白首烏酵素對癲癇小鼠認知損傷影響研究

吳雋松，滕飛翔，楊留才*

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學部，江蘇 鹽城 224005）

白首烏（Cynanchum auriculatum）為蘿藦科鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消，其含有多糖、黃酮、蛋白以及一些功效成分如告達庭-3-O-β-D-磁麻糖苷、C21甾醇、γ-氨基丁酸、二苯乙烯苷等[1-3]，具有抗衰老、抗炎、抗氧化、護肝等功效[4]。酵素是以動物、植物、菌類等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的一類產(chǎn)品[5]。由于是通過微生物發(fā)酵制成，酵素可以抑制有害微生物的生長，有報道表明，酵素可對病原菌和腐敗細菌的生命活動，具有一定的環(huán)保應(yīng)用價值[6-7]。目前，李凡等[8]通過優(yōu)化乳酸菌和酵母菌單因素實驗條件，得到乳酸菌、酵母菌活菌數(shù)較高的新型白首烏酵素。對白首烏功效的研究也多集中在抗氧化、解酒和烏須黑發(fā)等功效[9]。以白首烏作為原料，經(jīng)發(fā)酵制成白首烏酵素的研究相對較少，關(guān)于白首烏酵素的其他功能研究也鮮有報道。

癲癇是一種慢性腦部疾病，表現(xiàn)為腦部神經(jīng)元過度放電所致突然的、短暫的、反復(fù)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)失常，同時出現(xiàn)相應(yīng)的認知、神經(jīng)生物學、心理學以及社會學等方面的后果[10-11]。據(jù)流行病學調(diào)研發(fā)現(xiàn)，癲癇的患病率為4‰～7‰，且逐年增高，目前全球約有6 500萬癲癇患者，80%的癲癇患者生活在發(fā)展中國家，由于經(jīng)濟、醫(yī)療技術(shù)等方面的問題，其中80%的患者得不到科學有效的診治[12-13]。而且，部分癲癇患者存在著不同程度和內(nèi)容的認知功能障礙，對個人、家庭和社會造成極大的危害和影響[14]。目前，抗癲癇藥物有苯妥英鈉、丙戊酸鈉、托吡酯、奧卡西平、加巴噴丁等，均有一定的不良反應(yīng)和藥物間的不良作用，并且仍有30%～40%的患者發(fā)展為難治性癲癇[15-16]。吳雋松等[17]研究發(fā)現(xiàn)，白首烏酒通過調(diào)控p38-絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，p38-MAPK）蛋白表達來實現(xiàn)對癲癇大鼠神經(jīng)元有保護作用[17]。趙健等[18]利用超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測定白首烏中γ-氨基丁酸含量，γ-氨基丁酸是人體神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)傳達物質(zhì)。但目前關(guān)于白首烏在神經(jīng)方面的應(yīng)用研究報道較少。

本研究以江蘇濱海白首烏為原料制備酵素，測定其有效成分二苯乙烯苷（2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（2,3,5,4'-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-d-glucoside，THSG））的含量，研究其對癲癇引起認知損傷的緩解作用研究。以戊四氮誘導建立癲癇小鼠模型，對無特定病原體（specific pathogen free，SPF）小鼠灌胃白首烏酵素，通過進行Morris水迷宮實驗、海馬體病理學檢測，血清和海馬體組織的抗氧化水平以及海馬體組織的炎癥水平、核因子-κB（nuclear factor，NF-κB）P65及其抑制蛋白IκB表達水平的測定，研究白首烏酵素對癲癇小鼠認知損傷的緩解影響，以期為白首烏功能食品的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

白首烏（Cynanchum auriculatum）：南京大華中藥店；安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）CGMCC1.2919、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC 1.571：中國普通微生物菌種保藏管理公司。

30只無特定病原體（SPF）級雄性昆明小鼠（6～8周，體質(zhì)量20～24 g），許可證號（SCXK[Jing]2015-0004）：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

