基于CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻細(xì)胞質(zhì)分裂關(guān)鍵基因OsMAP65-3s的編輯

林小麗 姜志樹 賀 榕 胡嘉敏 朱昌蘭 周大虎 賀浩華 徐 杰

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江西省超級稻工程技術(shù)研究中心/雙季稻現(xiàn)代化生產(chǎn)協(xié)同中心，江西 南昌 330045)

細(xì)胞分裂是植物發(fā)育中重要的生理過程，細(xì)胞在該階段由一個(gè)分裂成兩個(gè)子細(xì)胞。細(xì)胞分裂既調(diào)控植物器官的大小，也為植物適應(yīng)多種環(huán)境提供可塑性。細(xì)胞質(zhì)分裂發(fā)生在減數(shù)分裂或有絲分裂的后期至末期，此過程是細(xì)胞一分為二形成子細(xì)胞的關(guān)鍵，也是高等植物和動(dòng)物正常生長發(fā)育以及繁衍后代的重要環(huán)節(jié)[1]。細(xì)胞分裂后期，紡錘絲將染色體拉向細(xì)胞兩極，然后子核開始形成，兩個(gè)子核之間增加了許多短的紡錘絲，形成一個(gè)密集著紡錘絲的桶狀區(qū)域，稱為成膜體。成膜體是體細(xì)胞中有絲分裂細(xì)胞的一個(gè)反平行微管陣列，反映動(dòng)態(tài)微管網(wǎng)絡(luò)最顯著的特征之一[2]。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入到分裂末期，桶狀成膜體外圍的微管聚合，而中間的微管發(fā)生解聚，成膜體圍繞著生長的細(xì)胞板向外呈放射狀擴(kuò)張，變成環(huán)狀結(jié)構(gòu)[3-4]。

成膜體微管呈現(xiàn)了非常不穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)，這也是成膜體膨脹、細(xì)胞板合成所必需的。成膜體微管的排列組裝還需要許多具有特定能力(如微管成核、聚合、成束等)的調(diào)節(jié)因子參與，而微管成束過程由微管交聯(lián)蛋白MAP65家族二聚化介導(dǎo)[5-6]。植物MAP65蛋白最早純化自煙草BY-2細(xì)胞，大小為65 kD，該蛋白具有微管結(jié)合活性，在整個(gè)細(xì)胞周期中與BY-2細(xì)胞中的微管共定位[7]。Chan等[8]從胡蘿卜細(xì)胞骨架中純化出兩種MAP65蛋白，均對細(xì)胞微管有修飾作用。在擬南芥基因組中存在9個(gè)MAP65家族成員，通過蛋白序列比對，表明上述蛋白的氨基酸水平與煙草MAP65蛋白有28%～79%的同源性[9]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)所有MAP65家族成員都可作為微管成束因子，但家族成員的表達(dá)模式、細(xì)胞定位和靶標(biāo)微管都存在差異，表明其在細(xì)胞內(nèi)的功能可能不一樣[10-11]。MAP65-1和MAP65-2組成型表達(dá)于所有被檢測的細(xì)胞[12]，而AtMAP65-4定位于分裂后期的紡錘絲中間以及成膜體中，Damme等[13]研究觀察根尖分生組織的分裂過程，發(fā)現(xiàn)該蛋白于早前期帶(preprophase band，PPB)時(shí)期開始表達(dá)，并一直持續(xù)到細(xì)胞質(zhì)分裂完成。AtMAP65-6定位于線粒體，可能參與細(xì)胞器與微管之間的互作[14]。MAP65-3是細(xì)胞質(zhì)分裂特異的MAP65家族成員，與其他家族成員不同，AtMAP65-3只與成膜體微管結(jié)合，并集中于微管的正極，即位于成膜體中線區(qū)域[11,15]，是調(diào)節(jié)植物胞質(zhì)分裂的重要因子。atmap65-3突變體植株矮小，生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響，進(jìn)一步通過細(xì)胞學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)突變體成膜體中間區(qū)域變得更寬，微管束排列松散，且高達(dá)40%細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)分裂出現(xiàn)問題，突變體根系發(fā)育受到影響[15-16]。

