轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的理化性質(zhì)及其分子結(jié)構(gòu)的分析

張 敏，程 琰，賈沛洲，杜葉平，馬永峰，李 玲*

（1. 聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八五醫(yī)院檢驗(yàn)科，太原 030001；2. 聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八零醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050000）

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)傳導(dǎo)在癌癥進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用。大多數(shù)癌細(xì)胞可以促使它們的上皮抗增殖反應(yīng)失活，并影響基因的表達(dá)、免疫抑制細(xì)胞因子的釋放和上皮可塑性，這些均得益于TGF-β的表達(dá)上調(diào)和自分泌TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)［1］。腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞、基質(zhì)成纖維細(xì)胞和其他細(xì)胞釋放的TGF-β通過(guò)塑造腫瘤結(jié)構(gòu)和抑制免疫細(xì)胞的抗腫瘤活性進(jìn)一步促進(jìn)癌癥的進(jìn)展，從而產(chǎn)生免疫抑制環(huán)境，阻止或減弱抗癌免疫療法的療效。TGF-β在多種細(xì)胞類型中可以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（mesenchymal transition，EMT），包括乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤等［1-2］。研究表明，將TGF-β的Ⅱ型受體（type II receptor，TβRII）轉(zhuǎn)染到高度轉(zhuǎn)移的小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞中會(huì)減弱TGF-β誘導(dǎo)的EMT和癌細(xì)胞的擴(kuò)散，因此該結(jié)果表明，靶向TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一種很有前景的癌癥治療策略［3］。除了對(duì)腫瘤發(fā)展的影響外，TGF-β誘導(dǎo)的EMT還可以促進(jìn)許多器官的組織纖維化，如肺［4］和肝［5］。組織纖維化是持續(xù)炎癥后過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積的結(jié)果，最終會(huì)導(dǎo)致器官衰竭。對(duì)纖維化病理過(guò)程的研究顯示，ECM的過(guò)量產(chǎn)生和組織硬度的增加與促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和促進(jìn)遷移有關(guān)［6-7］。研究表明，由癌細(xì)胞本身驅(qū)動(dòng)的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 （cancer-associated fibroblasts，CAF）可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，并被證明是腫瘤侵襲的驅(qū)動(dòng)因素［8-9］。組織纖維化和腫瘤發(fā)生的機(jī)制是密不可分的，并且TGF-β信號(hào)在這兩種病理狀況中都起著至關(guān)重要的作用，因此可以將TGF-β信號(hào)通路作為癌癥和纖維化治療的靶點(diǎn)。

生物信息學(xué)是一門(mén)新興的學(xué)科，該學(xué)科主要從核酸和蛋白質(zhì)出發(fā)，利用生物學(xué)軟件分析核酸的序列信息以及蛋白的理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)等。因此，本研究應(yīng)用多種生物學(xué)工具對(duì)人TGF-β的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能等進(jìn)行分析，為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TGF-β序列的獲得

以“TGF-β+Homo sapiens”為關(guān)鍵詞，從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)［10］（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載得到人TGF-β的氨基酸序列信息，其GenBank登錄號(hào)為AAA36738.1。

1.2 TGF-β的理化性質(zhì)分析

通過(guò)軟件ProtParam［11］（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)TGF-β的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。通過(guò)軟件Protscale［11］（http://web.expasy.org/protscale/）對(duì)TGF-β的親疏水性進(jìn)行分析。

1.3 TGF-β的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)軟件SignalP-5.0［12］（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)TGF-β的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.4 TGF-β的跨膜結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)軟件TMHMM-2.0［13］（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）對(duì)TGF-β的跨膜區(qū)域進(jìn)行分析。

1.5 TGF-β亞細(xì)胞定位分析

通過(guò)軟件PSORT Ⅱ［13］（https://psort.hgc.jp/form2.html）對(duì)TGF-β的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行分析。