淀粉酶（酶活50U/mg）、葡萄糖淀粉酶（酶活100000U/g）：上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純）、戊四氮（分析純）：美國Sigma公司；二苯乙烯苷（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（分析純）：上海吉至生化科技有限公司；4%組織細胞固定液、高效無線電免疫沉淀反應(yīng)試驗（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、脫脂奶粉：北京索萊寶科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：北京盒子生工有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜：邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S1-M81磨粉機：九陽股份有限公司；YP2001B電子天平：上海力辰儀器科技有限公司；安捷倫C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國安捷倫公司；LC-20AT型高效液相色譜儀：日本島津公司；Gene&I Morris水迷宮：上海優(yōu)耳儀器科技有限公司；DYCZ-24N垂直電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Trans-Blot SD轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)：上海賽百奧科技有限公司；LHS-150恒溫培養(yǎng)箱：上海重逢科學儀器有限公司；CX23顯微鏡：上海普赫光電科技有限公司;Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)：美國LI-COR公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 白首烏酵素加工工藝流程與操作要點[9]

白首烏洗凈切塊→粉碎過篩→溶解→蒸煮、冷卻→接種兩種酶→水解→糖化、液化→離心→接種→發(fā)酵及后熟→白首烏酵素

操作要點：白首烏洗凈后切塊、粉碎過50目篩，加入10倍體積水溶解，于100 ℃條件下煮30 min后，降溫至50～60 ℃，接入1%淀粉酶和0.2%葡萄糖淀粉酶，60 ℃恒溫水解60 min，進行糖化和液化。隨后于6 000 r/min離心5 min后取上清液，在115 ℃滅菌30 min后，先接種0.2%的已活化酵母菌（酵母菌接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基中于30 ℃活化培養(yǎng)12 h），30 ℃發(fā)酵24 h后，接種3%活化后（將菌株分別接種于MRS培養(yǎng)基中于37 ℃活化培養(yǎng)12 h）的混合乳酸菌（嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum））按照1∶1的比例混合，37 ℃發(fā)酵36 h，于溫度4～8 ℃發(fā)酵12 h后熟，即得白首烏酵素成品。

1.3.2 動物分組及癲癇模型的建立

30只無特定病原體（SPF）級雄性昆明小鼠置于通風良好的室內(nèi)，保持室溫為（22±2）℃，相對濕度（45±5）%，自由飲水攝食，維持12/12 h明暗交替光照，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進行后續(xù)實驗。實驗符合江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院動物倫理委員會的要求。將動物隨機分為3組：空白對照組、癲癇模型組、白首烏酵素組，每組10只，空白對照組灌胃1.2 mL/kg生理鹽水和腹腔注射37 mg/kg生理鹽水；癲癇模型組灌胃1.2 mL/kg生理鹽水同時腹腔注射37 mg/kg戊四氮；白首烏給藥組灌胃1.2 mL/（kg·d）白首烏酵素同時腹腔注射37 mg/kg戊四氮。灌胃每日一次，腹腔注射兩日一次，實驗共計28 d。按照癲癇發(fā)作Racine分級標準（0級為無驚厥；I級為面部陣攣；Ⅱ級為面部陣攣＋節(jié)律性點頭；Ⅲ級為面部陣攣＋節(jié)律性點頭＋前肢陣攣；Ⅳ級為面部陣攣＋節(jié)律性點頭＋前肢陣攣＋后肢站立；Ⅴ級為面部陣攣＋節(jié)律性點頭＋前肢陣攣＋后肢站立＋跌倒，依據(jù)Racine分級，Ⅲ級及其以上標準即可認為成功建立癲癇模型）[19-20]，癲癇模型組與白首烏酵素組小鼠均達到Ⅳ級，癲癇模型建立成功。

