王朦朦,謝 勇,蔡夢(mèng)思,衛(wèi)子顏,劉 雄
(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715)
膳食結(jié)構(gòu)的改變可直接影響結(jié)腸疾病的發(fā)生與發(fā)展[1],通過調(diào)節(jié)膳食結(jié)構(gòu)預(yù)防腸道疾病在目前正受到廣泛關(guān)注。原花青素(proanthocyanidins, PC)作為一類常見的多酚類物質(zhì),其強(qiáng)抗氧化性使它能夠清除自由基,預(yù)防癌癥、心腦血管等疾病[2?3]。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)PC在結(jié)腸類疾病的預(yù)防中也有著巨大潛力[4]:PC可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[5];動(dòng)物在食用富含PC的食物后,其結(jié)腸中具有抗炎活性的代謝物顯著增加,炎癥癥狀明顯減輕[6]。然而,由于PC主要在小腸被吸收,且穩(wěn)定性較差,易被消化液破壞,難以作用于結(jié)腸部位[7]。因此,可以利用包封技術(shù)提高PC的穩(wěn)定性,避免PC在上消化道中被分解和吸收,從而實(shí)現(xiàn)結(jié)腸靶向遞送。目前,對(duì)PC進(jìn)行保護(hù)的方法包括利用微膠囊、凝膠等對(duì)其進(jìn)行包封,如吳曉瓊等[8]利用殼聚糖水凝膠對(duì)PC多重乳液進(jìn)行包裹,紀(jì)秀鳳等[9]以明膠和阿拉伯膠為壁材,通過復(fù)凝聚法制備紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊增加PC穩(wěn)定性。但這些包封技術(shù)存在制備工藝復(fù)雜、包封材料性能差、需要其它添加劑的協(xié)調(diào)作用等不足。因此,需要在這些方面對(duì)PC的包封進(jìn)一步研究改善。
魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan,KGM)作為一種天然高分子多糖,因其生物安全性和特殊的抗消化性,往往被認(rèn)為是包封材料的良好選擇[10?11]。同時(shí),KGM具有預(yù)防腫瘤癌變[12]、抗氧化自由基、改善腸道生態(tài)[13]等諸多作用,在預(yù)防腸道疾病方面也有著良好的應(yīng)用前景。因此,將KGM作為包封材料應(yīng)用于PC的靶向遞送,不僅可以使PC實(shí)現(xiàn)結(jié)腸靶向緩釋的目的,也可在一定程度上利用KGM改善腸道功能的功效。隨著KGM作為包封材料的研究不斷深入[11,14],其溶脹度高、粘度大、凝膠可塑性弱、溶膠穩(wěn)定性差等缺陷,使它往往需要通過物理和化學(xué)改性加以改進(jìn)。如CHEN等[15]將KGM與丙烯酸共聚形成水凝膠,可以使模型藥物釋放受水凝膠腫脹和降解控制;SHI等[16]以羧甲基KGM和2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖為載體,靜電絡(luò)合法制備了新型復(fù)合納米球。雖然這些技術(shù)取得了一定的效果,但這些改性技術(shù)工藝復(fù)雜,生產(chǎn)成本較高,且在食品安全方面面臨著不少挑戰(zhàn)。因此,需要探索一些綠色、安全的KGM包封技術(shù),來降低生產(chǎn)成本,并增加PC的食品安全性。
目前,關(guān)于KGM包封PC的研究鮮有報(bào)道,尋找簡單易操作的KGM包封技術(shù)成為亟待解決的工業(yè)問題。因此,本文探究了一種新的KGM包封技術(shù),即利用KGM在乙醇體系下吸水微溶脹的特性,在乙醇溶液中用KGM對(duì)PC進(jìn)行吸附包封。實(shí)驗(yàn)通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化KGM/PC微粒的制備工藝,利用粒徑分析、掃描電鏡、紅外光譜等對(duì)微粒的性質(zhì)進(jìn)行表征,從而確定該方法下KGM能成功包封負(fù)載PC。同時(shí),通過模擬體外消化評(píng)估了KGM/PC微粒的緩釋性能,以期為其在結(jié)腸控釋方面的應(yīng)用提供技術(shù)支持。
