過表達(dá)Ctnnb1慢病毒及其穩(wěn)轉(zhuǎn)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞株的構(gòu)建

徐康喬，韋雅芹，周長(zhǎng)喜，夏世金

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院上海市老年醫(yī)學(xué)研究所，上海200040；2. 解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心老年醫(yī)學(xué)科，北京100853

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease， COPD）是1 種常見的、可預(yù)防且可治療的疾病，其特征是出現(xiàn)持續(xù)性的呼吸道癥狀和氣流受限，可進(jìn)展為慢性喘息性支氣管炎或肺氣腫［1］。病因多為接觸有毒顆?；驓怏w等理化因素刺激。COPD 在老年人中有很高的患病率，我國≥70 歲老年人的COPD患病率高達(dá)35.5%［2］。COPD 患者由于呼吸道氣流受限常處于慢性低氧狀態(tài)，出現(xiàn)肺血管普遍收縮與肺動(dòng)脈壓力上升，進(jìn)而發(fā)展為肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PH），稱為慢性阻塞性肺疾病相關(guān)肺動(dòng)脈高壓（chronic obstructive pulmonary disease associated pulmonary hypertension，COPD-PH）。COPD-PH 嚴(yán)重影響老年患者的健康，缺少有效的治療手段［3］。COPD-PH發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，深入研究其機(jī)制是發(fā)掘老年COPD-PH 診治新方法的基礎(chǔ)。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）與老年COPD-PH 的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［4-5］，且有研究［6-7］顯示，MSC 對(duì)COPD-PH作用源于MSC 旁分泌的外泌體，用MSC 的外泌體代替MSC 本身的功能來干預(yù)老年COPD-PH，其優(yōu)點(diǎn)是成分確定且使用方便［7-8］。研究［9-10］表明，細(xì)胞中基因過表達(dá)或抑制表達(dá)后，細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中所包含的這些基因的蛋白產(chǎn)物也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，這樣就可通過控制MSC 中COPD-PH 相關(guān)基因的表達(dá)，研究MSC 外泌體中的這些基因的產(chǎn)物對(duì)老年COPD-PH 的影響。Ctnnb1 信號(hào)通路與PH 的密切相關(guān)［11］，推測(cè)Ctnnb1 在COPD-PH 發(fā)生中起著調(diào)節(jié)作用。因此，本研究構(gòu)建過表達(dá)大鼠Ctnnb1 （catenin beta 1）慢病毒載體，建立過表達(dá)Ctnnb1 的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）穩(wěn)轉(zhuǎn)株，為后續(xù)研究過表達(dá)Ctnnb1 的MSC 產(chǎn)生的外泌體對(duì)老年COPD-PH 的作用和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

PCR 引物、陽性克隆測(cè)序和丙烯酰胺（上海生工生物工程有限公司）；KOD-Plus-Neo PCR 酶（TOYOBA 上海生物科技有限公司）；BamHI、XhoI （Fermentas 中國有限公司）；CaCl2、DMSO、SDS （美國Sigma公司）；DMEM、青霉素／鏈霉素、嘌呤霉素、α-MEM、胎牛血清（Thermo Scientific 有限公司）；DNA Ladder（TAKARA 生物科技有限公司）；Hieff Clone?Plus 一步法快速克隆試劑盒、Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR （gDNA digester plus）試劑盒、Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒、慢病毒包裝試劑盒、Tween-20 和胰酶（翌圣生物科技上海股份有限公司）；大鼠Ctnnb1 cDNA 克?。▋?yōu)寶生物技術(shù)有限公司）；LB、SOB 和SOC 培養(yǎng)基（美國Alfa Aesar 公司）；TEMED （碧云天生物技術(shù)有限公司）；Immobilon Western HRP 底物（默克集團(tuán)中國有限公司）；高純度質(zhì)粒抽提試劑盒（QIAGEN 上海有限公司）；DP107 高純度質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技北京有限公司）；瓊脂糖（BIO-RAD 生命醫(yī)學(xué)上海有限公司）；DNA 回收試劑盒（捷瑞生物工程有限公司）。

4℃和-20℃冰箱（西門子有限公司）； -80℃冰箱（海爾有限公司）；CO2培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)（Thermo Scientific 有限公司）；MiniSpin 離心機(jī)、PCR 儀（Eppendorf 中國有限公司）；化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（Tanon 科技有限公司）；Western Blot 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD 生命醫(yī)學(xué)上海有限公司）；低速離心機(jī)（東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；凝膠成像儀、TS-8S 搖床（其林貝爾儀器制造有限公司）；細(xì)菌培養(yǎng)箱、細(xì)菌搖床和恒溫水浴鍋（一恒科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)顯型干式加熱器（美國Talboys 有限公司）；移液器（Gilson 中國有限公司）；熒光顯微鏡（Olympus 有限公司）。