水稻(OryzasativaL.)是我國最重要的糧食作物之一，也是單子葉模式植物。系統(tǒng)研究水稻細(xì)胞分裂不僅可以補(bǔ)充和豐富植物有絲分裂的分子調(diào)控機(jī)制，也可以為調(diào)控水稻發(fā)育提供新的思路。但是，由于細(xì)胞分裂對植物發(fā)育的重要性(突變易致死)以及家族成員功能冗余(突變無表型)，導(dǎo)致水稻細(xì)胞分裂突變體難以獲得，相關(guān)的研究無法開展。目前，水稻細(xì)胞分裂的相關(guān)研究較少，尤其是胞質(zhì)分裂過程的相關(guān)研究幾乎空白。由于MAP65-3是調(diào)控細(xì)胞板的合成及細(xì)胞質(zhì)分裂的關(guān)鍵因子，因此水稻中MAP65-3同源蛋白是開展水稻細(xì)胞分裂工作的突破口。水稻中包含11個(gè)MAP65成員[17]，其中LOC_Os01g49200和LOC_Os05g47970與AtMAP65-3同源性最高，其氨基酸同源性分別高達(dá)55%和53%，分別命名為OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2。江西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理生態(tài)與遺傳育種實(shí)驗(yàn)室前期通過首創(chuàng)的煙草葉片瞬時(shí)分裂系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2定位于成膜體中線區(qū)域，表明水稻中的2個(gè)基因可能與擬南芥AtMAP65-3基因功能相似，在胞質(zhì)分裂中通過調(diào)控成膜體微管動(dòng)態(tài)參與水稻生長發(fā)育。因此，創(chuàng)制和獲得水稻MAP65-3基因突變體是開展功能研究的首要任務(wù)，對闡明水稻細(xì)胞分裂和胞質(zhì)分裂調(diào)控機(jī)理十分必要。

本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻OsMAP65-3.1 和OsMAP65-3.2進(jìn)行同時(shí)編輯，高效、快速、特異地創(chuàng)制單基因突變體和雙基因突變體。分別針對2個(gè)基因設(shè)計(jì)特異性靶位點(diǎn)，構(gòu)建至同一個(gè)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株，測序分析靶位點(diǎn)序列，篩選編輯植株和突變體，旨在為探討OsMAP65-3基因的功能和水稻細(xì)胞分裂調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及田間管理

大腸桿菌DH5α，感受態(tài)采用CaCl2法，參照《基因工程》[18]的方法制備。農(nóng)桿菌EHA105，感受態(tài)采用Milani等[19]的方法制備。

植物材料為粳稻品種日本晴(Nipponbare)，轉(zhuǎn)基因材料均種于人工氣候室，培養(yǎng)條件如下：28℃光照培養(yǎng)12 h，25℃黑暗培養(yǎng)12 h，光照強(qiáng)度為10 000 lx。

1.2 sgRNA設(shè)計(jì)

參考CRISPRdirect數(shù)據(jù)庫(http://crispr.dbcls.jp/)設(shè)計(jì)OsMAP65-3s的特異靶位點(diǎn)。對OsMAP65-3.1 與OsMAP65-3.2的編碼區(qū)序列進(jìn)行掃描分析，以原間隔子鄰近序列(protospacer adjacent motifs，PAM)前20堿基作為候選位點(diǎn)，日本晴全基因組為參考序列，選擇特異性高的序列為靶位點(diǎn)，靶位點(diǎn)選擇靠近目標(biāo)基因5′端，旨在提高無功能蛋白的發(fā)生概率從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因敲除。

1.3 載體構(gòu)建

以pENTR-sg4作為入門載體(圖1-A)，pUbi-Cas9作為目標(biāo)載體(圖1-B)，使用Gateway重組系統(tǒng)構(gòu)建OsMAP65-3.1與OsMAP65-3.2雙基因敲除載體。首先，針對每一個(gè)設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)，合成兩條反向互補(bǔ)核苷酸單鏈，分別在5′端添加TGTT和AAAC(pENTR-sg4載體BtgZ I消化形成的突出末端)或GTGT和AAAC(pENTR-sg4載體BsaI消化形成的突出末端)，退火復(fù)性形成帶粘性末端的靶位點(diǎn)雙鏈片段；其次，用BtgZ I線性化pENTR-sg4入門載體，使用DNA連接酶將第一個(gè)基因靶位點(diǎn)片段整合，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR檢測后測序；然后，用BsaI線性化中間載體(已插入第一個(gè)基因靶位點(diǎn)的入門載體)，通過連接插入第二個(gè)基因靶位點(diǎn)片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR檢測后測序；最后，利用LR重組酶，將插入2個(gè)基因靶位點(diǎn)片段入門載體與pUbi-Cas9目標(biāo)載體進(jìn)行重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR檢測后測序。