純化魔芋精粉(純度≥86%) 湖北十堰花仙子魔芋制品有限公司;原花青素(純度≥95%) 原葉生物科技有限公司;胃蛋白酶(≥250 U/mg)、胰酶(4×USP) 美國Sigma-Aldrich公司;β-甘露聚糖酶(40000 U/g) 北京索來寶科技有限公司;其他化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純。
AXTG16G型醫(yī)用離心機(jī) 鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司; LGJ-10型真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;TU-1950雙光束紫外可見分光光譜儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;S-3000N型掃描電鏡 HITACHI公司;Mastersizer 3000型激光粒度分析儀 英國馬爾文公司;Spectrum 100紅外光譜儀 美國PerkinElmer 公司; SHZ-88型水浴恒溫振蕩器 常州朗越儀器制造有限公司。
1.2.1 KGM/PC微粒的制備工藝優(yōu)化
1.2.1.1 載PC的KGM微粒的制備 稱取一定量的PC,于室溫下加入到25 mL一定濃度的乙醇水溶液中,待PC完全溶解,加入一定量的KGM,磁力攪拌15 min后,經(jīng)離心(1500 r/min)10 min,棄去上清液,用同濃度乙醇溶液清洗3遍,再次離心,取沉淀物冷凍后真空冷凍干燥12 h后,獲得KGM/PC微粒。
1.2.1.2 單因素實(shí)驗(yàn) 按1.2.1.1中的方法制備KGM/PC微粒,選取KGM添加量(14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%)、KGM粒徑(粒徑分為5個(gè)等級(jí),由1~5分別對(duì)應(yīng)的粒徑范圍為210~250、170~210、130~170、90~130和50~90 μm)、乙醇濃度(10%、12%、14%、16%、18%、20%)及PC添加量(5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%)4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),選擇20%的KGM添加量、50~90 μm的KGM顆粒、14%乙醇濃度和7%的PC添加量為各單因素的控制變量。探究各因素對(duì)KGM/PC微粒負(fù)載率的影響,每個(gè)因素平行實(shí)驗(yàn)3次,取平均值。
1.2.1.3 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取乙醇濃度、KGM添加量和PC添加量為考察因素,以KGM/PC微粒的負(fù)載率為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定KGM/PC微粒的最佳制備條件。因素水平如表1所示。
表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test
1.2.1.4 KGM/PC微粒的負(fù)載率的測(cè)定 取20 mg制備好的KGM/PC微粒加入20 mL的β-甘露聚糖酶液(5 mg/mL)中,37 °C水浴保溫并磁力攪拌1 h,待KGM/PC微粒完全酶解,混勻后取2 mL于離心機(jī)經(jīng)離心(1500 r/min)10 min后,用硫酸-香草醛比色法[17]測(cè)量上清液中原花青素含量,并用公式(1)計(jì)算PC的負(fù)載率:
式中:m為KGM/PC微粒中PC的含量,mg;M為KGM/PC微粒的總質(zhì)量,mg。
1.2.2 KGM/PC微粒的表征
1.2.2.1 顆粒粒徑測(cè)定 參考畢會(huì)敏等[18]的方法并作適當(dāng)修改,采用英國馬爾文公司的Mastersizer 3000型激光粒度分析儀測(cè)定載藥微粒的粒徑分布,以無水乙醇為分散系,折射率為1.52,折光度范圍:8%~20%。
