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    添加漢麻籽多肽對啤酒酵母生長的影響研究

    2022-03-11 09:47:26宋淑敏魏連會楊慶麗
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2022年4期
    關(guān)鍵詞:啤酒酵母麥芽活菌

    石 杰, 宋淑敏,魏連會,董 艷,楊慶麗

    (黑龍江省科學(xué)院 大慶分院,黑龍江 大慶 163319)

    啤酒酵母是啤酒生產(chǎn)過程中的常用酵母,不但可以用于釀造啤酒,由于其菌體營養(yǎng)豐富,還可以提取維生素、細(xì)胞色素 C、核酸、谷胱甘肽、凝血質(zhì)、輔酶 A 和三磷酸腺苷等[1-3],從而用于藥膳及飼料[4],成為新時期保健食品研制的熱點話題。在啤酒酵母的培養(yǎng)過程中,氮源的含量、組成及種類能夠顯著影響酵母細(xì)胞的組成和關(guān)鍵物質(zhì)的合成途徑[5-6]。在釀制啤酒過程中,添加氮源種類和含量不同不但對啤酒的發(fā)酵度有顯著影響,同時對成品啤酒的理化性質(zhì)及風(fēng)味也起著主導(dǎo)作用[7-9]。為提高啤酒酵母在發(fā)酵過程中的生物量及發(fā)酵速率,增加啤酒發(fā)酵成品中的營養(yǎng)成分,補充氮源成為一種可行的有效辦法[10]。

    漢麻 (CannabisSativaL) 在我國有著悠久的種植歷史,漢麻籽富含優(yōu)質(zhì)蛋白[11-12]及合理的必需氨基酸和非必需氨基酸比例,特別是含有大量人體代謝需要的精氨酸,不含致敏因子,不會造成胃脹、反胃和過敏反應(yīng)[13-14]。研究還發(fā)現(xiàn),漢麻籽多肽具有很好的抗氧化性能和降血脂作用[15-16]。因此,將漢麻籽多肽作為補充氮源,研究一株購自日本的啤酒酵母在 添 加 漢 麻 籽 多 肽 前 后 的 生 長 變 化 , 為 提 高 啤 酒 酵母生產(chǎn)效率、加速啤酒釀造提出一條新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    (1) 漢麻籽多肽。課題組自行研制 (<5 000 amu);啤酒酵母、大麥芽、啤酒花,日本新瀉麥酒株式會社提供。

    (2) 麥芽汁培養(yǎng)基。蛋白胨 4 g,葡萄糖 10 g,酵母浸粉 3 g,麥芽浸粉 10 g,瓊脂粉 18 g (固體),蒸餾水 1 000 mL,于 121 ℃下滅菌 30 min。

    (3) YEPD 培養(yǎng)基。酵母膏 10 g,蛋白胨 20 g溶解于 900 mL 蒸餾水中 (固體培養(yǎng)基中另加入瓊脂粉 18 g);另取 20 g 葡萄糖溶于 100 mL 蒸餾水中;分別于 121 ℃下滅菌 30 min;使用前于無菌環(huán)境下混合。

    鹽酸,氫氧化鈉均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    FE28-Standard 型 pH 計,瑞士梅特勒公司產(chǎn)品;UV759S 型紫外 - 可見光分光光度計,上海精密科學(xué)儀器有限公司;BK5000 型生物顯微鏡,OPTEC 奧特光學(xué)產(chǎn)品;HPX-9082 MBE 型恒溫培養(yǎng)箱,上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品;DHG-9070A 型鼓風(fēng)干燥箱,上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 不同添加量漢麻籽多肽對啤酒酵母生長的影響

    在 YEPD 培養(yǎng)基 (除葡萄糖溶液) 中將總體積占比 0.5%和 1%添加量的漢麻籽多肽粉滅菌,接種酵母前于無菌環(huán)境中按比例混合已滅菌葡萄糖溶液,同時制備對照培養(yǎng)基并滅菌。各處理接種已培養(yǎng) 24 h 的啤酒酵母種子培養(yǎng)液 1 mL,于恒溫培養(yǎng)箱中 28 ℃培養(yǎng) 24 h 后進(jìn)行平板計數(shù)、菌體干重測定和顯微鏡鏡檢。

    (1) 菌體干重測定。取各處理 10 mL 菌懸液,以轉(zhuǎn)速 4 000 r/min 離心 20 min,棄上清液,加入10 mL蒸餾水重懸酵母,再次以轉(zhuǎn)速 4 000 r/min 離心 20 min,棄去上清液,105 ℃下烘干 3 h,稱得菌體干重。

