不同粒徑輪胎微塑料對(duì)大型溞的慢性毒性研究

王寧，王梅，徐晨馨，許心怡，譚巧國(guó)，羅專(zhuān)溪,*

1. 華僑大學(xué)化工學(xué)院，廈門(mén) 361021 2. 廈門(mén)大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，廈門(mén) 361102

微塑料是指尺寸<5 mm的塑料或合成橡膠顆粒、碎片及纖維等。輪胎微塑料是環(huán)境中微塑料的重要來(lái)源之一[1-2]，廣泛分布于水、大氣和土壤等環(huán)境介質(zhì)中[3]。研究發(fā)現(xiàn)，常見(jiàn)地表水中輪胎微塑料的濃度為0.09～10 mg·L-1[3]，而河流沉積物中的濃度高達(dá)400～2 200 mg·kg-1[4]。輪胎微塑料的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、難降解、粒徑小且分布范圍廣，可在環(huán)境中持久存在，并吸附多種污染物，具有較高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

輪胎微塑料對(duì)水生生物具有一定的毒性效應(yīng)[4-6]。Wik等[5]研究了輪胎微塑料浸出液對(duì)月牙藻(72 h生長(zhǎng)抑制率)、大型溞(24～48 h死亡率)、網(wǎng)紋溞(48 h存活率，9 d繁殖率和存活率)以及斑馬魚(yú)胚胎(48 h致死率)的毒性，發(fā)現(xiàn)浸出物對(duì)網(wǎng)紋溞的9 d繁殖率影響最為顯著，對(duì)應(yīng)的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)值為10 mg·L-1，該濃度與路面徑流中輪胎微塑料的預(yù)測(cè)濃度接近。Marwood等[6]發(fā)現(xiàn)溫度是影響輪胎微塑料浸出液毒性的重要因素，在21 ℃時(shí)，浸出液對(duì)月牙藻(72 h生長(zhǎng)抑制率)、大型溞(48 h存活率)和鰷魚(yú)(48 h存活率)的EC50或半數(shù)致死濃度(LC50)值均>10 g·L-1，而當(dāng)溫度升高至44 ℃時(shí)，浸出液對(duì)大型溞的LC50值降低至5 g·L-1。以上研究均是用輪胎微塑料浸出液進(jìn)行的短期急性毒性測(cè)試，所使用的輪胎微塑料濃度也比實(shí)際環(huán)境中的濃度高出多個(gè)數(shù)量級(jí)。與以上實(shí)驗(yàn)室暴露不同，真實(shí)水環(huán)境中的輪胎微塑料暴露是直接、低劑量而長(zhǎng)時(shí)間的，其毒性效應(yīng)尚不明晰。因此，開(kāi)展輪胎微塑料對(duì)水生生物的毒性研究，尤其是環(huán)境濃度下的慢性毒性研究，對(duì)評(píng)估其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

本文以不同粒徑的輪胎微塑料為研究對(duì)象，使用大型溞作為受試模式生物，研究輪胎微塑料對(duì)大型溞的死亡率、蛻皮頻率和繁殖力的影響，并通過(guò)測(cè)定大型溞體內(nèi)各種金屬的含量，以及蛋白質(zhì)/脂肪來(lái)初步探究輪胎微塑料的慢性毒性機(jī)理，以期為正確評(píng)估輪胎微塑料生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及生物

實(shí)驗(yàn)使用的輪胎微塑料為實(shí)驗(yàn)室自制；將廢棄汽車(chē)輪胎剪碎后放入研磨機(jī)(Tube Mill control，廣州艾卡儀器公司，中國(guó))中反復(fù)研磨，研磨粉末依次過(guò)100目、150目和200目篩濕篩，收集過(guò)篩后不同粒徑范圍的輪胎微塑料。

受試生物大型溞(Daphniamagna)培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱(HP1500G型，武漢瑞華儀器，中國(guó))中，培養(yǎng)溫度為22 ℃，光暗周期為14 h/10 h，培養(yǎng)用水為脫氯自來(lái)水，并每日喂食斜生柵藻。毒性測(cè)試開(kāi)始前，將待產(chǎn)的母溞分離培養(yǎng)，次日即可獲得日齡<1 d的幼溞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 研究方法