1.2.2.2 顆粒表觀形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征 將KGM負(fù)載PC前后的顆粒樣品置于培養(yǎng)皿中,用相機(jī)拍攝顆粒的表觀形態(tài);用研缽充分研磨KGM負(fù)載PC前后的顆粒樣品從而破壞顆粒表面結(jié)構(gòu),將研磨前后的樣品顆粒固定在雙面導(dǎo)電膠上,在真空下對(duì)樣品進(jìn)行離子濺射噴金處理,用電子掃描顯微鏡(SEM)在500×,5000×下對(duì)顆粒的表面形態(tài)進(jìn)行觀察,并選擇合適的區(qū)域拍照。
1.2.2.3 傅立葉紅外光譜分析 參考YAN等[19]的方法,將KGM、PC、KGM-PC混合物和KGM/PC微粒分別使用傅立葉變換紅外光譜儀在4000~600 cm?1范圍內(nèi)檢測(cè),累積掃描次數(shù)為32。
1.2.3 KGM/PC微粒體外釋放性能的測(cè)定
1.2.3.1 人工模擬消化液的配制 參照ANA-ISABEL等[20]的方法并作適當(dāng)修改,制備胃模擬消化液(簡稱胃液,pH2.0)和小腸/結(jié)腸模擬消化液(簡稱腸液,pH7.4)。模擬消化前,在胃液中加入胃蛋白酶,配制成胃蛋白酶液(10 mg/mL)備用;在腸液中分別加入胰酶和β-甘露聚糖酶配制成胰酶液(10 mg/mL)和β-甘露聚糖酶液(10 mg/mL)備用。
1.2.3.2 體外消化及PC釋放率的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[20?22]的方法并作適當(dāng)修改,將0.1 g KGM/PC微粒用1 mL去離子水溶解形成凝膠后,置于 90 mL人工模擬液胃液中,添加胃蛋白酶液10 mL并密封,然后于恒溫振蕩器中消化4 h(37 ℃,175 r/min)。胃消化結(jié)束后,用1 mol/mL的NaHCO3調(diào)節(jié)體系pH7.4,并添加80 mL模擬腸液和20 mL胰酶液,密封后于恒溫振蕩器(37 ℃,175 r/min)繼續(xù)消化4 h。待胃部和小腸模擬消化后,向小腸消化體系中加入20 mLβ-葡甘聚糖酶液,于恒溫振蕩器(37 ℃,175 r/min)中再消化8 h以模擬微粒在結(jié)腸環(huán)境中的釋放情況。整個(gè)體外消化過程中,制備間隔1 h的不同時(shí)間段的反應(yīng)體系,待反應(yīng)時(shí)間結(jié)束,從消化體系中取1 mL混合液于2 mL PE離心管中,并將剩余反應(yīng)體系沸水浴5 min以鈍化酶的活性。取出的樣液則經(jīng)離心(1500 r/min)10 min后,取上清液測(cè)定PC的釋放率,PC釋放率用公式(2)計(jì)算。同時(shí),按照KGM/PC中PC的含量,將未包封的PC與KGM均勻混合后,按照以上步驟進(jìn)行消化,作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
式中:Ct為t時(shí)間內(nèi)釋放液中PC的含量,mg;C為體外釋放前KGM/PC微粒中PC的含量,mg。
所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均用SPSS 25.0進(jìn)行方差分析,Origin 8.5作圖,所得結(jié)果均以3個(gè)獨(dú)立樣本的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,Duncan式檢驗(yàn)法(P<0.05)判定其顯著性差異。
