BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合生物陶瓷骨促進(jìn)兔橈骨缺損修復(fù)

韓操，張麗娜，顏南，王正東

（沈陽醫(yī)學(xué)院 1.附屬中心醫(yī)院手外科，沈陽 110024；2.附屬中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽 110024；3.醫(yī)學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院康復(fù)教研室，沈陽 110034；4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，沈陽 110034）

骨缺損是指由于外傷或手術(shù)造成的部分骨質(zhì)損傷或缺失，需要植骨等介入技術(shù)進(jìn)行修復(fù)的嚴(yán)重疾病。骨缺損可導(dǎo)致骨不連、患肢功能恢復(fù)差，甚至截肢［1］，因此急需研發(fā)骨缺損的修復(fù)方法。雙相陶瓷樣生物骨（biphasic ceramic-like biologic bone，BCBB）可修復(fù)動物橈骨缺損，有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)能力，是具有巨大潛力的異質(zhì)骨源性材料［2］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cell，BMSC）具有自我更新能力和多項(xiàng)分化潛能，能在不同條件下分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞等，是骨組織工程的理想種子細(xì)胞［3］。BMSC的分化進(jìn)程受多種細(xì)胞因子調(diào)控，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）是一種重要的骨誘導(dǎo)因子，可誘導(dǎo)BMSC成骨分化［4］。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是成纖維細(xì)胞生長因子家族的基本成員，可促進(jìn)BMSC的遷移、增殖和分化［5］。但是，目前關(guān)于BMP-2和bFGF轉(zhuǎn)染的BMSC對骨修復(fù)能力影響的研究較少。促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞（erythropoietin-producing hepatocyte，Eph）配體ephrin-B2是由破骨細(xì)胞表達(dá)的一種跨膜配體，與和它結(jié)合的酪氨酸激酶受體Eph受體B4（EphB4）共同控制骨穩(wěn)態(tài)。EphB4和ephrin-B2的相互作用產(chǎn)生雙向信號，影響表達(dá)EphB4的成骨細(xì)胞和表達(dá)ephrin-B2的破骨細(xì)胞，導(dǎo)致成骨細(xì)胞的形成增強(qiáng)，破骨細(xì)胞的形成受到抑制，共同導(dǎo)致骨形成。但EphB4/ephrin-B2的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，BCBB是否通過EphB4/ephrin-B2信號通路參與撓骨修復(fù)未見報(bào)道。

本研究將雙表達(dá)BMP-2/bFGF的慢病毒轉(zhuǎn)染兔BMSC后，將該細(xì)胞復(fù)合到陶瓷骨中，植入骨缺損兔體內(nèi)，探討動物模型中BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的BMSC復(fù)合生物陶瓷骨對骨缺損的治療作用，以及該作用與EphB4/ephrin-B2信號通路的關(guān)系，為臨床骨缺損的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 兔BMSC的分離培養(yǎng)

4月齡雌性新西蘭白兔購自北京維通利華公司，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉。切開腿部皮膚和肌肉層，取出股骨，去除軟組織，剪斷股骨，暴露髓腔。用含1%青鏈霉素的PBS沖洗，再用洗脫液洗脫，200目濾網(wǎng)過濾，500g離心10 min。去掉上清，加入DMEM培養(yǎng)基和等體積Percoll細(xì)胞分離液（北京索萊寶公司），重懸細(xì)胞，1 000g離心30 min。將細(xì)胞分離液液面中的細(xì)胞吸出，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通過免疫熒光檢測細(xì)胞CD44和CD34陽性率對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取上述培養(yǎng)、鑒定后的兔BMSC，用胰酶消化并鋪板，培養(yǎng)過夜后，將BMP-2/bFGF過表達(dá)的慢病毒（上海吉凱基因公司）滴加到細(xì)胞中，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；換液后繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后，加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，篩選后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證

通過Western blotting驗(yàn)證兔BMSC的BMP-2/bFGF基因轉(zhuǎn)染效率。收集細(xì)胞，將RIPA裂解液（上海碧云天公司）加入細(xì)胞中，冰上孵育30 min，超聲破碎儀超聲，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清，BCA試劑盒（上海碧云天公司）檢測蛋白濃度，加入蛋白緩沖液（上海碧云天公司），煮樣5 min，上樣于聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉；BMP-2（1∶1 000稀釋）和bFGF（1∶1 000稀釋）抗體（美國Abcam公司）4 ℃孵育過夜，PBST洗膜，山羊抗兔二抗（1∶5 000稀釋，美國Invitrogen公司）室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL試劑盒（上海碧云天公司）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，并使用Image J進(jìn)行灰度分析。