1.6 TGF-β二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)軟件SOPMA［14］（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）對(duì)TGF-β的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。用NCBI中的Conserved Domain數(shù)據(jù)庫(kù)分析TGF-β的結(jié)構(gòu)域。

1.7 TGF-β蛋白翻譯后位點(diǎn)修飾

通過(guò)軟件NetNGlyc-1.0［15］（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）對(duì)TGF-β的N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析；通過(guò)軟件NetOGlyc-4.0［16］（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0）對(duì)TGF-β的O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析；通過(guò)軟件Netphos-3.1［17］（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）對(duì)TGF-β的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析。

1.8 TGF-β與腫瘤的相關(guān)性分析

利用GEPIA（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）［18］在線網(wǎng)站分析TGF-β在腫瘤中表達(dá)量的變化情況以及與臨床預(yù)后的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGF-β的理化性質(zhì)分析

用ProtParam工具對(duì)TGF-β的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該蛋白由431個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為49 312.95 Da，分子式為C2203H3375N629O629S18，理論等電點(diǎn)為7.74。組成TGF-β的氨基酸有20種，其中異亮氨酸的含量最高，占總氨基酸的9.3%，色氨酸的含量最少，只有1.4%（圖1）。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為46，帶正電荷的殘基總數(shù)為47，不穩(wěn)定指數(shù)為53.82，親水性平均總值為-0.397，脂肪指數(shù)為76.96。

圖1 TGF-β的氨基酸組成分析Fig. 1 Analysis of amino acid composition of TGF-β

用ProtScale工具分析TGF-β的親疏水性，結(jié)果顯示，疏水性區(qū)大于親水性區(qū)。TGF-β氨基酸序列的第19位甘氨酸的疏水性最大，分值為2.167；第53位酪氨酸的親水性最大，分值為-3.233（圖2）。

圖2 TGF-β的親水性與疏水性分析Fig. 2 Hydrophilic-hydrophobic analysis of TGF-β

2.2 TGF-β的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)分析

用SignalP-5.0工具分析TGF-β的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，存在信號(hào)肽的概率為82.51%，且信號(hào)肽可能的切割位點(diǎn)為第29和30位氨基酸之間（圖3）。

圖3 TGF-β的信號(hào)肽分析Fig. 3 Signal peptides analysis of TGF-β

2.3 TGF-β的跨膜結(jié)構(gòu)分析

用TMHMM-2.0工具對(duì)TGF-β的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明TGF-β有431個(gè)氨基酸序列，均位于膜外區(qū)，可知其為胞外蛋白，不存在跨膜區(qū)（圖4）。

圖4 TGF-β跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig. 4 Trans-membrane domain analysis of TGF-β

2.4 TGF-β的亞細(xì)胞定位

用PSORT Ⅱ工具進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明，TGF-β定位于不同細(xì)胞器的可能性分別為：細(xì)胞外基質(zhì)（66.7%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（22.2%）和液泡（11.1%）。

2.5 TGF-β二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

用SOPMA工具對(duì)TGF-β的二級(jí)結(jié)構(gòu)及各成分所占比例進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，TGF-β由23.49%的α螺旋（圖5中藍(lán)線）、18.37%的延伸鏈（圖5中紅線）、2.33%的β轉(zhuǎn)角（圖5中綠線）和55.81%的無(wú)規(guī)則卷曲（圖5中紫線）組成。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，TGF-β屬于TGF-β_前肽和TGF-β_SF 超家族，該結(jié)構(gòu)域分別由246和107個(gè)氨基酸殘基組成（圖6）。

圖5 TGF-β的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig. 5 Secondary structure analysis of TGF-β

圖6 TGF-β功能結(jié)構(gòu)域分析Fig. 6 Functional domain analysis of TGF-β

2.6 TGF-β翻譯后位點(diǎn)修飾

用NetNGlyc-1.0、NetOGlyc-4.0和Netphos-3.1工具分別對(duì)TGF-β翻譯后的N-糖基化、O-糖基化和磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，TGF-β的N-糖基化位點(diǎn)分別位于第187、302、321和372位的氨基酸，O-糖基化位點(diǎn)分別位于第78、104、112、113、120、290、293、294、296、300、304、306、322、323和324位的氨基酸。磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TGF-β分別具有21個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、8個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和3個(gè)酪氨酸位點(diǎn)（圖7）。

