HPLC 法測(cè)定蘄蛇藥酒中馬錢苷酸和龍膽苦苷的含量

眭榮春，李金林，周玉春，肖云，王志春

1.江西大自然制藥有限公司，江西 吉安 343000；2.江西納弗堂制藥有限公司，江西 宜春 336000

蘄蛇藥酒起源于明朝年間，胡卓人蘄蛇藥酒的制作技藝為江西省吉安市吉州區(qū)傳統(tǒng)醫(yī)藥和江西省省級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)之一。蘄蛇藥酒執(zhí)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第五冊(cè)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：WS3-B-1063-91）［1］，只有性狀、鑒別和常規(guī)制劑通則檢查項(xiàng)，無含量測(cè)定項(xiàng)目，在質(zhì)量控制中存在一定的缺陷。目前關(guān)于蘄蛇藥酒含量測(cè)定也未見文獻(xiàn)報(bào)道。為了更好地控制其質(zhì)量，本研究建立HPLC 法測(cè)定蘄蛇藥酒中兩種成分（馬錢苷酸和龍膽苦苷）的含量，以填補(bǔ)蘄蛇藥酒含量測(cè)定項(xiàng)的空白，更好地控制蘄蛇藥酒的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ2200DB 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA2004B 型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；ESJ203-S 型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

龍膽苦苷對(duì)照品（批號(hào)為110770-202219，純度為98.1%），馬錢苷酸對(duì)照品（批號(hào)為111865-202005，純度為97.5%），均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院。蘄蛇藥酒（江西大自然制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z36020910，規(guī)格：每瓶裝500 mL；批號(hào)：20200501、20200502、20200901、20200902、20210201、20210501、20210701、20211101、20211102、20211201）。甲醇和乙腈為色譜純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為純凈水(杭州娃哈哈公司)；其余試劑為分析純。

2 方法和結(jié)果［2-6］

2.1 色譜條件

采用Ultimate Plus C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相，按表1 進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱定馬錢苷酸對(duì)照品16.15 mg、龍膽苦苷對(duì)照品25.70 mg，加甲醇制成每1 mL 含馬錢苷酸0.157 5 mg、龍膽苦苷0.252 1 mg 的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取蘄蛇藥酒適量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按蘄蛇藥酒處方組成除秦艽藥材外其余藥材，用白酒作溶劑，蔗糖為輔料，按蘄蛇藥酒的制備工藝和“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性考察

分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果如圖1 所示，待測(cè)成分的色譜峰分離度良好，陰性對(duì)照溶液對(duì)待測(cè)成分無干擾，表明該方法專屬性好。

圖1 高效液相色譜圖：A.對(duì)照品溶液；B.陰性對(duì)照溶液；C.供試品溶液

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱定馬錢苷酸對(duì)照品16.15 mg、龍膽苦苷對(duì)照品25.70 mg，加甲醇制成含馬錢苷酸濃度依次為0.012 60 mg/mL、0.031 5 mg/mL、0.063 0 mg/mL、0.157 5 mg/mL、0.314 9 mg/mL，含龍膽苦苷的濃度依次為0.020 17 mg/mL、0.050 4 mg/mL、0.100 8 mg/mL、0.252 1 mg/mL、0.504 2 mg/mL 的混合溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，得馬錢苷酸回歸方程為Y=7.0×106X-5 543.6，r=0.999 9，龍膽苦苷回歸方程Y=1.0×107X-19 909，r=0.999 9，表明馬錢苷酸和龍膽苦苷分別在0.012 60 mg/mL～0.314 9 mg/mL 和0.020 17 mg/mL～0.504 2 mg/mL 濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取含馬錢苷酸0.157 5 mg/mL、龍膽苦苷0.252 1 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄馬錢苷酸和龍膽苦苷峰面積，結(jié)果馬錢苷酸峰面積RSD（n=6）為0.27%，龍膽苦苷峰面積RSD（n=6）為0.26%，表明該儀器具有良好的精密度。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取蘄蛇藥酒（批號(hào)20211201），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別測(cè)定馬錢苷酸和龍膽苦苷在0、2、4、8、12、24 h 峰面積，結(jié)果馬錢苷酸和龍膽苦苷峰面積RSD（n=6）分別為0.96%和0.40%，表明蘄蛇藥酒供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取蘄蛇藥酒（批號(hào)20211201），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果測(cè)得馬錢苷酸和龍膽苦苷峰面積RSD（n=6）分別為1.05%和1.26%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取已知含量的蘄蛇藥酒（批號(hào)20211201）六份，每份2.5 mL，分別置5 mL 量瓶中，各精密加入含馬錢苷酸0.246 1 mg/mL 和龍膽苦苷0.759 3 mg/mL 的混合對(duì)照品甲醇溶液1 mL，并加甲醇至刻度，搖勻。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄馬錢苷酸和龍膽苦苷峰面積，計(jì)算蘄蛇藥酒中2種成分含量，結(jié)果見表2、表3，表明該方法的準(zhǔn)確度高。