注：A:入門載體PENTR4-sg；B:目標(biāo)載體pUbi-Cas9。OsU6:水稻U6啟動(dòng)子；Zmubi-p:玉米Ubi啟動(dòng)子；LB:Ti質(zhì)粒左邊界；RB:Ti質(zhì)粒右邊界；OsCas9:水稻密碼子優(yōu)化的Cas9基因；KanR:卡那抗性標(biāo)記；HygR:潮霉素抗性標(biāo)記。Note: A:The entry vector pENTR4-sg. B:The destination vector pUbi-Cas9. OsU6: Rice U6 promoter. Zmubi-p: Maize Ubi Promoter. LB: Ti vetor left border. LB: Ti vetor right border. OsCas9:Rice codon optimized cas9. KanR: Kanamycin resistant gene. HygR: Hygromycin resistant gene. 圖1 基因編輯載體結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of gene editing vectors

1.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

采用凍融法[20]轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。用CaCl2法處理EHA105農(nóng)桿菌菌株，制備感受態(tài)。將5 μg構(gòu)建好的CSMAP65-3A和CSMAP65-3B質(zhì)粒分別加入感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴 30 min后液氮迅速冷凍3 min，37℃水浴5 min，加入1 mL農(nóng)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)基(yeast mannitol medium, YEB)液體培養(yǎng)基，置28℃轉(zhuǎn)速200 r·min-1搖床恢復(fù)培養(yǎng)3 h。取200 μL 培養(yǎng)物，在YEB固體培養(yǎng)基(卡那霉素+利福平)上篩選培養(yǎng)，于28℃培養(yǎng)3 d后，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定。

1.5 水稻轉(zhuǎn)化

選用300粒日本晴種子，去殼后用75%乙醇表面消毒1 min，次氯酸鈉溶液消毒30 min，移至營養(yǎng)肉湯(nutrien broth, NB)培養(yǎng)基(含2 mg·L-1的2，4-二氯苯氧乙酸2,4-D)，26℃暗培養(yǎng)2周，挑選生長狀況好的愈傷用作轉(zhuǎn)化外植體；制備純度高，生活力強(qiáng)的EHA105工程菌液，浸染水稻愈傷后，在25℃暗條件下共培養(yǎng)3 d；脫菌后在含有50 mg·L-1潮霉素的篩選培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)14 d左右(光照強(qiáng)度為13 200 lx，溫度為32℃)；將預(yù)分化的愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)1個(gè)月左右(光照強(qiáng)度為13 200 lx，溫度為32℃)，得到抗性轉(zhuǎn)基因植株；用1/2 MS培養(yǎng)基生根壯苗獲得T0代植株。

1.6 基因編輯情況分析

用CTAB法[21]提取T0代轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA，通過檢測載體上抗潮霉素基因(HPTⅡ)確定轉(zhuǎn)基因陽性植株。用HPTⅡ特異引物Hyg-F(T C T C C G A C C T G A T G C A G C T C T CG)和Hyg-R(G C A C T G A C G G T G T C G T C C A T C A C AG)進(jìn)行PCR檢測。PCR擴(kuò)增10 μL體系如下：模板DNA 1 μL，10×Buffer 1 μL，dNTP 0.4 μL，引物(F+R)各0.5 μL，Taq酶0.05 μL，ddH2O 6.55 μL。PCR程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，27個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。

針對靶位點(diǎn)附近序列設(shè)計(jì)引物，對轉(zhuǎn)基因陽性植株的OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2進(jìn)行克隆及測序分析。采用高保真酶KOD-Fx酶(日本東洋紡公司TOYOBO生產(chǎn))進(jìn)行PCR反應(yīng)，KOD酶錯(cuò)配率低，可提高試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。PCR擴(kuò)增20 μL體系如下：模板DNA 2 μL，2×Buffer 10 μL，dNTP 1 μL，引物(F+R)各1 μL，KOD酶0.5 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；68℃終延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻MAP65-3s同源蛋白分析