1.2.1 輪胎微塑料的物理化學(xué)性質(zhì)表征

對(duì)制備好的輪胎微塑料顆粒進(jìn)行顆粒密度、形貌與粒徑以及重金屬含量等理化性質(zhì)表征。通過(guò)觀察輪胎微塑料在不同密度溶液中的漂浮、懸浮和沉底狀態(tài)來(lái)測(cè)量其密度范圍。使用掃描電鏡(S-4800，日立公司，日本)和激光粒度儀(MS2000，馬爾文公司，英國(guó))測(cè)定輪胎微塑料顆粒的形貌和粒徑。使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS；7700x，安捷倫公司，美國(guó))測(cè)定輪胎微塑料中Na、Mg、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Ag、Cd和Pb等金屬的含量。

1.2.2 輪胎微塑料對(duì)大型溞的慢性毒性測(cè)試

大型溞慢性毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)輪胎微塑料暴露組、1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組(Cr濃度20 μg·L-1的K2Cr2O7溶液)和1個(gè)陰性對(duì)照組(脫氯自來(lái)水)，每組3個(gè)平行。其中輪胎微塑料暴露組包括了3個(gè)微塑料粒徑(100目、150目、200目)和0.5 mg·L-1、62.5 mg·L-1(預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示此濃度對(duì)大型溞的生產(chǎn)具有負(fù)效應(yīng))2個(gè)顆粒濃度。

毒性測(cè)試在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行(與大型溞培養(yǎng)條件相同)。向每個(gè)盛有200 mL暴露液的250 mL錐形瓶中加入20只日齡<1 d的幼溞進(jìn)行暴露。錐形瓶置于振蕩器(HY-2型，國(guó)華電器有限公司，中國(guó))上，轉(zhuǎn)速30 r·min-1，使輪胎微塑料懸浮。暴露持續(xù)21 d，每日定時(shí)喂食斜生柵藻一次，喂食濃度為5×105cells·mL-1。每2 d更新一次暴露液。暴露期間每日觀察，記錄死亡數(shù)、蛻皮數(shù)、產(chǎn)幼數(shù)，同時(shí)將新生幼體取出，并用顯微鏡觀測(cè)死亡的大型溞以及大型溞蛻皮。21 d暴露結(jié)束后，收集存活的大型溞，用去離子水清洗后，置于2 mL離心管中，放入液氮冷凍，并冷凍干燥。凍干后大型溞稱取干質(zhì)量，用于測(cè)定金屬元素濃度。

1.3 分析測(cè)試方法

1.3.1 輪胎微塑料顆粒密度的測(cè)定

參考Li等[7]的實(shí)驗(yàn)方法，使用NaI溶液(1.8 g·cm-3)、酒精(0.8 g·cm-3)和去離子水(1.0 g·cm-3)，按不同體積比配制不同密度(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7和1.8 g·cm-3)的溶液。將少量輪胎微塑料顆粒分別加入不同密度溶液中，超聲混合5 min(KQ-5200DE超聲波清洗儀，昆山舒美超聲儀器有限公司，中國(guó))后靜置24 h，觀察各溶液中微塑料的漂浮、懸浮和沉底狀態(tài)。

1.3.2 輪胎微塑料和大型溞體內(nèi)金屬含量的測(cè)定

稱取一定質(zhì)量輪胎微塑料或凍干的大型溞于2 mL離心管中，加入適量65% HNO3，冷消解過(guò)夜，然后在80 ℃下消解6 h。用超純水稀釋消解液，過(guò)濾(0.45 μm孔徑濾膜)。使用ICP-MS測(cè)定Na、Mg、K、Ca、Mn、Fe、Co、Ni、Cu和Zn等金屬含量。