    (2) 顯微鏡鏡檢。為方便觀察和拍照,固定菌體后進(jìn)行了結(jié)晶紫染色。

    1.3.2 添加漢麻籽多肽對啤酒酵母生長曲線的影響

    麥芽汁液體培養(yǎng)基共準(zhǔn)備 48 瓶,每瓶 50 mL,其中 24 瓶中分別添加總體積占比 0.5%添加量的漢麻籽多肽粉。滅菌后 48 瓶同時接種已培養(yǎng) 24 h 的啤酒酵母種子培養(yǎng)液 100 μL,28 ℃,以轉(zhuǎn)速 180 r/min搖瓶培養(yǎng)。以原始培養(yǎng)基為零標(biāo),采用分光光度計分別檢測 2 種培養(yǎng)基 3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36 h 時的 OD600值,建立生長曲線。

    1.3.3 漢麻籽多肽精釀啤酒工藝流程

    粉碎大麥芽→糖化→煮沸→過濾→冷卻→接種啤酒酵母→主發(fā)酵→后熟→成品。

    1.3.4 操作要點

    (1) 糖化。粉碎大麥芽 100 g 加入蒸餾水 500 mL,加熱至 65 ℃持續(xù) 90 min,繼續(xù)加熱至 80 ℃持續(xù)30 min。

    (2) 煮沸。添加 1 g 啤酒花,將糖化好的麥汁煮沸 30 min。

    (3) 冷卻。過濾后室溫冷卻至 30 ℃。

    (4) 接種啤酒酵母。直接將培養(yǎng)好的啤酒酵母平板中的啤酒酵母刮取后混入冷卻液 (1 盤 / 100 mL)。

    (5) 主發(fā)酵。發(fā)酵溫度 8~20 ℃,發(fā)酵 7 d。

    (6) 后熟。主發(fā)酵后將發(fā)酵液置于 6 ℃冷藏室15 d,去除酵母和沉淀物,得到漢麻籽多肽精釀啤酒。

    1.3.5 漢麻籽多肽精釀啤酒中啤酒酵母活菌數(shù)正交試驗設(shè)計

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用正交試驗設(shè)計,以精釀啤酒后熟的酵母活菌數(shù)量為評價指標(biāo),對主發(fā)酵溫度 (A)、漢麻籽多肽添加量 (B) 和漢麻籽多肽添加時期 (C) 進(jìn)行正交試驗,研究提高酵母活菌數(shù)的條件組合。

    正交試驗因素與水平設(shè)計見表 1。

    表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

    2 結(jié)果與分析

    2.1 啤酒酵母序列鑒定

    采用提取 DNA,設(shè)計引物進(jìn)行 PCR 后測序的方法進(jìn)行了啤酒酵母菌種的鑒定,測序結(jié)果如下:

    試驗結(jié)果中該菌株被鑒定為Saccharomyces(酵母 菌 屬), 為Saccharomycescerevisiae(啤 酒 酵 母)。確定菌種后即可進(jìn)行其他相關(guān)研究。

    2.2 不同添加量漢麻籽多肽對啤酒酵母生長的影響

    不同添加量的漢麻籽多肽 YEPD 培養(yǎng)基中啤酒酵母的活菌數(shù)及菌干重見表 2。

    表2 不同添加量的漢麻籽多肽 YEPD 培養(yǎng)基中啤酒酵母的活菌數(shù)及菌干重

    由 表 2 可 知 , 在 YEPD 培 養(yǎng) 基 中 添 加 0.5% 和1%含量的漢麻籽多肽均可以增加培養(yǎng)基中酵母菌的活菌數(shù)和菌干重。其中,添加量 1%的漢麻籽多肽可以提高活菌數(shù) 18.67%,添加量為 0.5%的漢麻籽多肽可以提高菌干重 11.12%。而添加量為 1%的漢麻籽多肽對酵母菌干重的增加量少于添加量為 0.5%的漢麻籽多肽,說明添加過多漢麻籽多肽僅僅可能增加啤酒酵母活菌數(shù),不能增加酵母菌干重。

    不同漢麻籽多肽添加量的培養(yǎng)基中酵母菌的形態(tài)見圖 1。

    圖1 不同漢麻籽多肽添加量的培養(yǎng)基中酵母菌的形態(tài)

    由圖 1 可知,沒有添加漢麻籽多肽和添加量為0.5%漢麻籽多肽 YEPD 培養(yǎng)基中的啤酒酵母平均直徑要大于添加 1%漢麻籽多肽的 YEPD 培養(yǎng)基中的啤酒酵母。同樣證明了添加過量漢麻籽多肽僅對增加啤酒酵母的數(shù)量有益,對啤酒酵母的干重增加影響不大。