1.2 過表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 依據(jù)大鼠Ctnnb1 cDNA 序列以及PGMLV-CMV 載體的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增的引物，由于Ctnnb1 序列較長(zhǎng)，所以本研究設(shè)計(jì)了3 對(duì)引物對(duì)其分段擴(kuò)增，并在引物5'端引入線性化克隆載體末端的同源序列，設(shè)計(jì)的引物交給上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。見表1。

表1 Ctnnb1 引物序列

1.2.2 載體的雙酶切 （1）培養(yǎng)含有載體質(zhì)粒的菌液，第2 天后取5 mL 提取質(zhì)粒。（2）取1 μg 新鮮質(zhì)粒，用對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。酶切體系：1 μg 載體、3 μL green Buffer、 1.5 μL XhoI 和1.5 μL BamHI，用雙蒸水補(bǔ)足30 μL 總體積，37℃條件下反應(yīng)3 h。（3）對(duì)得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，完成后切下包括目的片段的膠條并溶解。（4）將全部回收液轉(zhuǎn)移到濾柱內(nèi)，離心分離載體片段，測(cè)量濃度。

1.2.3 擴(kuò)增目的片段 （1）將合成的引物稀釋成終濃度為10 μmol／L 的儲(chǔ)藏液。（2）利用稀釋的引物及Ctnnb1 模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。體系如下：1 μg 模板，2 μL 上游引物、2 μL 下游引物，1 μL KOD-Plus-Neo PCR 酶，5 μL dNTP，3 μL MgSO4和5 μL10 ×PCR Buffer，加雙蒸水使總體積到50 μL。94℃預(yù)變性2 min；98℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30 次。（3） PCR 結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收目的基因?；厥辗椒ㄍ啊?/p>

1.2.4 連接載體與目的片段 先測(cè)定回收載體和目的片段的濃度，然后連接過表達(dá)載體與目的片段。連接體系：插入片段1 ～3 擴(kuò)增產(chǎn)物100 ng，線性化克隆載體100 ng，4 μL 5 ×CE Buffer，2 μL 重組酶，加入雙蒸水使總體積到20 μL，于50℃反應(yīng)20 min，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)管置于冰上冷卻5 min，其中克隆載體和插入片段的用量依照Hieff Clone?Plus 一步法快速克隆試劑盒說明書上的公式計(jì)算得到。

1.2.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 取10 μL 連接產(chǎn)物加入解凍好的感受態(tài)細(xì)胞中，于冰上（4℃）放置30 min，之后于42℃水浴中90 s。然后迅速置于冰上（4℃），維持3 min。加入500 μL SOC 培養(yǎng)基，于37℃振蕩（225 rpm）培養(yǎng)45 min。然后3 000 rpm 離心2 min，棄掉900 μL 的上清液，將管底的菌液吹打散開，加入到含有載體的培養(yǎng)平板中，用涂布器涂勻，再倒置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。之后每個(gè)克隆選2 個(gè)送測(cè)序公司測(cè)序。

1.3 驗(yàn)證過表達(dá)載體

1.3.1 過表達(dá)質(zhì)粒的制備 將構(gòu)建好的過表達(dá)載體接種到5 mL LB 培養(yǎng)液里，37℃振蕩（220 rpm）過夜，然后用質(zhì)粒抽提試劑盒制備質(zhì)粒。

1.3.2 過表達(dá)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)293 細(xì)胞 在培養(yǎng)皿中每孔接種5 ×105個(gè)空白293 細(xì)胞，當(dāng)覆蓋率達(dá)80%的時(shí)候，行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將表達(dá)質(zhì)粒加入空白細(xì)胞液中，混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前2 h 換新鮮培養(yǎng)基。取2 μg 過表達(dá)質(zhì)粒、200 μL DMEM 和6 μL HG transgene reagent 配置轉(zhuǎn)染體系，混勻后，室溫放置20 min，均勻滴加到培養(yǎng)皿中，再置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 Western Blot 檢測(cè) 過表達(dá)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)293 細(xì)胞后，裂解細(xì)胞，再加5 ×loading buffer，金屬浴煮10 min，待恢復(fù)常溫后，加樣到SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)然后電泳，等到溴酚藍(lán)達(dá)到膠底部結(jié)束電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用TBST 溶液洗膜，一抗二抗孵育，再次洗膜后顯影。

