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    草莓果實病原菌的分離鑒定及對12種殺菌劑的敏感性

    2022-03-12 05:32:00姜莉莉王欽超宗曉娟王曉芳田中一久武沖
    山東農(nóng)業(yè)科學 2022年2期
    關鍵詞:孢菌原藥酰胺

    姜莉莉,王欽超,宗曉娟,王曉芳,田中一久,武沖

    (1.山東省果樹研究所/山東省現(xiàn)代設施果樹技術創(chuàng)新中心,山東 泰安 271000;2.龍口省級農(nóng)業(yè)高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)管委會,山東 龍口 265701)

    草莓(Fragaria ananasaDuch)屬薔薇科草莓屬多年生草本植物,其果實味美多汁、口感上佳,且富含維生素、花色苷等多種營養(yǎng)成分,深受消費者喜愛[1]。由于草莓果皮薄、果肉組織柔軟,在采摘和采后貯運過程中極易受到擦碰,導致病原菌侵染而迅速腐爛,造成巨大經(jīng)濟損失[2]。

    草莓含水量較高,易促使微生物生長繁殖。微生物是影響草莓貯存期的重要因素,因此抑制微生物的生長是提高草莓保鮮效果、延長貨架期的必要條件,也是草莓采后產(chǎn)業(yè)迫切需要解決的問題[3]。本研究從‘章姬’草莓的腐敗果實中分離病原菌,進行菌種鑒定,并通過測定室內(nèi)毒力評價其對12種殺菌劑的敏感性,篩選得到高效殺菌劑,以期為草莓果實病害科學防控提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    2021年5月3日,在山東省果樹研究所金牛山試驗基地草莓大棚采集無腐爛、無病蟲害、無機械損傷的近成熟‘章姬’草莓果實,置于無菌保鮮盒內(nèi),室溫放置。待果實自然腐爛后,進行病原菌分離。

    1.2 供試藥劑

    98%咪鮮胺原藥、97%氟環(huán)唑原藥,安道麥輝豐(江蘇)有限公司;95%咯菌腈原藥、96%啶酰菌胺原藥、95%己唑醇原藥、95%氟硅唑原藥,山東濰坊潤豐化工股份有限公司;96%氟吡菌酰胺原藥,拜耳股份公司;98%肟菌酯、94%腈菌唑原藥、97%苯醚甲環(huán)唑原藥、98%噻呋酰胺原藥、96%嘧菌酯原藥,山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司。

    氟硅唑原藥以環(huán)己酮溶解,其它原藥以丙酮溶解,制備濃度為1%的母液,于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 病原菌的分離純化

    采用病組織分離法[4],在腐敗草莓果實的病健交界處切取組織小塊,75%酒精浸泡30 s后,以無菌水沖洗3次,接種于PDA培養(yǎng)基上,25℃黑暗培養(yǎng)3~5 d。待菌落形成后,在菌落邊緣挑取菌絲接種于新的PDA培養(yǎng)基上,進行純化。

    1.4 病原菌鑒定

    將純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基,25℃黑暗培養(yǎng)7 d,觀察菌落形態(tài);繼續(xù)培養(yǎng)至產(chǎn)孢后,采用光學顯微鏡觀察孢子形態(tài)。

    根據(jù)柯赫氏法則進行病原菌致病力測定[5]。選擇健康無傷口的草莓果實表面消毒后,置于濃度約為1×105個/mL的病原菌孢子懸浮液中浸泡30 s后取出,瀝干水分,置于保鮮盒中,室溫存放,記錄病害癥狀。

    以真菌全基因組DNA提取試劑盒提取菌絲基因組DNA,以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物進行PCR擴增[6]。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對,并采用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。

    1.5 殺菌劑室內(nèi)毒力測定

    采用生長速率法測定12種殺菌劑對病原菌的室內(nèi)毒力[8]。在預試驗確定試驗濃度范圍的基礎上,對供試藥劑母液進行梯度稀釋。其中咪鮮胺濃度為0.125、0.25、0.50、1.25、2.50 mg/L,咯菌腈、啶酰菌胺和氟吡菌酰胺濃度為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00 mg/L,其余藥劑濃度為0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 mg/L。

    在超凈工作臺上,采用移液器吸取1 mL各濃度藥液,加入49 mL滅菌后冷卻至50~60℃的PDA培養(yǎng)基中,充分搖勻后倒板,制成含藥PDA平板,每個濃度3次重復。在活化好的菌落邊緣,以直徑7 mm的打孔器打取菌餅,菌絲朝下接種于含藥PDA平板中央。以無菌水處理為對照,25℃黑暗培養(yǎng)5~7 d。待對照組菌落長至培養(yǎng)皿1/2以上時,以十字交叉法測定菌落直徑[9],計算各濃度藥液對菌絲生長的抑制率。采用SPSS 18.0計算毒力回歸方程和EC50值。以EC50值最高的藥劑為基準,計算其它藥劑的相對毒力指數(shù),比較病原菌對12種供試藥劑的敏感性差異。