1.3.3 大型溞體內(nèi)蛋白質(zhì)/脂肪的測(cè)定

取適量?jī)龈纱笮蜏信c150 mg KBr固體混勻研磨成粉末，制成壓片后利用傅里葉紅外光譜儀(iS10，美國(guó)熱電公司)測(cè)定，得到各波長(zhǎng)下能量含量變化，通過(guò)計(jì)算1 720～1 485 cm-1和3 000～2 830 cm-1這2個(gè)波段的面積比得到蛋白質(zhì)與脂肪含量比[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

在R(v4.1.2)中進(jìn)行了方差分析(ANOVA)和事后檢驗(yàn)(Tukey法)，以比較不同處理組與陰性對(duì)照組的內(nèi)稟增長(zhǎng)率等。數(shù)據(jù)需檢驗(yàn)是否滿足殘差的正態(tài)分布(Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn))和方差齊性(Levene檢驗(yàn))，并在必要時(shí)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 輪胎微塑料物理化學(xué)性質(zhì)

2.1.1 顆粒密度

在密度為1.0 g·cm-3的溶液中，輪胎微塑料顆粒全部沉底；在1.1 g·cm-3的溶液中，顆粒部分懸?。辉?.2 g·cm-3的溶液中，顆粒全部漂浮。這表明顆粒的密度范圍為1.0～1.2 g·cm-3(圖1)?？梢灶A(yù)測(cè)，進(jìn)入水體的輪胎微塑料最終會(huì)沉入沉積物，但會(huì)有部分顆粒暫時(shí)懸浮于水中。本研究的受試生物大型溞是濾食性浮游動(dòng)物，也會(huì)擾動(dòng)并攝食表層沉積物，因而能通過(guò)不同方式攝食入輪胎微塑料。

2.1.2 顆粒粒徑

通過(guò)激光粒度儀進(jìn)一步測(cè)定輪胎微塑料粒徑。過(guò)100目、150目和200目篩所得輪胎微塑料的平均粒徑的范圍為67～150 μm，這與環(huán)境中輪胎微塑料粒徑的文獻(xiàn)報(bào)道值相近。Kreider等[9]從路面收集輪胎微塑料顆粒，其粒徑為4～350 μm，中位值在100 μm。Leads和Weinstein[10]從水體和沉積物樣中分離獲得輪胎微塑料顆粒，近70%的顆粒尺寸在63～149 μm之間。SEM形貌觀察發(fā)現(xiàn)輪胎微塑料顆粒呈不規(guī)則的長(zhǎng)條形和圓球形，表面粗糙(圖1)，這與在路面上收集到的輪胎磨損產(chǎn)生的顆粒具有相似性[10-11]。因此，本研究所使用的輪胎微塑料從粒徑和形貌上具有代表性。

圖1 輪胎微塑料顆粒密度測(cè)定結(jié)果及掃描電鏡觀測(cè)圖Fig. 1 Density measurement and scanning electron microscope observations of tire-derived microplastics

2.1.3 輪胎微塑料顆粒的金屬含量

輪胎微塑料含有大量的Ca (>15 mg·g-1)、Zn (>10 mg·g-1)、Na (4～6 mg·g-1)、K (2～3.5 mg·g-1)、Fe (2～5 mg·g-1)和Mg (0.9～2.5 mg·g-1)，中等含量的Cr (50～120 μg·g-1)、Mn (20～50 μg·g-1)、Co (5～20 μg·g-1)、Ni (30～70 μg·g-1)、Cu (30～130 μg·g-1)、Se (20～22 μg·g-1)、Pb (19～23 μg·g-1)，以及少量的As (0.4～0.6 μg·g-1)、Ag (0.02～0.03 μg·g-1)、Cd (0.5 μg·g-1) (表1)。不同粒徑的顆粒中Ca、Zn、Se、Cd和Pb的濃度范圍基本一致，而粒徑越小的顆粒含Na、Mg、K、Co和Cu濃度越高。這可能與輪胎微塑料上不同金屬的浸提效率有關(guān)。前幾種金屬的提取不受顆粒比表面積影響，而后幾種金屬的提取效率則受顆粒比表面積控制，表現(xiàn)為比表面積越大越易提取。