水稻中MAP65-3基因的來源用AtMAP65-3氨基酸序列在美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，證實(shí)水稻中的2個(gè)基因(LOC_Os01g49200和LOC_Os05g47970)與AtMAP65-3同源性最高，同源性分別高達(dá)55%和53%(圖2)，且2個(gè)基因之間的同源性高達(dá)74%。LOC_Os01g49200(OsMAP65-3.1)基因包含13個(gè)外顯子，蛋白質(zhì)編碼區(qū)(coding sequence, CDS)全長2 070 bp，編碼689個(gè)氨基酸；而LOC_Os05g47970(OsMAP65-3.2)同樣包含13個(gè)外顯子，CDS全長1 989 bp， 編碼662個(gè)氨基酸。

植物MAP65蛋白包含一個(gè)相對保守的N端和一個(gè)保守性較差的C端，C端又分為C1和C2區(qū)，靠近C端的C2區(qū)保守性最差。N端是蛋白質(zhì)形成二聚體所必需的功能結(jié)構(gòu)域，C端是微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域[21]。進(jìn)一步的比對結(jié)果也證明OsMAP65-3.1、OsMAP65-3.2與AtMAP65-3在N端(均為61%)和C1區(qū)同源性較高(分別64%和65%)，而在C2區(qū)同源性相對較低(42%和35%)。

2.2 OsMAP65-3s sgRNA靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

對OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2編輯，依據(jù)靠近5′端和高特異性的原則，各設(shè)計(jì)了2個(gè)20 bp的靶位點(diǎn)，分別為CS3.1-1和CS3.1-2、CS3.2-1和CS3.2-2，序列信息見表1。CS3.1-1和CS3.1-2分別位于OsMAP65-3.1基因CDS的42～61和161～180；CS3.2-1和CS3.2-2分別位于OsMAP65-3.2基因CDS的221～240和468～487。4個(gè)靶位點(diǎn)均在對應(yīng)基因的N端區(qū)域，編輯易產(chǎn)生無功能蛋白。此外，這些靶位點(diǎn)的特異性非常高，每一個(gè)靶位點(diǎn)的20個(gè)堿基序列在水稻基因組中都是唯一的；為考慮脫靶因素產(chǎn)生其他編輯，僅用12堿基作為靶序列進(jìn)行基因組比對分析，每個(gè)靶位點(diǎn)也是唯一的；以8堿基作為靶序列的位點(diǎn)也較少，都在700之下。分析結(jié)果表明本研究所設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)特異性極高，脫靶概率極低，可特異編輯并產(chǎn)生無功能的OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2。

表1 OsMAP65-3s靶位點(diǎn)相關(guān)信息Table 1 The information of target sites for OsMAP65-3s

2.3 OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2雙基因編輯載體構(gòu)建

由于OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2同源性較高，并均定位于成膜體中線，可能具有相似的功能。為避免兩者的功能冗余現(xiàn)象，將兩個(gè)基因的sgRNA構(gòu)建至同一載體上，以獲得單基因和雙基因同時(shí)編輯的植株。為構(gòu)建雙基因編輯載體，根據(jù)入門載體pENTR-4sg特征，利用單鏈合成和退火復(fù)性形成雙鏈，將靶位點(diǎn)CS3.1-1 和CS3.2-1 序列帶上BtgZ I酶切后的粘性末端序列，CS3.1-2和CS3.2-2序列帶上BsaI酶切后的粘性末端序列(圖3-A、B)。通過酶切連接法先將CS3.2-1和CS3.1-1分別整合到PENTR4-sg 載體BtgZ I位點(diǎn)，再將CS3.1-2和CS3.2-2 分別整合到對應(yīng)中間載體的BsaI位點(diǎn)，構(gòu)建入門載體PENTR4-sgMAP65-3A和PENTR4-sgMAP65-3B。PENTR4-sgMAP65-3A包含靶向CS3.2-1和CS3.1-2的sgRNA，PENTR4-sgMAP65-3B則包含靶向CS3.1-1 和CS3.2-2 的sgRNA。采用PCR技術(shù)對兩個(gè)入門載體陽性克隆檢測，前者用OsMAP65-3.2-pENTR-sg4-OsMAP65-3.1-2-R1作為引物，后者用OsMAP65-3.1-1-F1/OsMAP65-3.2-2-R1作引物(表2)。結(jié)果表明所檢測的菌落均能擴(kuò)增出片段，說明兩個(gè)靶位點(diǎn)均已同時(shí)整合到載體上，陽性菌落測序結(jié)果也證實(shí)了入門載體構(gòu)建成功。通過LR重組反應(yīng)將對應(yīng)片段整合到目標(biāo)載體pUbi-Cas9，形成兩個(gè)雙基因編輯載體，分別為CSMAP65-3A和CSMAP65-3B。雙基因編輯載體中包含OsU6.1和OsU6.2啟動(dòng)子指導(dǎo)的OsMAP65-3.1sgRNA和OsMAP65-3.2sgRNA，以及玉米Ubi啟動(dòng)子指導(dǎo)的Cas9基因等重要結(jié)構(gòu)(圖2-C、D)，確保OsMAP65-3.1sgRNA、OsMAP65-3.2sgRNA和Cas9在水稻中表達(dá)。

