纖維素酶法提取金銀花中綠原酸工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

楊紅文，彭福潤

（閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000）

金銀花，又名金藤花，是忍冬科忍冬屬植物的干燥花蕾，有宣散風(fēng)熱、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)等作用，是傳統(tǒng)的中藥材，是連花清瘟膠囊、金花清感顆粒、雙黃連等多種清火中藥處方的組分。綠原酸為金銀花主要活性成分[1]，綠原酸含量多少是判斷金銀花質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)[2]，綠原酸具有降血壓、降血脂、抗菌、抗病毒、抗腫瘤和清除自由基等作用[3-8]，在醫(yī)藥、保健、食品等行業(yè)具有很大的應(yīng)用價值。

水提法和有機溶劑浸提法是金銀花中綠原酸提取的兩種傳統(tǒng)方法，前者耗時長、效率低、雜質(zhì)多[9]，后者雖然耗時短、提取率高、雜質(zhì)少，但存在有機溶劑殘留問題[10]。纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，纖維素酶可以降解植物細(xì)胞壁纖維素，促使活性成分溶出，提高其得率，還能避免水提法的高溫對活性成分的破壞[11]。本試驗首次采用纖維素酶提取金銀花中的綠原酸，在探討纖維素酶添加量、pH值、提取溫度、提取時間和料液比對提取率影響的基礎(chǔ)上，采用正交優(yōu)化得出最佳提取工藝，并以維生素C為陽性對照，采用鐵離子還原法和羥自由基清除試驗確定所得金銀花綠原酸提取液的體外抗氧化活性，為金銀花中綠原酸的活性研究及其在醫(yī)藥、食品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花（產(chǎn)地安徽省蕪湖）：蕪湖市徽福茶葉有限公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）：合肥博美生物科技有限公司；纖維素酶（粉末制劑，酶活≥15 000 U/g）、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、水楊酸、雙氧水、硫酸亞鐵、抗壞血酸（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

FW100型萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；TP-114型電子分析天平：上海精天電子儀器公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；UV-1100PC型紫外/可見分光光度計：廈門精藝興業(yè)科技有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：河南省予華儀器有限公司；DHG-101-4A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取5.0 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度線，再吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別用無水乙醇稀釋并定容至10 mL，得到 0、2、4、6、8、10mg/L 系列濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液。以無水乙醇為空白對照，在波長328nm下測定吸光度[12]。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=0.043 2x+0.001 3，R2=0.999 2。

1.2.2 金銀花綠原酸的提取及含量測定

將金銀花樣品經(jīng)60℃烘干至恒重后粉碎過80目篩備用，用電子分析天平準(zhǔn)確稱取1.0 g金銀花粉末，放入50 mL錐形瓶中，加入適量蒸餾水并輕輕攪拌，靜置30 min后加入一定量50℃活化15 min的纖維素酶，調(diào)節(jié)pH值，置于特定溫度的恒溫水浴鍋中提取一定時間。提取液經(jīng)真空抽濾兩次合并濾液，用蒸餾水定容至100 mL，準(zhǔn)確量取1 mL，用蒸餾水稀釋并定容至50 mL，得到待測液，于328 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算綠原酸濃度，并按下式計算綠原酸提取率。

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的綠原酸濃度，mg/L；N 為稀釋倍數(shù)，50；V 為提取液總體積，0.1 L；M為金銀花粉末質(zhì)量，1 g。

1.2.3 單因素試驗及正交試驗

分別對提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、提取時間（30、40、50、60、70 min）、料液比[1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）]、纖維素酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、pH 值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）進(jìn)行單因素試驗，研究各因素對金銀花綠原酸提取率的影響，并選擇提取溫度、提取時間、纖維素酶添加量、pH值進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交試驗，確定金銀花綠原酸提取的最佳工藝參數(shù)。

1.2.4 鐵離子還原能力測定

參考浦躍武等[13]的方法略作修改，將綠原酸提取液減壓蒸發(fā)濃縮后用蒸餾水稀釋制備成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL濃度梯度，并分別吸取2 mL加入6支試管；再向每支試管分別加入磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）及1%鐵氰化鉀溶液各2 mL，振蕩混勻并于50℃水浴20 min，置于冰盆中快速冷卻終止反應(yīng)，各加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，輕輕振蕩混合均勻，各取2 mL置于6支新試管，再向新試管中分別加入2 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，26℃靜置10 min。以不添加綠原酸提取液的反應(yīng)液為空白對照調(diào)零，700 nm處測定吸光值，以維生素C作為對照。