表1 不同粒徑的輪胎微塑料中金屬元素濃度Table 1 Metal concentrations in tire-derived microplastics of different particle sizes

2.2 輪胎微塑料對(duì)大型溞的慢性毒性效應(yīng)

2.2.1 對(duì)存活率、蛻皮數(shù)和繁殖能力的影響

經(jīng)21 d暴露，陰性對(duì)照組大型溞的死亡率在2%以內(nèi)；陽(yáng)性對(duì)照組的死亡率超過(guò)30%；輪胎微塑料暴露組的死亡率在5%～20%之間(圖2(a))。這說(shuō)明不同粒徑和濃度的輪胎微塑料均會(huì)降低大型溞的存活率。輪胎微塑料暴露組的死亡率均不高于20%，說(shuō)明毒性效應(yīng)不大。此外，在濃度為0.5 mg·L-1的暴露組中，大型溞的存活率隨微塑料粒徑的減小而升高；而在62.5 mg·L-1的暴露組中，大型溞的存活率隨粒徑的減小而降低。

輪胎微塑料暴露沒(méi)有明顯改變大型溞的蛻皮頻率。如圖2(b)所示，暴露組與對(duì)照組的大型溞在21 d中蛻皮9次左右，平均蛻皮數(shù)接近。

輪胎微塑料暴露對(duì)大型溞的繁殖有可觀測(cè)的影響(圖2(c))。暴露組的累積產(chǎn)幼數(shù)量接近甚至高于陰性對(duì)照組，但是暴露組的初次生產(chǎn)時(shí)間滯后于陰性對(duì)照組。暴露于62.5 mg·L-1的輪胎微塑料，大型溞初次生產(chǎn)的時(shí)間延后3～5 d。而暴露濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，生殖延后效應(yīng)較小，僅在較大粒徑(100目)組觀察到初次生產(chǎn)時(shí)間延后4 d。該結(jié)果表明輪胎微塑料對(duì)大型溞繁殖能力的不利影響主要體現(xiàn)在發(fā)育抑制上，而非體現(xiàn)在產(chǎn)幼數(shù)量上。

圖2 暴露于不同粒徑、濃度輪胎微塑料的大型溞21 d存活率(a)、存活個(gè)體累積平均蛻皮數(shù)(b)和存活雌性個(gè)體累積平均產(chǎn)幼數(shù)(c)Fig. 2 Survivorship (a), accumulative number of moltings (b) and offspring (c) of Daphnia magna in the 21-d exposure to tire-derived microplastics of different particle sizes and concentrations

內(nèi)稟增長(zhǎng)率(rm)綜合反映輪胎微塑料對(duì)大型溞生存與繁殖的影響(圖3(a))。暴露于62.5 mg·L-1的輪胎微塑料，rm值(0.231～0.255 d-1)顯著低于陰性對(duì)照的(0.294±0.014) d-1(F3,8=18.15,P<0.01)，而與陽(yáng)性對(duì)照的(0.250±0.011) d-1接近 (F3,8=2.987,P=0.096)。暴露于0.5 mg·L-1的輪胎微塑料，rm值與陰性對(duì)照組接近，種群增長(zhǎng)速率未受影響。

圖3 暴露于不同粒徑、濃度輪胎微塑料的大型溞內(nèi)稟增長(zhǎng)率(rm) (a)和體內(nèi)蛋白質(zhì)/脂肪的含量比(b)注：灰色水平實(shí)線和虛線是陰性對(duì)照組的內(nèi)稟增長(zhǎng)率或蛋白質(zhì)/脂肪的含量比值(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)，紅色水平實(shí)線和虛線是陽(yáng)性對(duì)照組的內(nèi)稟增長(zhǎng)率或蛋白質(zhì)/脂肪的含量比值(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)；*表示處理組與陰性對(duì)照有顯著差異(ANOVA，Tukey檢驗(yàn)，P<0.05)。Fig. 3 Intrinsic population growth rate (rm) (a) and protein-to-lipid ratio (b) of Daphnia magna exposed to tire-derived microplastics of different particle sizes and concentrationsNote: Grey solid and dashed lines represent negative control for intrinsic population growth rate or protein-to-lipid ratio (mean±standard deviation), and red solid and dashed lines represent its positive control (mean±standard deviation); *represents P<0.05, compared with negative control (ANOVA，Tukey test).