1.4 動物分組和取材

將50只4月齡新西蘭白兔隨機(jī)分為對照組（Control組）、模型組（Model組）、生物陶瓷骨組（BCBB組）、BMSC組（BCBB+BMSC組）和BMP-2/bFGF雙 基因轉(zhuǎn)染的BMSC組（BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組），每組10只。除Control組外，各組兔禁食12 h。免耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉麻醉，固定于手術(shù)臺，于前肢一側(cè)橈骨中段剪毛備皮。消毒后在橈骨外側(cè)剝離骨膜，暴露骨面，并用骨鉆垂直制造缺損。Model組不植入BCBB，BCBB組植入BCBB，BCBB+BMSC組植入與未轉(zhuǎn)染的BMSC復(fù)合的BCBB，BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組植入與BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的BMSC復(fù)合的BCBB。逐層縫合，術(shù)后連續(xù)7 d肌肉注射青霉素。繼續(xù)飼養(yǎng)，待造模后8周，脫頸椎法處死兔，取出缺損側(cè)橈骨組織，部分保存于-80 ℃，另一部分固定于4%多聚甲醛中。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測

對缺損部位撓骨組織中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor-2，Runx2）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和Ⅰ型膠原（collagen Ⅰ，Col Ⅰ）基因進(jìn)行PCR檢測，以GAPDH為內(nèi)參。骨組織中加入裂解液裂解后，收集各樣本于無酶EP管中，使用RNA試劑盒提取總RNA，并測定純度。再按照PrimeScriptTMRT reagent kit說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以稀釋后的cDNA為模版，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。PCR反應(yīng)條件：95 ℃起始變性30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性30 s。引物序列：ALP，F(xiàn) 5’-AACGTGGCCAAGAAC ATCATCA-3’，R 5’-TGTCCATCTCCAGCCGTGTC-3’；Runx2，F(xiàn) 5’-GCACCCAGCCCATAATAGA-3’，R 5’-T TGGAGCAAGGAGAACCC-3’；OPN，F(xiàn) 5’-CAAATAC CCAGATGCTGTGGC-3’，R 5’-TCCTGGCTGTCCAC ATGGTC-3’；Col Ⅰ，F(xiàn) 5’-AGGGCTCCAACGAGATC GAGA-3’，R 5’-AGGAAGCAGACAGGGCCA-3’；GAPDH，F(xiàn) 5’-CAGGGCTGCCTTCTCTTGT-3’，R 5’-T CCCGTTGATGACCAGCTTC-3’。

1.6 HE染色

將4%多聚甲醛固定的橈骨組織在15% EDTA溶液中浸泡3周，每5 d更換1次EDTA溶液。蒸餾水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明及石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。實(shí)驗(yàn)前60 ℃烘干切片4 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水洗滌。蘇木素染色，自來水洗滌，1 %鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，碳酸鋰返藍(lán)，流水沖洗，伊紅染色。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將上述石蠟切片依次放入二甲苯和梯度乙醇中脫蠟至水，EDTA緩沖液微波抗原修復(fù)，恢復(fù)至室溫后，PBS洗滌3次，驢血清室溫封閉30 min，Col Ⅰ、OPN抗體（1∶100稀釋，英國Abcam公司）4 ℃過夜孵育，第2天PBS洗滌3次，山羊抗兔熒光二抗（1∶3 000，英國Abcam公司）室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，DAPI染色15 min，PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 Western blotting

將RIPA裂解液（上海碧云天公司）加入骨膜組織中，冰上孵育30 min，勻漿機(jī)勻漿，后續(xù)步驟與上述轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證一致，所用抗體為EphB4和ephrin-B2（1∶1 000，英國Abcam公司）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析和Tukey事后檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔BMSC的分離和鑒定

分離后的BMSC經(jīng)免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的兔BMSC表面CD44表達(dá)為陽性，CD34表達(dá)為陰性。見圖1。