1.3.3 白首烏酵素對癲癇小鼠認知功能的影響

采用Morris水迷宮實驗研究白首烏酵素對癲癇小鼠的認知功能影響，經(jīng)典的Morris水迷宮測試程序主要包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分，基于之前文獻報道并進行適當調(diào)整[21]，即最后一次注射戊四氮后24 h，采用定位航行實驗、空間探索實驗分別測定各組小鼠空間學習和空間記憶能力。

定位航行實驗：將小鼠在四個象限面朝池壁輕放入水中，記錄60 s內(nèi)小鼠入睡后爬上水下平臺的時間間隔即逃避潛伏期，如果60 s后小鼠未找到平臺，記為60 s，實驗為期5 d。每天訓練4次，每次間隔15 min。

空間探索實驗：上述實驗結(jié)束后，撤走水下平臺，將小鼠從水迷宮正中入水，記錄60 s內(nèi)小鼠跨越原平臺的次數(shù)。

1.3.4 小鼠海馬體組織病理學檢測

實驗結(jié)束后，將小鼠腦組織取出后，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、包埋等步驟后進行蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色，最后利用顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 二苯乙烯苷的高效液相色譜檢測

二苯乙烯苷標準品溶液的制備：準確稱取二苯乙烯苷標準品350 μg，用10 mL甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為350 μg/mL的二苯乙烯苷標準溶液。

白首烏酵素二苯乙烯苷提取物的制備：參考文獻[22]的方法并適當調(diào)整，利用大孔吸附樹脂LSA-21對酵素中的二苯乙烯苷進行吸附，洗脫后得到二苯乙烯苷提取物，用0.22 μm的濾膜過濾備用。

高效液相色譜條件：C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（30∶70）（V/V）；檢測器：SPD-10Av檢測器；檢測波長：224 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min。

定性與定量方法：以二苯乙烯苷標準品的保留時間為樣品二苯乙烯苷的定性依據(jù)，采用外標法，以二苯乙烯苷標準品的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積（Y）為縱坐標，得到線性回歸方程為Y=38.94X+5.28，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，按照回歸方程對樣品中的二苯乙烯苷定量分析。

1.3.6 ELISA檢測小鼠血清和海馬體組織的抗氧化水平和炎癥因子水平

小鼠心臟取血后室溫靜置30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒的步驟測定小鼠血清的SOD、MDA水平。將小鼠海馬體組織用勻漿機破碎后，于4 ℃離心（14 000 r/min，15 min）后取上清液，按照ELISA試劑盒的步驟測定小鼠海馬體組織的SOD、MDA及的TNF-α、IL-1β[23-25]。

1.3.7 Western blot檢測NF-κB P65和IκB蛋白表達水平

將小鼠海馬體組織取出后，加入含有3 μL苯甲基磺酰氟（PMSF）的300 μL RIPA組織裂解液，在液氮預(yù)冷的組織勻漿機勻漿。然后至于冰上裂解30 min。裂解30 min后，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心5 min，取上清用BCA試劑盒測定組織蛋白含量。測定后分裝，按1∶4的比例加入5×上樣緩沖溶液，煮沸5 min，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳然后，利用轉(zhuǎn)膜儀將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜在含5%脫脂奶粉的洗膜緩沖液（Tris buffered saline tween，TBST）中封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育，二抗孵育1 h，最后利用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)成像。

1.3.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”的形式表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0軟件，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，P＜0.05為統(tǒng)計學差異。作圖軟件采用Origin8.5，Western blot條帶采用Image J V1.8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 白首烏酵素中二苯乙烯苷含量

通過高效液相色譜法測定白首烏酵素中二苯乙烯苷的含量，結(jié)果如圖1所示，二苯乙烯苷標準品、樣品的出峰時間分別為28.34 min、28.50 min，通過計算得出，白首烏酵素中二苯乙烯苷的質(zhì)量濃度為78.18 μg/mL。

圖1 二苯乙烯苷標準品（A）和樣品（B）的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of stilbene glycoside standard (A) and the sample (B)