注： A: CSMAP65-3A載體結(jié)構(gòu)圖；B: CSMAP65-3B載體結(jié)構(gòu)圖；C:CSMAP65-3A載體菌落檢測圖； D: CSMAP65-3B載體菌落檢測圖。OsU6：水稻U6啟動(dòng)子； LB：Ti質(zhì)粒左邊界；RB：Ti質(zhì)粒右邊界；OsCas9：水稻密碼子優(yōu)化的Cas9基因； Hyg：潮霉素抗性標(biāo)記。Note: A: Structure of CSMAP65-3A. B: Structure of CSMAP65-3B. C: Positive clone selection for CSMAP65-3A by PCR. D: Positive clone selection for CSMAP65-3B by PCR. OsU6: Rice U6 promoter. LB: Ti vetor left border. RB: Ti vetor right border. OsCas9: Rice codon optimized Cas9. Hyg: Hygromycin resistant gene.圖3 OsMAP65-3s雙基因編輯載體構(gòu)建Fig.3 Construction of double-gene-editing vectors for OsMAP65-3s

2.4 轉(zhuǎn)基因植株鑒定

用含有OsMAP65-3s雙基因編輯載體(CSMAP65-3A、CSMAP65-3B)的EHA105菌株制備的工程菌液轉(zhuǎn)化水稻，分別獲得17和21株轉(zhuǎn)基因植株。用篩選標(biāo)記抗潮霉素基因HPTII特異引物Hyg-F和Hyg-R對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定，以載體質(zhì)粒為模板做陽性對照，野生型日本晴DNA為模板做陰性對照。其中CSMAP65-3A載體獲得16株陽性轉(zhuǎn)基因植株，僅有#5株系為陰性植株(圖4-A)；而CSMAP65-3B載體也僅有#5植株表現(xiàn)為陰性，其他20株均為陽性植株(圖4-B)。鑒定結(jié)果表明兩個(gè)載體轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)化效率均較高，可獲得足夠的轉(zhuǎn)基因株系供后續(xù)基因編輯分析。

注：A: 轉(zhuǎn)CSMAP65-3A植株HPT Ⅱ鑒定圖，1-17泳道代表CSMAP65-3A對應(yīng)的17株轉(zhuǎn)基因植株； B：轉(zhuǎn)CSMAP65-3B植株HPT Ⅱ鑒定圖，1-21代表CSMAP65-3B對應(yīng)的21株轉(zhuǎn)基因植株?！?”代表以載體質(zhì)粒為模板的陽性對照，“-”代表以野生型日本晴為模板的陰性對照。Note： A: HPT Ⅱ identification in CSMAP65-3A transgenic plants, 1-17 lane represents 17 transgenic plants corresponding to CSMAP65-3A. B: HPT Ⅱ identification in CSMAP65-3B transgenic plants. 1-21 represents 21 transgenic plants corresponding to CSMAP65-3B. ‘+’ represents positive control with vector plasmid as template. ‘-’ represents negative control with wild-type Nipponbare as template.圖4 轉(zhuǎn)基因株系潮霉素抗性基因HPT ⅡPCR鑒定Fig.4 Identification of HPT Ⅱ in transgenic lines by PCR

2.5 靶位點(diǎn)序列克隆

為分析轉(zhuǎn)基因植株中OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2基因編輯情況，用高保真酶克隆靶位點(diǎn)附近片段。由于OsMAP65-3.1基因的2個(gè)靶位點(diǎn)(CS3.1-1和CS3.1-2)在該基因DNA序列位置距離僅99 bp，可共用一對引物克隆目標(biāo)片段，即SQ-OsMAP65-3.1-F/SQ-OsMAP65-3.1-R；而OsMAP65-3.2 2個(gè)靶位點(diǎn)(CS3.2-1和CS3.2-2)在染色體位置相差857 bp，克隆需設(shè)計(jì)不同引物，分別為SQ-OsMAP65-3.2-1-F/SQ-OsMAP65-3.2-1-R和SQ-OsMAP65-3.2-2-F/SQ-OsMAP65-3.2-2-R(表3)。提取CSMAP65-3A和CSMAP65-3B轉(zhuǎn)基因株系DNA，用對應(yīng)引物對靶位點(diǎn)序列進(jìn)行克隆，通過PCR反應(yīng)獲得所有株系對應(yīng)位置的OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2片段，用于測序及編輯情況分析。