圖1 兔BMSC的免疫熒光鑒定 ×100Fig.1 Identification of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells by immunofluorescence ×100

2.2 BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染兔BMSC

慢病毒轉(zhuǎn)染后的BMSC經(jīng)Western blotting鑒定，發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中BMP-2和bFGF蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 Western blotting檢測雙基因轉(zhuǎn)染兔BMSC后BMP-2和bFGF的表達(dá)Fig.2 Post transfection identification of BMP-2 and bFGF in rabbit bone marrow stem cells by Western blotting

2.3 BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的兔BMSC復(fù)合生物陶瓷骨對橈骨Runx2、Col Ⅰ、ALP、OPN表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組兔橈骨組織Runx2、Col Ⅰ、ALP、OPN表達(dá)水平顯著降低（P＜ 0.05）；與Model組相比，BCBB組、BCBB+BMSC組、BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織Runx2、Col Ⅰ、ALP、OPN表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與BCBB組和BCBB+BMSC組相比，BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織Runx2、Col Ⅰ、ALP、OPN表達(dá)水平顯著升高（P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 Runx2、Col Ⅰ、ALP和OPN在兔橈骨組織中的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression of Runx2，Col Ⅰ，ALP，and OPN in rabbit radius

2.4 BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的兔BMSC復(fù)合生物陶瓷骨對橈骨Lane-Sandhu組織學(xué)評分的影響

與Control組相比，Model組兔橈骨組織Lane-Sandhu組織學(xué)評分顯著降低（P＜ 0.05）；與Model組相比，BCBB組、BCBB+BMSC組和BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織Lane-Sandhu組織學(xué)評分顯著升高（P＜0.05）；與BCBB組和BCBB+BMSC組相比，BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織Lane-Sandhu組織學(xué)評分顯著升高（P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 兔撓骨Lane-Sandhu組織學(xué)評分Fig.4 Lane-Sandhu histological scores of rabbit radius

2.5 BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的兔BMSC復(fù)合生物陶瓷骨對橈骨組織形態(tài)的影響

采用HE染色檢測骨組織形態(tài)。Control組兔橈骨組織骨細(xì)胞排列整齊，組織結(jié)構(gòu)正常；Model組兔橈骨組織可見纖維結(jié)締組織填充缺損區(qū)，無成骨表現(xiàn)；BCBB組和BCBB+BMSC組兔橈骨組織可見大量條索狀板層骨形成，骨細(xì)胞排列整齊；BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織可見骨板層呈同心圓排列，骨小梁粗大，破骨細(xì)胞增生活躍。見圖5。

圖5 兔撓骨形態(tài)學(xué)觀察 ×100Fig.5 Rabbit radial tissue morphology ×100

2.6 BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的兔BMSC復(fù)合生物陶瓷骨對橈骨Col Ⅰ和OPN表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組兔橈骨組織Col Ⅰ和OPN表達(dá)顯著降低（P＜ 0.05）；與Model組相比，BCBB組、BCBB+BMSC組、BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織Col Ⅰ和OPN和表達(dá)顯著升高（P＜ 0.05）；與BCBB組和BCBB+BMSC組相比，BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織Col Ⅰ和OPN表達(dá)顯著升高（P＜ 0.05）。見圖6。

圖6 兔撓骨中Col Ⅰ和OPN的免疫熒光結(jié)果 ×400Fig.6 Col Ⅰ and OPN in rabbit radial bone visualized by immunofluorescence ×400

2.7 BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的兔BMSC復(fù)合生物陶瓷骨對橈骨骨膜EphB4和ephrin-B2水平的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組兔橈骨組織骨膜EphB4和ephrin-B2水平顯著降低（P＜ 0.05）；與Model組相比，BCBB組、BCBB+BMSC組骨組織中EphB4和ephrin-B2水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與Model組、BCBB組 和BCBB+BMSC組 相 比，BCBB+BMSC+BMP-2/bFGF組兔橈骨組織中EphB4和ephrin-B2水平顯著升高（P＜ 0.05）。