1.2.5 羥自由基清除率測定

參考羅敏等[14]的方法略作修改，將制備的0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 綠原酸提取液 2 mL 分別加入6支試管，向每支試管加入硫酸亞鐵溶液（8 mmol/L）和水楊酸-乙醇溶液（8 mmol/L）各2 mL，再各加入2 mL雙氧水（8.8 mmol/L），同時設(shè)置以蒸餾水替代雙氧水的本底對照，輕輕振蕩混勻，26℃靜置45 min進(jìn)行羥自由基清除試驗，510 nm處測吸光值，按下式計算羥自由基清除率。以維生素C作為對照。

式中：A空白為不添加綠原酸提取液的空白對照吸光值；A樣品為加不同濃度綠原酸提取液后的吸光值；A本底為蒸餾水替代顯色劑雙氧水的本底對照吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對綠原酸提取率的影響

在料液比1∶25（g/mL）、纖維素酶添加量0.3%、pH5.0、提取時間50 min時，提取溫度對綠原酸提取率的影響見圖1。

圖1 提取溫度對綠原酸提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of chlorogenic acid

從圖1中可以看出，在30℃～70℃溫度范圍內(nèi)，金銀花綠原酸提取率呈先升后降的趨勢，在50℃時提取率最大。提取溫度低于50℃時，纖維素酶活性隨溫度升高而增加，加速了金銀花細(xì)胞壁纖維素的降解，同時分子熱運動加劇及綠原酸溶解度升高，綠原酸溶出加速，提取率升高。當(dāng)提取溫度超過50℃后，纖維素酶活性下降，金銀花細(xì)胞壁纖維素降解程度減弱，綠原酸溶出減少，且隨著提取溫度進(jìn)一步升高，綠原酸更易被氧化[15]，提取率下降。因此選擇提取溫度40、50、60℃進(jìn)行正交試驗。

2.2 提取時間對綠原酸提取率的影響

在料液比1∶25（g/mL）、纖維素酶添加量0.3%、pH5.0、提取溫度50℃時，提取時間對綠原酸提取率的影響見圖2。

圖2 提取時間對綠原酸提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of chlorogenic acid

從圖2中可以看出，隨著提取時間延長，纖維素酶對金銀花細(xì)胞壁纖維素分解更加充分，且隨著時間延長，綠原酸溶出增多，提取率升高，50 min時，提取率達(dá)到最高。繼續(xù)延長提取時間，提取率不升反降，可能是因為長時間提取，金銀花綠原酸溶出基本達(dá)到平臺期，且長時間較高溫提取，綠原酸氧化破壞加劇，使綠原酸提取率下降[16]，也可能是綠原酸在有光條件下更容易分解，導(dǎo)致綠原酸提取率下降[17]。因此選擇提取時間40、50、60 min進(jìn)行正交試驗。

2.3 料液比對綠原酸提取率的影響

在纖維素酶添加量0.3%、pH5.0、提取溫度50℃、提取時間50 min時，料液比對綠原酸提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對綠原酸提取率的影響Fig.3 Effect of solid liquid ratio on the yield of chlorogenic acid

從圖3中可以看出，金銀花綠原酸提取率隨溶劑體積增加逐漸增大，料液比1∶30（g/mL）時提取率達(dá)到最大，之后略有下降。在一定范圍內(nèi)，隨著溶劑體積增加，金銀花中綠原酸溶出增加，提取率上升，液料比達(dá)到1∶30（g/mL）時，金銀花中綠原酸溶出基本完全，不再隨著溶劑體積增加而更多溶出，反而會隨著溶劑體積增加，pH值有所上升，導(dǎo)致綠原酸部分水解，提取率略有下降[17]。但整體看，料液比對綠原酸提取率影響并不明顯，因此選取料液比為1∶30（g/mL），不再進(jìn)行后續(xù)正交試驗。

2.4 纖維素酶添加量對綠原酸提取率的影響

在料液比 1∶25（g/mL）、提取溫度 50 ℃時、pH5.0、提取時間50 min，纖維素酶添加量分別為金銀花質(zhì)量的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%時，探究纖維素酶添加量對綠原酸提取率的影響，結(jié)果見圖4。