    不同漢麻籽多肽添加量的培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母后的狀態(tài)見圖 2。

    在 YEPD 培養(yǎng)基中添加 0.5%和 1%漢麻籽多肽后,培養(yǎng)基的顏色與對照是相同的,由圖 2 可知,隨著漢麻籽多肽添加量的增加,培養(yǎng)啤酒酵母后培養(yǎng)基的顏色越深??赡苁且驗槠【平湍笖?shù)量隨著漢麻籽多肽添加量的增加而增加,培養(yǎng)基中的營養(yǎng)被利用,同時產(chǎn)生了大量深色代謝產(chǎn)物,從而導(dǎo)致培養(yǎng)基的顏色加深。具體產(chǎn)生了哪些代謝產(chǎn)物使培養(yǎng)基顏色加深還需要進(jìn)一步研究。

    圖2 不同漢麻籽多肽添加量的培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母后的狀態(tài)

    2.3 添加漢麻籽多肽對啤酒酵母生長曲線的影響

    啤酒酵母在不同培養(yǎng)基中的生長曲線見圖 3。

    圖3 啤酒酵母在不同培養(yǎng)基中的生長曲線

    由圖 3 可知,添加漢麻籽多肽的麥芽汁培養(yǎng)基與普通麥芽汁培養(yǎng)基中啤酒酵母的生長曲線。二者的趨勢一致,均在 6 h 后進(jìn)入指數(shù)生長期,并在 15 h 開始進(jìn)入穩(wěn)定期。指數(shù)生長后期,12 h 左右漢麻籽多肽麥芽汁培養(yǎng)基中酵母數(shù)量即超過了普通麥芽汁培養(yǎng)基中的酵母數(shù)量,并一直持續(xù)至 36 h。這與 2.2 的研究結(jié)果相一致。

    2.4 漢麻籽多 肽 添加量、添加時期 及 主發(fā) 酵 溫 度對啤酒酵母在精釀啤酒中活菌數(shù)量的影響

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果對主發(fā)酵溫度 (A)、漢麻籽多肽添加量 (B) 和漢麻籽多肽添加時期 (C) 3 個因素進(jìn)行正交試驗,探討對啤酒酵母活菌數(shù)影響最大的變量。

    正交試驗結(jié)果見表 3。

    由表 3 可知,影響啤酒酵母在精釀啤酒中活菌數(shù)量的各因素主次關(guān)系為A>B>C,其中主發(fā)酵溫度對精釀啤酒中啤酒酵母的數(shù)量影響顯著,其次是漢麻籽多肽的添加量。得出提高精釀啤酒活菌數(shù)量的最佳條件為A1B2C3,即主發(fā)酵溫度為 8 ℃,漢麻籽多肽添加量為 0.5%,并在主發(fā)酵后添加。添加了漢麻籽多肽的精釀啤酒呈黃棕色,較普通啤酒顏色更深,但口感細(xì)膩醇厚、香氣獨特。

    表3 正交試驗結(jié)果

    3 結(jié)論

    添加 0.5%或 1%的漢麻籽多肽都可以提高 YEPD培養(yǎng)基中啤酒酵母的活菌數(shù)和菌干重,且漢麻籽多肽添加量越多,啤酒酵母活菌數(shù)越高,過多漢麻籽多肽不能再增加啤酒酵母的菌干重,說明添加漢麻籽多肽可以提高啤酒酵母的裂殖活性,但由于碳源或其他營養(yǎng)因素的限制,不能提高啤酒酵母的菌干重,鏡檢結(jié)果也說明了同樣的問題。添加和不添加漢麻籽多肽的麥芽汁培養(yǎng)基中啤酒酵母的生長曲線是相似的,但指數(shù)生長后期漢麻籽多肽麥芽汁培養(yǎng)基中啤酒酵母數(shù)量要高于普通麥芽汁培養(yǎng)基中啤酒酵母數(shù)量。

    影響啤酒酵母在精釀啤酒中活菌數(shù)量的各因素主次關(guān)系為主發(fā)酵溫度 > 漢麻籽多肽添加量 > 漢麻籽多肽添加時期,提高精釀啤酒活菌數(shù)量的最佳條件為主發(fā)酵溫度 8 ℃,漢麻籽多肽添加量 0.5%,并在主發(fā)酵后添加。可能是添加了適量的漢麻籽多肽補充了主發(fā)酵后啤酒酵母增殖所需要的氮源,在后熟過程中又促進(jìn)了酵母的增殖。因此,添加漢麻籽多肽對啤酒酵母的增殖具有重要意義,是一種提高啤酒酵母生產(chǎn)效率、提高啤酒品質(zhì)的一條重要途徑。

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