3 討論

目前，大面積骨缺損的治療仍是臨床難題，自體骨移植和異體骨移植是兩種主要治療方法，但它們都有一些難以克服的缺點(diǎn)。在過去的幾十年里，人們開發(fā)了大量人工合成生物材料用于修復(fù)骨缺損。其中，基于磷酸鈣的生物陶瓷是最有前途的用于臨床的生物材料，它們具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性。雖然在不添加任何生長因子或細(xì)胞的情況下，骨誘導(dǎo)多孔磷酸鈣陶瓷可用于治療動物的大面積骨缺損，在一定程度上可與自體骨移植相媲美，但其在促進(jìn)骨細(xì)胞分化和成骨方面的療效還有待開發(fā)。

圖7 Western blotting檢測兔撓骨骨膜中EphB4和ephrin-B2的表達(dá)水平Fig.7 Levels of EphB4 and ephrin-B2 in rabbit radial periosteum

近年來，與干細(xì)胞復(fù)合形成的組織工程骨的研發(fā)與應(yīng)用受到關(guān)注。由于BMSC具有多向分化能力，因此被作為組織工程的種植細(xì)胞用于臨床研究，但BMSC移植后僅部分轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞，存在成骨能力較弱等缺點(diǎn)［6］。因此，增強(qiáng)BMSC的成骨分化并提高其成骨效率是目前亟待解決的問題。BMP-2是最有效的骨誘導(dǎo)蛋白之一，它促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，從而促進(jìn)骨修復(fù)；bFGF在細(xì)胞增殖和血管生成中發(fā)揮重要作用，是骨修復(fù)過程中的關(guān)鍵因子［7］。因此，本研究采用慢病毒載體方法雙轉(zhuǎn)染BMP-2和bFGF到兔BMSC中，成功建立了穩(wěn)定過表達(dá)BMP-2和bFGF的BMSC。將該細(xì)胞與陶瓷骨復(fù)合后植入骨缺損兔體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的BMSC復(fù)合生物陶瓷骨能夠顯著改善撓骨缺損情況，同時(shí)上調(diào)缺損橈骨組織Runx2、ALP、OPN和ColⅠ的表達(dá)，促進(jìn)組織再生修復(fù)，提高Lane-Sandhu組織學(xué)評分，提示BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的BMSC可顯著增加BMSC對骨缺損的修復(fù)作用。

ColⅠ是骨中最豐富的有機(jī)基質(zhì)成分，是骨的主要組成成分［8］。OPN是一種細(xì)胞外酸性蛋白，對正常的早期愈合組織形成和新生血管是必要的［9］。ALP是參與骨組織礦物形成的糖蛋白，是參與骨形成的重要因子［10］。Runx2被認(rèn)為是骨發(fā)育和成骨細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子之一［11-12］。本研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的BMSC復(fù)合生物陶瓷骨增加缺損橈骨組織中Runx2、ColⅠ、ALP和OPN的表達(dá)，提示BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的BMSC可增加BMSC對成骨的促進(jìn)作用。

EphB4/ephrin-B2信號通路是骨改建過程中成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞間信號傳遞的一條新通路，這條信號通路是通過破骨細(xì)胞表面表達(dá)的ephrin-B2和成骨細(xì)胞表達(dá)的EphB4跨膜蛋白受體間產(chǎn)生雙向信號傳導(dǎo)，從而實(shí)現(xiàn)信息的傳遞和互相調(diào)控。Ephrin-B2通過c-Fos/NFATc1抑制破骨細(xì)胞功能，而EphB4通過Dlx5、Osx和Runx2促進(jìn)成骨細(xì)胞功能。EphB4通過增強(qiáng)RhoA的活性，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化。EphB4/ephrin-B2參與的信號通路促進(jìn)骨形成，同時(shí)抑制過度的骨吸收，因而對于維持骨體內(nèi)平衡起至關(guān)重要的作用［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的BMSC復(fù)合生物陶瓷骨增加缺損橈骨組織中ephrin-B2和EphB4的表達(dá)，提示BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的BMSC 可能通過激活EphB4/ephrin-B2信號通路發(fā)揮促進(jìn)成骨的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BMP-2/bFGF雙基因轉(zhuǎn)染的BMSC復(fù)合生物陶瓷骨對兔橈骨缺損存在修復(fù)作用，其機(jī)制與激活骨組織中的EphB4/ephrin-B2信號通路有關(guān)。