1.4 慢病毒包裝

培養(yǎng)空白293 細(xì)胞，當(dāng)覆蓋率達(dá)80%的時(shí)候，更換新鮮的培養(yǎng)基。2 h 后，按1 mL DMEM、10 μg 過表達(dá)質(zhì)粒、10 μL Lentiviral Mix 和60 μg HG transgene reagent 配置轉(zhuǎn)染體系，滴加到293 細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待12 h 后，每個(gè)培養(yǎng)皿滴加100 μL 100 × Enhancing buffer 促進(jìn)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染20 h后，換新鮮培養(yǎng)基。48 h 后，離心過濾濃縮所得濾器上層中的液體就是病毒濃縮液，于-80℃保存。

1.5 測(cè)定病毒滴度

當(dāng)293 細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，第1 天按每孔2 ×105個(gè)細(xì)胞接種孔板，培養(yǎng)過夜；第2 天，將保存的病毒液融化進(jìn)行梯度稀釋，1 號(hào)稀釋液，10 μL 病毒液+90 μL 培養(yǎng)基；2 ～4 號(hào)稀釋液，皆為10 μL 前一號(hào)稀釋液用培養(yǎng)基稀釋至1／10 所得。再將稀釋液全部加入相應(yīng)細(xì)胞孔中，培養(yǎng)過夜；把濃度已知的對(duì)照病毒加到1～4 號(hào)稀釋液中，未知樣品加到1 號(hào)與2 號(hào)稀釋液中。第5 天，提取RNA 準(zhǔn)備進(jìn)行RT-qPCR。

1.6 總RNA 抽提、反轉(zhuǎn)錄cDNA 與檢測(cè)

慢病毒感染細(xì)胞成功后，使用Trizol 液讓細(xì)胞全部裂解，離心提取RNA 后溶于DEPC 水中。然后每個(gè)樣本再加入2 μL 5 × gDNA digester Buffer 和1 μL gDNA digester，加雙蒸水使總體積達(dá)10 μL，混勻后42℃孵育2 min。然后向其中直接加入2 ×Hifair?ⅡSuperMix plus 10 μL，吹打混勻后依照25℃5 min、42℃30 min、85℃5 min 的反應(yīng)程序孵育，得到cDNA。然后進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增，體系如下：7.2 μL 超純水、10 μL 2 ×SYBR Mix、0.4 μL 上游引物、0.4 μL 下游引物、和2 μL 模板；PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性45 s；95℃變性15 s，60℃退火／延伸60 s，共循環(huán)40 次，融解曲線60℃→95℃。目的基因WPRE （woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element）和內(nèi)參基因GAPDH （glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）的檢測(cè)用引物序列見表2。

表2 檢測(cè)用引物序列

1.7 慢病毒感染MSC 構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株

第1 天，將大鼠MSC 接種于12 孔板中，每孔3 ×104個(gè)細(xì)胞。第2 天，用800 μL 完全培養(yǎng)基按MOI（multiplicity of infection） =100 稀釋病毒原液，吸除原有的培養(yǎng)基，將慢病毒液稀釋液的500 μL 培養(yǎng)基加到處理組MSC 中。第3 天，在感染16 h 后將含有慢病毒的培養(yǎng)液全換成1 mL 完全培養(yǎng)液。第5 天，用0.5 μg／mL嘌呤霉素篩選細(xì)胞，藥篩2 輪，4 d／輪，待細(xì)胞穩(wěn)定后使用含α-MEM+10%胎牛血清+1%青霉素／鏈霉素+0.5 μg／mL 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基維持，得到過表達(dá)大鼠Ctnnb1 基因的MSC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株和對(duì)照株。

1.8 Western Blot 檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染MSC 效果

過表達(dá)大鼠Ctnnb1 基因的MSC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株和對(duì)照株，用Western Blot 檢測(cè)的過表達(dá)效果，方法同1.3.3。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建Rat_Ctnnb1 過表達(dá)載體

本研究成功分3 段擴(kuò)增大鼠Ctnnb1 的cDNA 模板，并利用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)載體進(jìn)行雙酶切，再將2 者連接重組。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分別見圖1 和圖2。連接產(chǎn)物成功轉(zhuǎn)入制備好的293 細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序比較，重組克隆中插入序列和目的序列（大鼠Ctnnb1 編碼區(qū)）完全相同，因此目標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖3。

圖1 大鼠Ctnnb1cDNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 載體酶切后電泳圖

圖3 部分測(cè)序結(jié)果

2.2 過表達(dá)載體在293 細(xì)胞表達(dá)結(jié)果

用Rat_Ctnnb1 過表達(dá)載體瞬轉(zhuǎn)293 細(xì)胞，Western Blot 試驗(yàn)顯示過表達(dá)載體中標(biāo)簽蛋白表達(dá)成功。見圖4。

圖4 293 細(xì)胞Western Blot 反應(yīng)結(jié)果

2.3 病毒滴度的測(cè)定結(jié)果

經(jīng)過稀釋1 號(hào)孔與2 號(hào)孔分別含有0.01 mL 與0.001 mL 病毒液，提取總RNA 后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)，比較對(duì)照組和試驗(yàn)組的Ct值區(qū)別計(jì)算滴度，最后得到病毒滴度為1.09 ×108。見表3。