圖7 TGF-β磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析Fig. 7 Predictive analysis of TGF-β phosphorylation sites

2.7 TGF-β與腫瘤相關(guān)性的分析

GEPIA中囊括了33種腫瘤的測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)TGF-β的表達(dá)量分析顯示，TGF-β在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head-and-neck squamous cell carcinoma，HNSC）、腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤（brain lower grade glioma，LGG）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）和胃腺癌（stomach adenocarcinoma， STAD）中高表達(dá)，在腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma，ACC）、胸腺瘤（thymoma，THYM）和子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）中低表達(dá)（P＜0.05）（圖8）。對(duì)TGF-β的預(yù)后分析顯示，TGF-β高表達(dá)與LGG和STAD患者的預(yù)后不良密切相關(guān)（P＜0.05）（圖9）。

圖8 TGF-β在腫瘤中表達(dá)量變化分析Fig. 8 Analysis of TGF-β expression in tumor

圖9 TGF-β的預(yù)后分析Fig. 9 Prognostic analysis of TGF-β

3 討論

本研究利用生物信息學(xué)在線軟件庫(kù)，對(duì)TGF-β基因所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)果與功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明：TGF-β是一種堿性、不穩(wěn)定的疏水性蛋白，組成所需的氨基酸有20種，其中異亮氨酸的含量最多（9.3%）；TGF-β具有信號(hào)肽序列，是經(jīng)典的分泌蛋白，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于胞外蛋白，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是無(wú)規(guī)則卷曲；TGF-β結(jié)構(gòu)域的分析顯示，其屬于TGF-β_前肽和TGF-β_SF 超家族；TGF-β超家族包含30多個(gè)成員，這些成員參與多種生理過(guò)程，包括胚胎發(fā)育、增殖、分化、凋亡和免疫反應(yīng)［1］

蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)合成后需要運(yùn)輸?shù)教囟ǖ膩喖?xì)胞結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮其功能。對(duì)TGF-β的亞細(xì)胞定位分析顯示，其定位于不同細(xì)胞器的可能性分別為：細(xì)胞外基質(zhì)（66.7%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（22.2%）和液泡（11.1%）。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β是胞外蛋白且具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，這表明其是經(jīng)典的分泌性蛋白，并且主要在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)揮功能。

聚糖是覆蓋細(xì)胞表面的糖蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和糖脂的一部分，它們?cè)诓煌纳锖图?xì)胞功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)糖基化包括N-連接糖基化［其中聚糖與蛋白質(zhì)的天冬酰胺（Asn）殘基的氮相連］、O-連接糖基化［其中聚糖與絲氨酸 （Ser） 或蘇氨酸 （Thr）殘基相連］和C-甘露糖基化［其中甘露糖與蛋白質(zhì)的色氨酸（Trp）相連］等。蛋白糖基化的異常修飾與多種發(fā)育障礙和腫瘤進(jìn)展有關(guān)［19-20］。其中在肺纖維化中，可以通過(guò)取代TGF-β的N-糖基化位點(diǎn)，進(jìn)而抑制TGF-β的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞黏附性的喪失［21］。此次研究對(duì)TGF-β翻譯后糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，其具有4個(gè)N-糖基化和15個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。目前，糖蛋白是臨床上最常用的癌癥生物標(biāo)志物和藥物靶向作用位點(diǎn)，因此，本研究對(duì)TGF-β翻譯后糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析也為肺纖維化等疾病提供新的治療思路。