表2 馬錢苷酸回收率測(cè)定結(jié)果

表3 龍膽苦苷回收率測(cè)定結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

取10 批蘄蛇藥酒樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算2 種成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 10批蘄蛇藥酒含量測(cè)定結(jié)果 mg/mL

3 討論

3.1 檢測(cè)成分的選擇

蘄蛇藥酒由蘄蛇（去頭）、秦艽、防風(fēng)、當(dāng)歸、紅花、羌活和香加皮等7 味中藥組成，具有活血通絡(luò)，祛風(fēng)除濕的功效。其中秦艽為蘄蛇藥酒主要功效成分，秦艽化學(xué)成分復(fù)雜，一般認(rèn)為環(huán)烯醚萜苷類是其主要有效成分之一，龍膽苦苷為秦艽中含量最高的化學(xué)成分，也是秦艽中主要活性成分及苦味成分，龍膽苦苷具有保肝利膽［7］、抗炎［8-9］、升血糖及對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用［10］；馬錢苷酸具有一定的抗炎活性，也為秦艽主要活性成分［11］。因此，為了更有效地控制成藥質(zhì)量，本研究采用了HPLC法測(cè)定蘄蛇藥酒中馬錢苷酸和龍膽苦苷的含量。

3.2 流動(dòng)相考察

本實(shí)驗(yàn)參考了《中國(guó)藥典》2020 年版一部和相關(guān)文獻(xiàn)［2-6］，確定流動(dòng)相以乙腈為有機(jī)相，并考察了不同濃度的磷酸和醋酸對(duì)蘄蛇藥酒供試品溶液中待測(cè)組分分離的影響，結(jié)果不同濃度的酸對(duì)分離效果影響不大，磷酸較醋酸對(duì)待測(cè)組分分離效果好，故選擇0.1%磷酸溶液為水相。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

參考《中國(guó)藥典》2020 年版一部中秦艽含量測(cè)定項(xiàng)和相關(guān)文獻(xiàn)［2-6］，供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果馬錢苷酸和龍膽苦苷在254 nm波長(zhǎng)處都有較大吸收，故選擇254 nm 波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 小結(jié)

本研究建立以高效液相色譜法測(cè)定蘄蛇藥酒中馬錢苷酸和龍膽苦苷含量的方法，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可對(duì)蘄蛇藥酒的質(zhì)量進(jìn)行有效控制。通過對(duì)10 批蘄蛇藥酒中馬錢苷酸和龍膽苦苷進(jìn)行含量測(cè)定，馬錢苷酸和龍膽苦苷總量在0.213 mg/mL～0.411 mg/mL 之間，通過查詢制劑所用秦艽飲片的檢驗(yàn)報(bào)告，可知馬錢苷酸和龍膽苦苷兩種成分含量差異較大，推斷是所用飲片含量不同而導(dǎo)致不同批次成品中這兩種成分含量差異較大。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版中秦艽飲片的含量限度以及在處方中的實(shí)際用量，按轉(zhuǎn)移率90%計(jì)算，推算蘄蛇藥酒中含秦艽以馬錢苷酸和龍膽苦苷總量計(jì)應(yīng)不得少于0.135 mg/mL，10 個(gè)批次成品含量均大于擬定限度。本次研究仍存在不足之處，如缺少其他藥味有效成分的含量測(cè)定和指紋圖譜研究等，后續(xù)將進(jìn)一步進(jìn)行多成分定量分析和指紋圖譜研究，從而更全面地評(píng)價(jià)蘄蛇藥酒的內(nèi)在質(zhì)量。