表3 OsMAP65-3s各靶位點(diǎn)片段克隆引物Table 3 Primers of target sites for OsMAP65-3s

2.6 OsMAP65-3s編輯情況分析

以野生型序列作為參考，通過測序峰圖讀取，可分析出每條染色體被編輯的情況。對CSMAP65-3A、CSMAP65-3B轉(zhuǎn)基因株系中各靶位點(diǎn)附近序列的測序峰圖進(jìn)行分析，重點(diǎn)考查正常峰圖結(jié)果(單峰)是否存在個(gè)別位點(diǎn)的套峰(雜合)以及雙染色純合編輯情況，雙峰結(jié)果是一條染色體被編輯還是兩條染色體都被編輯(不同編輯形式)。如CSMAP65-3A轉(zhuǎn)基因#3植株和CSMAP65-3B轉(zhuǎn)基因#3植株，其OsMAP65-3.1與OsMAP65-3.2相應(yīng)靶位點(diǎn)附近序列測序結(jié)果均表現(xiàn)為雙峰(圖6)。在CSMAP65-3A-#3中，OsMAP65-3.1兩條染色體均被編輯，其中一條缺失2個(gè)堿基，氨基酸發(fā)生移碼并提前終止，而另外一條染色體發(fā)生單堿基替換，導(dǎo)致其保守區(qū)氨基酸發(fā)生改變，可能會(huì)影響蛋白功能，需后期繼續(xù)研究；OsMAP65-3.2同樣有兩條染色體均被編輯，其中一條插入1個(gè)堿基，導(dǎo)致氨基酸移碼并提前終止，另外一條染色體發(fā)生3堿基缺失，在較不保守區(qū)域缺失1氨基酸，推測可能不影響蛋白功能。在CSMAP65-3B-#3株系的OsMAP65-3.1與OsMAP65-3.2基因在兩條染色體均被編輯，兩者編輯形式分別是缺失3堿基/插入1堿基和插入2堿基/缺失4堿基、插入1堿基(圖6)。

注：CSMAP65-3A 17株轉(zhuǎn)基因植株中OsMAP65-3.2-1靶位點(diǎn)區(qū)域片段克隆(A)和OsMAP65-3.1-2靶位點(diǎn)區(qū)域片段克隆(B)；CSMAP65-3B 21株轉(zhuǎn)基因植株中OsMAP65-3.1-1靶位點(diǎn)區(qū)域片段克隆(C)和OsMAP65-3.2-2靶位點(diǎn)區(qū)域片段克隆(D)。Note：Cloning of OsMAP65-3.2-1 target region fragment (A) and cloning of OsMAP65-3.1-2 target region fragment (B) in 17 CSMAP65-3A transgenic plants. Cloning of OsMAP65-3.1-1 target region fragment (C) and cloning of OsMAP65-3.1-2 target region fragment (D) in 21 CSMAP65-3A transgenic plants. 圖5 轉(zhuǎn)基因植株中OsMAP65-3s靶位點(diǎn)區(qū)域片段克隆Fig.5 Cloning of target sites for OsMAP65-3s in transgenic plants

注：CSMAP65-3A轉(zhuǎn)基因3號株系OsMAP65-3.2-1位點(diǎn)編輯情況(A)和OsMAP65-3.1-2位點(diǎn)編輯情況(B)；CSMAP65-3B轉(zhuǎn)基因3號株系OsMAP65-3.1-1位點(diǎn)編輯情況(C)和OsMAP65-3.2-2位點(diǎn)編輯情況(D)。Note：The edition of OsMAP65-3.2-1 site (A) and OsMAP65-3.1-2 site (B) in CSMAP65-3A transgenic plants (#3). The edition of OsMAP65-3.1-1 site (C) and OsMAP65-3.2-2 site (D) in CSMAP65-3B transgenic plants (#3).圖6 部分轉(zhuǎn)基因植株中OsMAP65-3s靶位點(diǎn)編輯分析Fig.6 The edition of target sites for OsMAP65-3s in transgenic plants