2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 乙醇濃度、PC添加量、KGM添加量和KGM粒徑對(duì)KGM/PC微粒負(fù)載率的影響結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,KGM/PC微粒的負(fù)載率隨KGM添加量的增加,呈現(xiàn)先穩(wěn)定后降低的趨勢(shì)。由于KGM在固定乙醇濃度和PC添加量的體系下吸水率不變,單位KGM可裝載的PC量不變,微粒負(fù)載率無顯著變化。當(dāng)KGM添加量到達(dá)18%以后,體系內(nèi)PC的量不變,KGM分子之間相互競(jìng)爭,導(dǎo)致微粒負(fù)載率下降。因此,確定正交試驗(yàn)中KGM添加量的水平分別為16%、18%和20%。隨著PC添加量的增加,KGM/PC微粒負(fù)載率先增加后穩(wěn)定??赡苁荎GM顆粒內(nèi)部可裝載PC的空間有限,當(dāng)PC添加量增加到10%后,KGM負(fù)載PC的量趨于飽和;且實(shí)驗(yàn)得出該體系下PC的最大添加量為11%。故確定正交試驗(yàn)中PC添加量的水平分別為9%、10%和11%。KGM/PC微粒的負(fù)載率隨乙醇濃度的增加而下降。由于PC隨KGM吸收水分時(shí)進(jìn)入KGM顆粒內(nèi)部,乙醇作為溶脹抑制劑降低了KGM的吸水率[23],隨著乙醇濃度的增加,KGM的吸水率下降,導(dǎo)致KGM/PC微粒的負(fù)載率隨之減??;且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇濃度小于10%,凍干后無法獲得顆粒態(tài)微粒。綜上,確定正交試驗(yàn)中乙醇濃度的水平分別為10%、12%和14%。粒徑變化對(duì)KGM/PC微粒的負(fù)載率無顯著性影響。隨著KGM顆粒粒徑的降低,KGM的吸水性會(huì)顯著增加[24],理論上來講,微粒負(fù)載率應(yīng)隨著KGM粒徑的降低而增大。實(shí)踐中由于乙醇對(duì)KGM吸水性有較強(qiáng)的抑制作用,該作用程度大于粒徑對(duì)KGM吸水性的影響程度,限制KGM吸水溶脹,而不表現(xiàn)出負(fù)載率的顯著變化。因此,正交試驗(yàn)時(shí)不考慮此因素。
圖1 KGM添加量、PC添加量、乙醇濃度和KGM粒徑對(duì)KGM/PC微粒負(fù)載率的影響結(jié)果Fig.1 The results of amount of KGM and PC added, alcohol concentration and KGM particle size on the loading rate of KGM/PC particles
2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn),確定KGM/PC微粒的最佳制備條件。得到正交試驗(yàn)結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。由表3可知,因素A、B對(duì)KGM/PC微粒負(fù)載率的影響顯著(P<0.05),因素C為不顯著因素,由F值大小確定各因素對(duì)微粒負(fù)載率的影響大小順序:A>B>C。結(jié)合表2得到KGM/PC微粒的最佳制備條件為A1B3C1。該制備條件在正交試驗(yàn)中未出現(xiàn),不能確定此組合是否為最佳工藝,因此需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),在A1B3C1條件下進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn),得到平均負(fù)載率為(14.75%±0.27%),高于其他組的負(fù)載率,說明乙醇濃度10%、PC添加量11%、KGM添加量16%為相對(duì)最佳工藝。同時(shí),對(duì)比相似研究發(fā)現(xiàn),該方法下制備得KGM/PC微粒的負(fù)載率高于SUSANTI等[23]采用泡沫墊干燥法對(duì)富含PC的紅高粱提取物進(jìn)行包封(PC含量為9.11~9.23 mg/g);與葛瑩瑩等[25]制備的石墨烯/KGM多孔干凝膠的負(fù)載率相近,該凝膠對(duì)5-氟尿嘧啶的負(fù)載率達(dá)到154 mg/g。說明該制備方法不僅簡單有效,還可以獲得較高負(fù)載量的微粒。
表2 KGM/PC微粒負(fù)載率正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The orthogonal experimental design and results for loading rate of KGM/PC particles