表3 病毒滴度測(cè)定結(jié)果

2.4 過表達(dá)載體在大鼠MSC 中的表達(dá)結(jié)果

用包裝好的Rat_Ctnnb1 過表達(dá)慢病毒感染大鼠MSC，得到過表達(dá)Ctnnb1 的大鼠MSC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株。經(jīng)Western Blot 試驗(yàn)提示過表達(dá)載體中標(biāo)簽蛋白表達(dá)顯著，構(gòu)建的過表達(dá)載體在大鼠MSC 中有很好的表達(dá)效果。見圖5。

圖5 穩(wěn)轉(zhuǎn)株的Western Blot 反應(yīng)結(jié)果

3 討論

由于我國人群的吸煙率高，以及空氣污染和煙霧相關(guān)的問題較多，故COPD 給我國人群造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，老年COPD 患者生活質(zhì)量與預(yù)期壽命下降、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)增加［12］。而PH 是老年COPD 患者的嚴(yán)重并發(fā)癥，30%～70%的老年COPD 患者并發(fā)PH［13］，導(dǎo)致患者住院率升高、住院時(shí)間延長(zhǎng)和病死率上升［14］。COPD-PH 常呈進(jìn)展性，發(fā)展至后期嚴(yán)重威脅老年患者的健康。對(duì)于平均肺動(dòng)脈壓＞25 mmHg 的COPD 患者，5年生存率為36%，而平均肺動(dòng)脈壓＜25 mmHg的患者為62%［15］。老年COPD-PH 機(jī)制尚未闡明，缺乏有效的治療方式［14］，因此深入研究其發(fā)生機(jī)制十分重要，是提高老年COPD-PH 患者生存時(shí)間和生存質(zhì)量的基石。

人類Ctnnb1 基因編碼的β-連環(huán)蛋白［16］，β-連環(huán)蛋白能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓的形成［17-18］。外泌體是MSC重要的旁分泌途徑［19-20］，外泌體中的蛋白會(huì)隨著細(xì)胞中對(duì)應(yīng)編碼基因的表達(dá)情況發(fā)生相應(yīng)的改變［9-10］。MSC 主要通過旁分泌產(chǎn)生的外泌體介導(dǎo)老年COPDPH 病理生理過程［6-7］，可以通過控制MSC 的基因表達(dá)來調(diào)節(jié)外泌體中的相關(guān)蛋白的表達(dá)［9-10］。據(jù)此推測(cè)過表達(dá)Ctnnb1 的MSC 通過其外泌體可以促進(jìn)老年COPD-PH 的發(fā)生，為驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，本研究首先構(gòu)建Ctnnb1 的慢病毒載體，并且轉(zhuǎn)染MSC，構(gòu)建過表達(dá)Ctnnb1 的MSC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株，為深入研究過表達(dá)Ctnnb1 的MSC 產(chǎn)生的外泌體對(duì)老年COPD-PH 的影響打下基礎(chǔ)。

慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個(gè)亞類，被廣泛用于構(gòu)建生物工程與基因治療的載體［21］。慢病毒載體作為常用的生物醫(yī)學(xué)科研的工具，有諸多優(yōu)點(diǎn)，包括能夠感染多種組織，不但可以感染增殖的細(xì)胞，還能感染停止增殖的細(xì)胞，穩(wěn)定地整合到目標(biāo)細(xì)胞的基因組，不生成具有免疫原性的蛋白質(zhì)，載體容量可達(dá)9 kb 左右［22-23］。為了構(gòu)建過表達(dá)Ctnnb1 的MSC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株，本研究首先構(gòu)建了過表達(dá)大鼠Ctnnb1 載體，再使用293細(xì)胞來包裝慢病毒。然后將包裝的慢病毒轉(zhuǎn)染MSC，Western Blot 檢測(cè)提示標(biāo)簽蛋白表達(dá)明顯，說明本研究成功構(gòu)建了過表達(dá)大鼠Ctnnb1 的MSC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株。本研究創(chuàng)新性地構(gòu)建了過表達(dá)大鼠Ctnnb1 慢病毒及其大鼠MSC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株，相對(duì)于過去的研究間接檢測(cè)Ctnnb1產(chǎn)物的表達(dá)，本研究采取的手段更為直接可控，然而本研究不能反應(yīng)Ctnnb1 受到抑制后PH 是否會(huì)緩解，因此下一步將利用慢病毒shRNA 干擾載體抑制Ctnnb1表達(dá)，以闡明Ctnnb1 在COPD-PH 發(fā)生發(fā)展中的潛在作用和機(jī)制。