2.2.2 對(duì)大型溞體內(nèi)金屬元素濃度的影響

在低濃度(0.5 mg·L-1)暴露水平下，輪胎微塑料的存在基本不會(huì)引起大型溞體內(nèi)金屬含量的變化，而高濃度的輪胎微塑料暴露會(huì)導(dǎo)致大型溞體內(nèi)重金屬Co、Cu和Zn的增加以及生長(zhǎng)的必需金屬元素Ca、Fe的減少(圖4)。62.5 mg·L-1輪胎微塑料實(shí)驗(yàn)組中的大型溞體內(nèi)重金屬Co、Cu、Zn含量高于陰性對(duì)照組和低濃度實(shí)驗(yàn)組(圖4(a))；而大型溞體內(nèi)生長(zhǎng)的必需金屬元素Ca和Fe的含量則低于陰性對(duì)照組和低濃度實(shí)驗(yàn)組(圖4(b))。輪胎微塑料暴露對(duì)其他元素(Ag、As、K、Mg、Mn、Na、Pb和Se等)的濃度沒(méi)有明顯的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖4 暴露于不同粒徑、濃度輪胎微塑料的大型溞體內(nèi)Co、Cu、Zn含量(a)和Ca、Fe含量(b)注：藍(lán)色水平實(shí)線和虛線是陰性對(duì)照組的金屬濃度(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。Fig. 4 Concentrations of Co, Cu, Zn (a) and Ca, Fe (b) in Daphnia magna exposed to tire-derived microplastics of different particle sizes and concentrationsNote: Blue solid and dashed lines represent negative control (mean±standard deviation).

高濃度暴露處理明顯提升大型溞體內(nèi)Zn的含量，說(shuō)明在高濃度暴露水平下，被大型溞攝入的輪胎微塑料顆粒在其腸道內(nèi)釋放重金屬Zn，進(jìn)而產(chǎn)生毒性效應(yīng)，使大型溞死亡率增加。同時(shí)，輪胎微塑料顆粒在腸道內(nèi)的停留可能減少大型溞對(duì)食物的攝入，并且Zn干擾了Ca和Fe的吸收，這使得大型溞體內(nèi)Ca和Fe元素含量下降，從而抑制了大型溞的生長(zhǎng)發(fā)育，使大型溞初次生產(chǎn)的時(shí)間延遲3～5 d。因此，在高濃度暴露水平下，輪胎微塑料被大型溞攝入后，顆粒本身及其釋放的有害物質(zhì)導(dǎo)致大型溞死亡率的增加和生殖延后。

在高濃度實(shí)驗(yàn)組中，大型溞體內(nèi)重金屬Co、Cu和Zn的含量隨輪胎微塑料粒徑的減小而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖4(a))。這與暴露實(shí)驗(yàn)中大型溞的死亡率的規(guī)律一致，進(jìn)一步說(shuō)明高濃度輪胎微塑料對(duì)大型溞的毒性主要是由其釋放的Zn等重金屬引起的。低濃度暴露組中大型溞體內(nèi)重金屬Zn的含量與陰性對(duì)照組差別不大，這表明低濃度輪胎微塑料對(duì)大型溞的毒性不是由其釋放的毒性物質(zhì)主導(dǎo)的，而主要是由顆粒本身所導(dǎo)致的。

2.2.3 對(duì)大型溞體表的影響

通過(guò)顯微鏡觀察到大型溞蛻皮內(nèi)外表面粘附著大量輪胎微塑料顆粒。死亡個(gè)體的腸道內(nèi)也充塞著輪胎微塑料，且有大量顆粒粘附在其附肢表面(圖5)。這說(shuō)明輪胎微塑料會(huì)阻塞大型溞的消化道，并會(huì)干擾其運(yùn)動(dòng)和濾食。