2.2 白首烏酵素對癲癇小鼠認知功能的影響

采用Morris水迷宮實驗研究白首烏酵素對癲癇小鼠的認知功能影響，結(jié)果見表1。由表1可知，與空白對照組相比，癲癇模型組小鼠潛伏期顯著延長、跨越平臺次數(shù)顯著減少（P＜0.05），潛伏期由11.85 s延長至35.71 s（延長2.01倍），跨平臺次數(shù)由12.99次減少至5.38次（減少58.6%），這與張高煉等[26]建立癲癇大鼠模型結(jié)果相一致；而白首烏酵素的攝入可顯著減緩這種趨勢，即與癲癇模型組相比，白首烏酵素組小鼠潛伏期顯著縮短，跨越平臺次數(shù)顯著增加（P＜0.05），潛伏期由35.71 s縮短至15.12 s（縮短57.7%），跨平臺次數(shù)由5.38次增加至9.86次（增加83.3%）。表明白首烏酵素可有效改善癲癇小鼠的認知損傷功能。

表1 小鼠Morris水迷宮實驗Table 1 Morris water maze experiment of mice

2.3 白首烏酵素對癲癇小鼠腦組織海馬體組織的影響

對各組小鼠腦組織海馬體組織部分進行HE染色，結(jié)果見圖2。由圖2A可知，空白對照的小鼠海馬區(qū)的錐體細胞分布均勻、排列整齊、細胞形態(tài)完整、輪廓清晰，且頂狀樹突明顯；由圖2B可知，癲癇模型組與空白對照差異較明顯，即在戊四氮誘導的癲癇小鼠腦組織海馬區(qū)的錐細胞分布雜亂、細胞腫脹變圓、輪廓不清晰，且頂狀樹突消失。由圖2C可知，白首烏酵素組可明顯的緩解這種損傷，呈現(xiàn)海馬區(qū)錐細胞分布相對較整齊、大部分細胞形態(tài)完整，輪廓較清晰，頂狀樹突較明顯?？赡苁怯捎诎资诪踅退乜梢源龠M戊四氮代謝，減少其吸收，或者干擾其對海馬體錐體細胞作用。

圖2 白首烏酵素對空白對照組（A）、癲癇模型組（B）、白首烏酵素組（C）小鼠海馬體組織的影響（400×）Fig.2 Effect of Cynanchum auriculatum ferment on hippocampal tissue of mice in the blank control group (A),epilepsy model group (B),and Cynanchum auriculatum ferment group (C)（400×）

2.4 白首烏酵素對癲癇小鼠血清、海馬體中SOD酶活和MDA含量的影響

利用ELISA試劑盒對各組小鼠血清、海馬體中SOD、MDA水平進行測定，結(jié)果見表2。由表2可知，與空白對照組相比，癲癇模型組小鼠血清中SOD酶活顯著降低（P＜0.05）、MDA水平顯著增加（P＜0.05），SOD酶活由88.53 U/mL降低至67.59U/mL，MDA含量由9.26nmol/mL增加至13.84nmol/mL。與癲癇模型組相比，白首烏酵素可以增加癲癇小鼠血清中的SOD酶活，降低MDA水平，SOD酶活由67.59 U/mL增加至80.43 U/mL（增加19.9%），MDA含量由13.84 nmol/mL減少至11.62 nmol/mL（減少16.0%）。白首烏酵素組小鼠血清中SOD、MDA水平與空白組無顯著差異（P＞0.05），表明白首烏酵素可以顯著提高癲癇小鼠血清的抗氧化水平。

表2 白首烏酵素對癲癇小鼠血清、海馬體組織中SOD酶活和MDA含量的影響（n=10）Table 2 Effect of Cynanchum auriculatum ferment on SOD enzyme activity and MDA content in serum and hippocampal tissue of epileptic mice（n=10）