磷酸化修飾是真核生物蛋白質(zhì)翻譯后廣泛存在的重要修飾方式，其能夠調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期等諸多細(xì)胞過(guò)程。當(dāng)這種修飾發(fā)生異常時(shí)，常常與疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)聯(lián)［22］。哺乳動(dòng)物中TGF-β具有3種亞型，即TGF-β1、β2和β3，由不同的基因編碼，但通過(guò)相同的信號(hào)系統(tǒng)發(fā)揮作用［23］。TGF-β家族成員通常以無(wú)活性的潛伏形式分泌并沉積在ECM中，需要經(jīng)過(guò)蛋白水解過(guò)程來(lái)產(chǎn)生活性配體。二聚體TGF-β通過(guò)與TβRII絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)合并隨后在質(zhì)膜中募集I型受體（TβRI）來(lái)發(fā)揮其功能，與TβRII結(jié)合后，TβRI隨后被TβRII磷酸化，TβRII通過(guò)SMAD 2/3蛋白的磷酸化傳遞信號(hào)［24］。磷酸化可以促使SMAD 2/3與SMAD 4蛋白形成異聚復(fù)合物并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。SMAD復(fù)合物通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。研究表明，抑制TGF-β和SMAD 2/3時(shí)，可以抑制垂體腺瘤和肺癌的細(xì)胞生長(zhǎng)［25-26］。此外，抑制TGF-β的磷酸化可以降低胃癌的侵襲能力［27］。在臨床上，TGF-β受體激酶的小分子抑制劑（small-molecule inhibitors，SMI）更受歡迎，因?yàn)樗鼈兘?jīng)濟(jì)、易于生產(chǎn)、穩(wěn)定，并且可以通過(guò)口服給藥［24］。這些抑制劑是ATP類似物，旨在通過(guò)阻斷TβRI的激酶活性位點(diǎn)來(lái)特異性抑制R-SMAD磷酸化。代表性的SMI有SB431542、SB505124、LY2157299和LY550410等［28］。本研究分析結(jié)果顯示，TGF-β分別具有21個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、8個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和3個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。TGF-β的磷酸化修飾涉及到其調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞免疫等許多生物過(guò)程，對(duì)生命體有著重要的作用。這些磷酸化位點(diǎn)可能是潛在的臨床治療靶點(diǎn)。這也為研究TGF-β在細(xì)胞生理活動(dòng)中的功能及機(jī)制提供了參考依據(jù)。

對(duì)TGF-β與腫瘤的相關(guān)性分析顯示，TGF-β在GBM、HNSC、KIRC、LGG、PAAD和STAD中高表達(dá)，在ACC、THYM和UCEC中低表達(dá)。在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞不斷與周圍的微環(huán)境進(jìn)行通信，從而引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行EMT。EMT被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，本研究中TGF-β的表達(dá)量變化往往與其發(fā)揮著的重要功能密切相關(guān)。例如，WNT/TGF-β的高表達(dá)在HNSC［29］中抑制M1型巨噬細(xì)胞的激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT。FUBP1通過(guò)抑制TGF-β/SMAD在PAAD中的表達(dá)，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力［30］。對(duì)TGF-β的預(yù)后分析顯示，TGF-β高表達(dá)與LGG和STAD患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。生存率是一個(gè)評(píng)價(jià)癌癥治療效果的重要指標(biāo)，其中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致預(yù)后不良的重要生物學(xué)特征。TGF-β的高表達(dá)導(dǎo)致患者的生存率顯著下降，因此，在臨床上可以通過(guò)檢測(cè)TGF-β的表達(dá)量變化，進(jìn)而達(dá)到預(yù)測(cè)LGG和STAD患者預(yù)后的變化情況。

總之，本研究利用生物信息學(xué)的方法對(duì)TGF-β的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)以及與腫瘤的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，TGF-β是一種堿性、不穩(wěn)定的疏水性蛋白，具有信號(hào)肽且主要在細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)揮作用。此外，TGF-β在多種腫瘤中高表達(dá)并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。這些結(jié)果將對(duì)進(jìn)一步研究TGF-β在生命活動(dòng)中的作用機(jī)制提供新的思路和依據(jù)。