對全部轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行分析(表4、5)，發(fā)現(xiàn)在16個(gè)CSMAP65-3A陽性轉(zhuǎn)基因株系中，有3個(gè)株系發(fā)生了基因編輯，其中2株的兩個(gè)基因均發(fā)生編輯；其中2個(gè)單株中OsMAP65-3.1-2位點(diǎn)被編輯(3個(gè)編輯事件，2株都有一條染色體為移碼終止)，編輯效率為9.38%；3個(gè)株系OsMAP65-3.2-1位點(diǎn)被編輯，其中2株兩條染色體均被編輯，包含5個(gè)編輯事件，4個(gè)為移碼終止，編輯效率為15.62%。在20株CSMAP65-3B的轉(zhuǎn)基因陽性材料中，9株發(fā)生編輯，其中4株的OsMAP65-3.1-1位點(diǎn)被編輯，其中3株兩條染色體同時(shí)被編輯，共7個(gè)編輯事件，4個(gè)移碼終止，編輯效率為17.50%；而OsMAP65-3.2-2發(fā)生編輯的9個(gè)株系全部為兩條染色體同時(shí)編輯，移碼終止的編輯事件高達(dá)13次，編輯效率為45.00%。

表4 CSMAP65-3A轉(zhuǎn)基因植株中OsMAP65-3s編輯情況Table 4 The edition of OsMAP65-3s in CSMAP65-3A transgenic plants

表5 CSMAP65-3B轉(zhuǎn)基因植株中OsMAP65-3s編輯情況Table 5 The edition of OsMAP65-3s in CSMAP65-3B transgenic plants

3 討論

OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2是水稻中細(xì)胞質(zhì)分裂關(guān)鍵因子MAP65-3的2個(gè)同源蛋白，本研究團(tuán)隊(duì)用煙草葉片瞬時(shí)分裂系統(tǒng)已經(jīng)證明OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2均定位于成膜體中線[22]，可能均參與調(diào)控水稻細(xì)胞質(zhì)分裂，并可能存在功能冗余。本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2進(jìn)行編輯實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變，創(chuàng)制osmap65-3s突變體，獲取雙基因突變體是分析其功能的重要前提，有利于闡明水稻有絲分裂調(diào)控機(jī)理。創(chuàng)制雙基因突變體有兩種方案：第一種方案需先分別獲得單突變植株，然后進(jìn)行雜交以獲得雙突植株。如擬南芥中的CPK10/CPK30雙突變體是以純合單突變體作為親本進(jìn)行人工雜交，繁衍至F2代從群體中分離出的純合雙突植株[23]。而水稻突變體資源相對較少，用該方案創(chuàng)制雙突變體周期較長。需先用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制兩個(gè)基因的單突變體，再通過雜交將兩個(gè)突變基因聚合到F1，自交F2中篩選到雙突變體，經(jīng)歷3～6個(gè)世代才可獲得雙突變體。第二種方案是將兩個(gè)基因的靶位點(diǎn)對應(yīng)的sgRNA構(gòu)建到同一個(gè)載體上，可對兩個(gè)基因進(jìn)行編輯。由于單個(gè)位點(diǎn)的編輯具有一定的概率，轉(zhuǎn)化植株會(huì)出現(xiàn)不同的編輯組合，因此可獲得單基因突變體和雙基因突變體。該方案節(jié)省大量的時(shí)間，僅需1～2個(gè)世代就可獲得雙突變體。如水稻中酯酶家族成員同源性較高的成員OsGELP110與OsGELP115，將二者sgRNA構(gòu)建到同一載體轉(zhuǎn)化后，迅速獲得osgelp110單突變體、osgelp115單突變體和osgelp110/osgelp115雙突變體，此外單獨(dú)敲除OsGELP110或OsGELP115無明顯表型，而雙突變體花粉外壁結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致雄性不育[24]。本研究將OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2的不同靶位點(diǎn)整合成兩個(gè)不同的雙基因編輯載體CSMAP65-3A和CSMAP65-3B，轉(zhuǎn)化后獲得的T0代轉(zhuǎn)基因材料中，已經(jīng)獲得多個(gè)osmap65-3.2、osmap65-3.2/OsMAP65-3.1(+/-)和OsMAP65-3.2(+/-)/OsMAP65-3.1(+/-)植株(表4、5)，可通過對應(yīng)株系自交T1代獲得osmap65-3.1和osmap65-3.1/osmap65-3.2。此外，本研究中雙基因編輯植株比例較高，16個(gè)CSMAP65-3A陽性植株中有2株，比例12.5%，而20個(gè)CSMAP65-3B的轉(zhuǎn)基因株系中有4株兩個(gè)基因同時(shí)被編輯，比例高達(dá)20%。而李星坤等[25]用雙基因編輯載體對擬南芥中糖基轉(zhuǎn)移酶同工酶基因UGT84A1和UGT84A2同時(shí)進(jìn)行編輯，雙突植株比例僅為4.76%。因此，本研究選用靶位點(diǎn)和編輯載體可快速、高效地創(chuàng)制OsMAP65-3s雙突變體材料。