圖5 暴露于輪胎微塑料的死亡大型溞個(gè)體及大型溞蛻皮的顯微鏡觀察圖Fig. 5 Microscopic observation of the dead individuals of Daphnia magna and the shed molts after exposure to tire-derived microplastics

2.2.4 對(duì)蛋白質(zhì)/脂肪的影響

實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的大型溞體內(nèi)蛋白質(zhì)/脂肪的值大小相似，但低于陽(yáng)性對(duì)照組(圖3(b))。陽(yáng)性對(duì)照組中Cr(Ⅵ)毒性使得大型溞體內(nèi)脂肪消耗增加，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)/脂肪的增大。輪胎微塑料攝入雖然會(huì)阻塞消化道并對(duì)大型溞產(chǎn)生刺激作用，但并未改變大型溞體內(nèi)蛋白質(zhì)和脂肪的消耗和分配。

3 討論(Discussion)

在環(huán)境相關(guān)濃度下，輪胎微塑料會(huì)對(duì)大型溞產(chǎn)生一定的慢性毒性。本研究發(fā)現(xiàn)暴露在0.5 mg·L-1輪胎微塑料中21 d，大型溞的死亡率(5%～20%)高于陰性對(duì)照組(2%)，且較大粒徑的輪胎微塑料使大型溞初次生產(chǎn)的時(shí)間延后了4 d。而關(guān)于輪胎微塑料對(duì)大型溞的急性毒性研究發(fā)現(xiàn)625～10 000 mg·L-1的輪胎磨損顆粒在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)溫度(21 ℃)條件下的浸出液均不會(huì)導(dǎo)致大型溞的死亡[6]。本研究中輪胎微塑料之所以會(huì)對(duì)大型溞產(chǎn)生慢性毒性，可能是由于暴露時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致的，也可能是輪胎微塑料在更長(zhǎng)的暴露時(shí)間中釋放出的化學(xué)物質(zhì)所導(dǎo)致的。

雖然暴露在環(huán)境相關(guān)濃度水平下的輪胎微塑料會(huì)對(duì)大型溞產(chǎn)生一定的慢性毒性，但毒性較小。在本研究中，0.5 mg·L-1輪胎微塑料懸浮液中大型溞的死亡率均<20%，輪胎微塑料對(duì)蛻皮頻率和平均產(chǎn)幼數(shù)量均無(wú)明顯的不利影響，這與一些研究結(jié)果相似。Redondo-Hasselerharm等[2]研究發(fā)現(xiàn)即使是在暴露濃度為沉積物干質(zhì)量的10%的情況下，沉積物中的輪胎磨損顆粒對(duì)底棲動(dòng)物鉤蝦、櫛水虱、顫蚓和帶絲蚓的影響很小。Khan等[12]在鉤蝦的毒性測(cè)試中也發(fā)現(xiàn)，在較高的暴露濃度(0.15～0.59 g·L-1)下，鉤蝦的存活率、繁殖率和生長(zhǎng)率才會(huì)受到顯著的負(fù)面影響。但Wik等[5]的研究表明在環(huán)境預(yù)測(cè)濃度(13 mg·L-1)水平下，輪胎微塑料對(duì)網(wǎng)紋溞的9 d繁殖率有顯著影響，其毒性測(cè)試中僅使用了輪胎胎面顆粒的浸出液。已有研究確定輪胎微塑料與胎面顆粒的化學(xué)組成存在較大差異[9]，二者所釋放的化學(xué)物質(zhì)也會(huì)不同。此外，Halle等[13]的研究比較了使用研磨機(jī)制作的輪胎微塑料的懸浮液和浸出液對(duì)端足類(lèi)生物的急性毒性，結(jié)果表明在整個(gè)測(cè)試范圍內(nèi)(0～2.55 g·L-1)輪胎微塑料懸浮液的毒性比輪胎微塑料浸出液更高，且研究發(fā)現(xiàn)浸提操作并未將某些有害物質(zhì)(辛硫醇、菲、蒽和鋁)提出。這表明用浸出液來(lái)測(cè)試輪胎微塑料對(duì)水生生物的毒性并不能準(zhǔn)確評(píng)估真實(shí)環(huán)境中輪胎微塑料的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

