亂或轉(zhuǎn)運(yùn)異常而引起的,又被稱為高脂血癥。臨床多表現(xiàn)為T(mén)C、TG、LDL-C高于正常值和(或)HDL-C低于正常值。在現(xiàn)代研究中,血脂的產(chǎn)生以及血清中TC、TG、LDL-C的升高被認(rèn)為體現(xiàn)了痰證在微觀視野的基礎(chǔ)和實(shí)質(zhì)[12]。脾為后天之本,可主運(yùn)化,主氣血生化?！案嘀钡倪\(yùn)行依賴于氣血的推動(dòng),從而濡養(yǎng)全身?！夺t(yī)宗必讀》云:“脾土虛弱,清者難升,濁者難降,留中滯膈,瘀而成痰”[2]。脾作為升清降濁的重要樞紐,虛時(shí)難以化濁,致使代謝紊亂,是最終導(dǎo)致血脂異常的關(guān)鍵病機(jī),是“痰濁”“血瘀”之類的病理產(chǎn)物生成的重要因素。香砂六君子湯一直被視為益氣化痰,理氣暢中的經(jīng)典傳統(tǒng)方劑。香砂六君子湯在四君子湯基礎(chǔ)上將人參換作黨參,增加陳皮、半夏、木香、砂仁4味中藥,增強(qiáng)了燥濕祛痰、健脾和胃的功效。

膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)是膽固醇代謝的關(guān)鍵部分,因而作為膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的起始步驟,膽固醇外排是抗血脂異常的關(guān)鍵機(jī)制之一[13]。研究表明,PPARγ可參與膽固醇代謝和脂肪細(xì)胞功能的調(diào)控[14],在肝臟和骨骼肌中高度表達(dá),可以通過(guò)對(duì)參與脂肪酸吸收/氧化和甘油三酯分解代謝的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝,是治療血脂異常的關(guān)鍵受體[15]。CircRNAs是一類新的內(nèi)源性非編碼RNA,在真核轉(zhuǎn)錄組中有很高的表達(dá)[16]。CircRNA“海綿”作用的發(fā)揮主要是通過(guò)miRNA,二者結(jié)合后,miRNA的作用受到抑制,從而影響下游基因表達(dá)[17]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí),CircRNA參與脂肪生成與脂解,可以調(diào)節(jié)脂肪組織的分化和轉(zhuǎn)化。除此之外,CircRNA與巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)流出和脂肪分解有一定的關(guān)系,參與了脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)和脂質(zhì)紊亂疾病的發(fā)展[18]。實(shí)驗(yàn)證明,CircRNA-0067835可以抑制miR-155的表達(dá)并通過(guò)PPARγ參與膽固醇代謝[19]。PPARγ調(diào)控下游基因LXR。LXR調(diào)節(jié)參與維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的多個(gè)基因的表達(dá)。研究表明,LXR激動(dòng)劑對(duì)血漿高密度脂蛋白、膽固醇吸收和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)有益,是改善血脂異常的重要調(diào)節(jié)因子[20]。PPARγ和LXR是在巨噬細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用的2個(gè)核受體,它們均與膽固醇排出的參與者ABCA1、ABCG1激活有關(guān)[21]。LXR是控制細(xì)胞膽固醇運(yùn)輸?shù)闹饕蜃?通過(guò)直接增加ABCA1和ABCG1的水平,使得膽固醇可以從巨噬細(xì)胞中順利泵出[22-23]。ABCA1的主要任務(wù)是介導(dǎo)膽固醇向無(wú)脂的載脂蛋白A-Ⅰ(ApoA-Ⅰ)的外排,而膽固醇向高密度脂蛋白顆粒的外排是在ABCG1的參與下完成的[24-25]。調(diào)控膽固醇外排在防治血脂異常方面具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高脂飼喂的大鼠血脂升高,肝細(xì)胞可見(jiàn)顯著泡沫化。而脾虛大鼠可見(jiàn)肝細(xì)胞更加顯著的泡沫化,血脂水平也存在明顯的變化,說(shuō)明高脂血癥大鼠在脾虛的病理狀態(tài)下，脂質(zhì)代謝紊亂程度將進(jìn)一步加重。在香砂六君子湯的干預(yù)下,大鼠血脂水平得到改善。香砂六君子湯可能通過(guò)上調(diào)CircRNA-0067835水平,抑制miR-155基因表達(dá),進(jìn)而增加PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1 mRNA與蛋白表達(dá)水平,促進(jìn)肝臟膽固醇外排,達(dá)到防治高脂血癥的重要作用,然具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步完善和證實(shí)。