本研究針對OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2均設(shè)計(jì)了2個(gè)不同的靶位點(diǎn)，且都獲得了水稻編輯植株。其中OsMAP65-3.1-1位點(diǎn)編輯效率為17.50%，OsMAP65-3.1-2位點(diǎn)編輯效率為9.38%；OsMAP65-3.2-1位點(diǎn)編輯效率為15.62%，OsMAP65-3.2-2編輯效率為45.00%。表明同一基因的不同靶位點(diǎn)會(huì)影響編輯效率，與已報(bào)道的蛋白激酶MPK5一致，載體的編輯效率與不同的靶序列相關(guān)性較大[26]。因此，為確保目標(biāo)基因的高效編輯，應(yīng)選用2個(gè)及以上的靶位點(diǎn)。但是，相比OsMAP65-3.2以及前人報(bào)道的水稻OsGRAS39基因[27]，本研究中OsMAP65-3.1 2個(gè)靶位點(diǎn)編輯效率均較低，一定程度上可排除靶位點(diǎn)選擇的因素。由于OsMAP65-3.1基因在水稻中的功能非常重要，該基因被編輯的細(xì)胞在水稻轉(zhuǎn)化過程中難以存活，導(dǎo)致成苗率低，且大部分編輯事件無法檢測到。因此，OsMAP65-3.1編輯植株難以獲得。MAP65-3是調(diào)控植物細(xì)胞板的合成及細(xì)胞質(zhì)分裂的關(guān)鍵因子[22,28]。MAP65-3通過二聚化及磷酸化調(diào)控其蛋白活性決定了成膜體中間區(qū)域空間的寬窄和成膜體的擴(kuò)張；該基因的擬南芥突變體成膜體中間區(qū)域變的更寬，細(xì)胞質(zhì)分裂失敗的頻率明顯增加[29-30]。因此，水稻OsMAP65-3s異?？赡軙?huì)影響細(xì)胞分裂及轉(zhuǎn)化苗的形成。

4 結(jié)論

本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)，對水稻中2個(gè)與細(xì)胞質(zhì)分裂相關(guān)的OsMAP65-3基因進(jìn)行敲除創(chuàng)制突變體材料。為避免基因功能冗余，本試驗(yàn)在一個(gè)載體中同時(shí)設(shè)計(jì)了OsMAP65-3.1與OsMAP65-3.2敲除靶位點(diǎn)，并且設(shè)計(jì)了2個(gè)雙敲載體來提高編輯效率。在獲得的2個(gè)轉(zhuǎn)基因群體中，陽性植株比例均高于90%，所設(shè)計(jì)的4個(gè)靶位點(diǎn)都出現(xiàn)編輯事件，其中OsMAP65-3.1的2個(gè)靶位點(diǎn)的編輯效率分別為17.50%和9.38%，OsMAP65-3.2編輯效率分別為15.62%和45.00%。T0代已經(jīng)獲得4種突變體材料，分別是osmap65-3.2、osmap65-3.2/OsMAP65-3.1(+/-)和OsMAP65-3.2(+/-)/OsMAP65-3.1(+/-)， 后面仍需通過自交獲得osmap65-3.1單突變體及osmap65-3.1/osmap65-3.2 雙突變體。此外，在獲得的編輯植株中，OsMAP65-3.2在T0代已經(jīng)出現(xiàn)2條染色體均被提前終止的突變體，而OsMAP65-3.1只存在突變雜合，表明OsMAP65-3.1與OsMAP65-3.2的功能可能存在差異，且OsMAP65-3.1在水稻有絲分裂過程中可能更為重要。