從圖4中可以看出，隨著纖維素酶添加量增加，金銀花綠原酸提取率逐漸升高，當(dāng)纖維素酶添加量為0.4%時提取率達(dá)到38.62 mg/g，之后隨著纖維素酶添加量增加，提取率不再升高。0.4%的纖維素酶添加量對金銀花細(xì)胞壁纖維素的酶解已基本飽和[18]。因此選擇纖維素酶添加量0.3%、0.4%、0.5%進(jìn)行正交試驗。

圖4 纖維素酶添加量對綠原酸提取率的影響Fig.4 Effect of cellulase dosage on the yield of chlorogenic acid

2.5 pH值對綠原酸提取率的影響

在料液比 1∶25（g/mL）、纖維素酶添加量 0.3%、提取溫度50℃、提取時間50 min時，提取液的pH值對綠原酸提取率的影響見圖5。

圖5 pH值對綠原酸提取率的影響Fig.5 Effect of pH value on the yield of chlorogenic acid

從圖5中可以看出，提取最佳pH值為4.5，此時提取率最高，達(dá)40.02 mg/g，pH值升高或下降，提取率均降低。纖維素酶的最適pH值在5.0左右，而綠原酸在pH3.0時最穩(wěn)定，分解最少[19]，綜合看來，pH4.5左右能夠兼顧酶的最大催化活性和綠原酸的穩(wěn)定性。因此選擇pH值為4.0、4.5、5.0進(jìn)行正交試驗。

2.6 正交試驗結(jié)果分析

正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

從表 1 中可以看出，極差 RC＞RA＞RB＞RD，故影響纖維素酶法提取金銀花中綠原酸的因素次序：纖維素酶添加量＞提取溫度＞提取時間＞pH值，最優(yōu)提取條件組合為A2B2C2D2，而最優(yōu)組合未出現(xiàn)在正交試驗組中，按照最佳組合的提取條件進(jìn)行驗證試驗，6次平行驗證試驗得到綠原酸提取率均值為（40.10±0.34）mg/g，高于正交試驗實際最優(yōu)組合（39.65 mg/g），且重復(fù)性良好，故纖維素酶提取金銀花中綠原酸的最佳組合條件為提取溫度50℃、提取時間50 min、纖維素酶添加量0.4%、pH4.5。

表1 正交試驗結(jié)果Table 1 The results of orthogonal test

2.7 金銀花綠原酸提取液的鐵離子還原能力

金銀花綠原酸提取液鐵離子還原能力見圖6。

圖6 綠原酸提取液鐵離子還原能力Fig.6 Ferric ion reducing capacity of chlorogenic acid extract

從圖6中可以看出，在質(zhì)量濃度0～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，金銀花綠原酸提取液和維生素C均可還原鐵離子形成普魯士藍(lán)，且都呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，在相同質(zhì)量濃度下，金銀花綠原酸提取液還原鐵離子的能力比維生素C強。金銀花綠原酸提取液對鐵離子的強還原性可能和其分子內(nèi)的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)更容易提供氫質(zhì)子或電子有關(guān)[20]。

2.8 金銀花綠原酸提取液的羥自由基清除能力

金銀花中綠原酸提取液的羥自由基清除能力見圖7。

圖7 綠原酸提取液對羥自由基的清除率Fig.7 Hydroxyl radical scavenging rate of chlorogenic acid

從圖7中可以看出，金銀花中綠原酸提取液和維生素C都有較強的羥自由基清除能力，且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)，但在各質(zhì)量濃度下，金銀花綠原酸提取液的羥自由基清除率均高于維生素C，0.5 mg/mL的綠原酸提取液羥自由基清除率達(dá)44.51%，明顯高于相同濃度維生素C的清除率（28.48%），金銀花提取液的較高的羥自由基清除率也和其鄰苯二酚結(jié)構(gòu)有關(guān)[20]。

3 結(jié)論

纖維素酶法提取金銀花中綠原酸最佳工藝為提取溫度50℃、提取時間50 min、纖維素酶添加量0.4%、pH4.5，此條件下綠原酸提取率為40.10 mg/g；所得綠原酸提取液對鐵離子還原能力和羥自由基清除率均高于相同濃度維生素C。