與空白對照組相比，癲癇模型小鼠的海馬體SOD酶活由142.84 U/mL顯著降低至90.53 U/mL，而MDA水平由4.38 nmol/mL顯著增加至7.32 nmol/mL；而白首烏酵素可以顯著增加癲癇小鼠海馬體組織中的SOD酶活（P＜0.05），顯著降低MDA水平（P＜0.05），即與癲癇模型組小鼠相比，白首烏酵素組小鼠海馬體由SOD酶活由90.53 U/mL增加至120.71 U/mL（增加33.3%），MDA含量由7.32 nmol/mL減少至5.39 nmol/mL（降低26.4%）。此外，白首烏酵素組小鼠海馬體組織中MDA水平與空白組無顯著差異（P＞0.05），表明白首烏酵素可以顯著提高癲癇模型組小鼠海馬體組織的抗氧化水平（P＜0.05）。

2.5 白首烏酵素對癲癇小鼠海馬體組織炎癥因子水平影響

YAFFE K等[27]研究發(fā)現(xiàn)，炎癥、代謝綜合癥對其認知功能有一定影響。本實驗利用ELISA試劑盒對各組小鼠海馬體組織的炎癥因子TNF-α、IL-1β進行測定，結(jié)果見表3。

表3 濱海白首烏酵素對癲癇小鼠海馬體組織TNF-α和IL-1β水平的影響Table 3 Effect of Cynanchum auriculatum ferment on TNF-α and IL-1β levels in hippocampal tissue of epileptic mice

由表3可知，與空白對照組相比，癲癇模型組小鼠海馬體組織中TNF-α、IL-1β水平顯著升高（P＜0.05），TNF-α含量由33.85 pg/mg增加至56.32 pg/mg，IL-1β含量由19.86 pg/mg增加至30.20pg/mg。與癲癇模型組相比，白首烏酵素組可顯著降低TNF-α、IL-1β水平（P＜0.05），TNF-α含量由56.32 pg/mg減少至40.66 pg/mg（減少27.8%），IL-1β含量由30.20減少至23.98 pg/mg（減少20.6%），表明白首烏酵素組具有減輕癲癇引起的海馬體炎癥作用。

2.6 NF-κB P65和IκB蛋白表達水平

NF-κB信號通路在機體的多種生理過程中起重要作用。NF-κB信號通路不僅參與機體免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及腫瘤的生理病理過程，還參與感染、細胞感染、凋亡等[28]。本研究利用Western blot實驗研究白首烏酵素對癲癇小鼠海馬體組織NF-κB P65和IκB蛋白表達水平影響，結(jié)果如圖3所示，與空白對照組相比，戊四氮誘導癲癇模型小鼠海馬體組織中p-NF-κB P65和p-IκB蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），p-NF-κB P65和p-IκB蛋白表達水平分別升高至145.2%，158.3%，而白首烏酵素可顯著緩解增加趨勢，即與癲癇模型組相比，白首烏酵素組顯著降低了p-NF-κB P65和p-IκB蛋白表達水平（P＜0.05），p-NF-κB P65和p-IκB蛋白表達水平分別降低至121.6%，119.1%，表明白首烏酵素可以降低NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達水平。

3 結(jié)論

以新鮮濱海白首烏為原料經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制得白首烏酵素，經(jīng)高效液相色譜法測定的二苯乙烯苷的質(zhì)量濃度為78.18 μg/mL，由戊四氮構(gòu)建癲癇小鼠模型，對SPF級小鼠連續(xù)灌胃濱海白首烏酵素。結(jié)果表明，白首烏酵素的攝入可提高癲癇小鼠的空間學習和記憶能力，緩解海馬體組織損傷、提高癲癇小鼠血清和海馬體組織的抗氧化能力以及降低海馬體組織炎癥因子水平，表明濱海白首烏酵素具有較好的緩解癲癇引起的認知損傷、抗氧化和抗炎效果，且其作用機制與調(diào)節(jié)NF-κB信號通路有關(guān)。