    抑制率(%)=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-菌餅直徑)×100。

    2 結果與分析

    2.1 病原菌鑒定

    從自然腐敗的草莓果實上分離得到多株病原菌,選取具有代表性的菌株CH-4進行鑒定。在PDA平板上培養(yǎng)5 d后,菌落圓形,深棕色至褐色,菌絲致密,氣生菌絲較少(圖1)。分生孢子呈棒槌形,有縱橫分隔,分割處有縊縮(圖2)。

    圖1 CH-4菌株的菌落形態(tài)

    圖2 CH-4菌株的分生孢子

    病原菌孢子懸浮液接種至健康草莓果實2 d后出現(xiàn)腐敗癥狀,與原發(fā)病癥狀相同(圖3)。

    圖3 CH-4菌株回接癥狀

    采用ITS1/ITS4通用引物對菌株rDNA-ITS序列進行PCR擴增,得到長度為543 bp的DNA序列。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對發(fā)現(xiàn),其與枝孢屬(Cladosporium)相似度最高。通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),該菌株與多主枝孢菌(Cladosporium herbarum)的親緣關系最近,結合形態(tài)學特征,將其鑒定為多主枝孢菌。

    2.2 12種供試殺菌劑對多主枝孢菌的抑制率

    由表1可以看出,咪鮮胺對多主枝孢菌的抑制作用最高,濃度為0.125~2.50 mg/L時抑制率為18.40%~96.79%;其次為咯菌腈、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺,濃度為0.25~5.00 mg/L時,抑制率分別為26.06%~92.58%、22.53%~86.20%和16.61%~90.62%。己唑醇、腈菌唑和氟硅唑的作用效果也較好,濃度為0.50~10.00 mg/L時,抑制率分別為25.13%~93.87%、31.27%~81.28%和20.64%~92.41%。肟菌酯、噻呋酰胺、嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑和氟環(huán)唑的抑制活性較低,濃度為0.50~10.00 mg/L時,抑制率分別為11.52%~91.98%、11.02%~80.82%、7.70%~80.14%、13.80%~75.61%和15.44%~71.55%。

    表1 (續(xù))

    圖4 病原菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

    表1 12種殺菌劑對草莓果實多主枝孢菌菌絲生長的抑制率

    2.3 12種殺菌劑對多主枝孢菌的室內(nèi)毒力

    由表2可以看出,多主枝孢菌對咪鮮胺的敏感性最高,EC50值為0.341 mg/L,相較于氟環(huán)唑(EC50值=3.621)的相對毒力指數(shù)為10.62。其次為咯菌腈、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺,EC50值分別為0.672、0.769、0.884 mg/L,相對毒力指數(shù)分別為5.39、4.71和4.10。己唑醇、腈菌唑和氟硅唑的抑菌活性也較高,EC50值分別為1.243、1.457、1.603 mg/L,相對毒力指數(shù)分別為2.91、2.49和2.26。肟菌酯、噻呋酰胺、嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑的抑制活性較低,EC50值分別為2.025、2.649、3.043和3.432,相對毒力指數(shù)分別為1.79、1.37、1.19和1.06。

    表2 12種殺菌劑對草莓果實多主枝孢菌菌絲生長的室內(nèi)毒力

    3 討論與結論

    草莓屬非呼吸躍變型漿果,果實成熟后呼吸旺盛、采收后失重較快,在采摘、貯運和銷售過程中極易遭受微生物侵染而導致果肉腐敗,縮短貨架期[10]。抑制果實表面微生物的增殖是草莓采后保鮮領域的重要任務之一[11]。短波紫外線(UV-C)輻照處理能夠有效控制草莓果實貯藏期間病害的發(fā)生[12],但儀器使用成本較高,尚不能推廣普及。近年來生物保鮮劑越來越受到關注,包括天然的或利用生物工程技術改造而獲得的生物產(chǎn)品,如植物精油等[13],但其研究和開發(fā)尚處于起步階段[14]。

    本研究從自然腐敗的草莓果實中分離鑒定出1株多主枝孢菌,與甘瑾等[15]的結果一致。魏超等[16]報道,枝孢菌屬真菌更易引起草莓軟腐。通過室內(nèi)毒力測定發(fā)現(xiàn),分離得到的多主枝孢菌對咪鮮胺的敏感性最高,其次為咯菌腈、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺。中國農(nóng)藥信息網(wǎng)顯示,以上4種殺菌劑均已在草莓上獲得登記,其中450 g/L咪鮮胺水劑已登記可用于浸果處理,咯菌腈和氟吡菌酰胺在草莓上的安全間隔期為3 d,啶酰菌胺在草莓上的安全間隔期為7 d。

    農(nóng)藥的安全間隔期是指施用后至農(nóng)藥殘留量降低到最大允許殘留量所需要的間隔時間[17]。安全間隔期越短,果品安全性越高。綜合比較12種供試殺菌劑的抑菌活性和安全間隔期,我們認為防治草莓果實采后多主枝孢菌優(yōu)先選擇咪鮮胺采前噴施或采后浸果,其次為咯菌腈和氟吡菌酰胺采前不少于3 d噴施。

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