輪胎磨損顆粒浸出毒性研究表明，浸出液中的Zn和有機(jī)物是輪胎磨損顆粒對(duì)水生生物產(chǎn)生毒性效應(yīng)的主要原因，且輪胎磨損顆粒對(duì)水生生物的毒性大小取決于它的量和其釋放的有害物質(zhì)的量[5-6]。Tian等[14]的研究發(fā)現(xiàn)輪胎橡膠中的一種抗氧化劑是導(dǎo)致美國(guó)太平洋西北部銀鮭魚(yú)在小溪中繁殖時(shí)急性死亡的主要原因。但已有研究發(fā)現(xiàn)多種水生生物可以攝入輪胎磨損顆粒[2,12]，且Halle等[13]的研究發(fā)現(xiàn)暴露在高濃度的2種不同化學(xué)組成的輪胎磨損顆粒中，對(duì)端足類(lèi)的毒性一致，這說(shuō)明其對(duì)端足類(lèi)生物的毒性是由顆粒的物理性質(zhì)決定的，輪胎磨損顆粒是通過(guò)改變生物的攝食行為及營(yíng)養(yǎng)攝入對(duì)端足類(lèi)產(chǎn)生毒性影響。本研究中，低濃度的輪胎微塑料(0.5 mg L-1)不會(huì)引起大型溞體內(nèi)重金屬Co、Cu和Zn等毒性物質(zhì)含量的變化，這表明在低濃度暴露水平下，輪胎微塑料對(duì)大型溞的毒性不是由其釋放的毒性物質(zhì)所主導(dǎo)的，而主要是通過(guò)顆粒對(duì)大型溞附肢的干擾以及對(duì)腸道的刺激等物理因素所引發(fā)的。在高濃度暴露水平下，大型溞體內(nèi)重金屬Co、Cu和Zn等毒性物質(zhì)的含量明顯增加，且在所研究的微塑料粒徑范圍內(nèi)呈現(xiàn)出金屬累積量隨顆粒粒徑的減小而上升的趨勢(shì)，而大型溞的死亡率同樣隨顆粒粒徑的減小而增大。這說(shuō)明在高濃度暴露水平下，輪胎微塑料對(duì)大型溞的毒性是由其釋放的毒性物質(zhì)所主導(dǎo)的。因此，大型溞是通過(guò)攝入輪胎微塑料，顆粒本身及其釋放的有害物質(zhì)對(duì)其產(chǎn)生毒性影響[15]，但在環(huán)境相關(guān)濃度水平下，毒性是由顆粒本身的作用主導(dǎo)的。考慮到輪胎磨損顆粒的成分較為復(fù)雜，重金屬只是其中的部分組分[14]，將來(lái)研究有必要關(guān)注其他組分可能產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。

綜上所述，本文探究了輪胎微塑料對(duì)大型溞的慢性毒性效應(yīng)和毒性機(jī)理。結(jié)果表明，在地表水中，輪胎微塑料的預(yù)測(cè)濃度為0.09～10 mg·L-1時(shí)，其對(duì)大型溞的慢性毒性影響很小，且其對(duì)大型溞的慢性毒性是由顆粒本身的物理性質(zhì)所引起的。少量輪胎微塑料顆粒的攝入對(duì)大型溞腸道產(chǎn)生了刺激，但并未改變其體內(nèi)重金屬和營(yíng)養(yǎng)金屬的含量以及蛋白質(zhì)/脂肪。然而，對(duì)于某些道路沖刷雨水的直接受納水體，其輪胎微塑料濃度可能高達(dá)幾十mg·L-1[3]，這就可能抑制水生生物(如大型溞)的生長(zhǎng)發(fā)育，并降低水生生物的存活率，從而威脅水生生態(tài)系統(tǒng)的健康。