表3 KGM/PC微粒負(fù)載率正交試驗(yàn)方差分析Table 3 The variance analysis of orthogonal test for loading rate of KGM/PC particles
2.2.1 KGM顆粒負(fù)載PC前后的粒徑變化 KGM顆粒負(fù)載PC前后粒徑的變化情況如圖2所示,KGM和KGM/PC 微粒的粒徑圖均為單峰分布曲線,兩者粒徑主要分布在40~170 μm之間。與未負(fù)載PC的KGM顆粒對(duì)比,KGM/PC微粒的Dx(10)、Dx(50)和Dx(90)值均明顯增加,比表面積由78.4 m2/Kg減小為59.03 m2/Kg。說明KGM顆粒負(fù)載PC后體積增大,這可能是由KGM吸水溶脹過程中PC隨水分進(jìn)入KGM,凍干后水分升華,PC保留在KGM顆粒內(nèi)部所導(dǎo)致的。
圖2 KGM顆粒負(fù)載前后的粒徑變化Fig.2 The change of KGM particle size before and after loading
2.2.2 KGM顆粒負(fù)載PC前后的顆粒表觀形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征 KGM顆粒負(fù)載PC前后的顆粒表觀形態(tài)如圖3所示。由圖3可知,KGM顆粒表觀呈白色顆粒狀,PC為紅褐色粉末,KGM/PC微粒呈淺紅褐色顆粒狀,而按相同比例混合制備的KGM-PC混合物為白色和紅褐色相間的顆粒狀,說明乙醇體系下KGM能夠負(fù)載PC,從而形成均勻的KGM/PC微粒。
圖3 KGM顆粒負(fù)載前后的表觀形態(tài)圖Fig.3 The apparent morphology of KGM particles before and after loading
KGM顆粒負(fù)載PC前后的結(jié)構(gòu)特征如圖4所示。KGM顆粒負(fù)載PC前后表觀狀態(tài)無明顯變化,均呈表面平整的不規(guī)則顆粒狀。進(jìn)一步研磨破碎顆粒表面,發(fā)現(xiàn)KGM顆粒微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)較完整的排列有序的片層纖維結(jié)構(gòu),這與唐蘭蘭等[26]的研究結(jié)果一致。但KGM/PC微粒顆粒內(nèi)部具有大量網(wǎng)狀多孔洞結(jié)構(gòu),可能是由于KGM顆粒在低濃度乙醇溶液中吸水微溶脹,冷凍干燥過程中內(nèi)部水分升華形成的。同時(shí),這些孔洞結(jié)構(gòu)可以為KGM包封PC提供空間基礎(chǔ),也說明了KGM顆粒負(fù)載PC后體積增大的原因。
圖4 KGM顆粒負(fù)載前后的掃描電鏡圖Fig.4 The scanning electron micrographs of KGM particles before and after loading
2.2.3 傅立葉紅外光譜分析 圖5為KGM、PC、KGM/PC微粒和KGM-PC混合物的紅外圖譜,KGMPC混合物的紅外譜圖顯示了來自KGM的各特征吸收峰,同時(shí)在1605.76、1519.91、1437.04 cm?1處檢測(cè)到三個(gè)連續(xù)的吸收峰,這是來自PC苯環(huán)骨架中的C=C特征伸縮振動(dòng)峰[27],在1279.97、1208.42 cm?1處檢測(cè)到PC的酚羥基伸縮振動(dòng)及面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰,表明該混合物中KGM與PC二者只存在單一混合。KGM/PC微粒紅外圖譜中的特征吸收峰主要是KGM的各吸收峰,但在1520.93 cm?1左右出現(xiàn)了一個(gè)PC苯環(huán)骨架C=C的特征伸縮振動(dòng)峰,說明該微粒中含有PC;而PC的其他特征吸收峰未出現(xiàn),說明微粒并不是壁材與芯材的簡單物理混合物[28]。并且在形成的微粒中未發(fā)現(xiàn)新的特征吸收峰,說明在制備過程中未形成新的化學(xué)鍵,KGM與PC之間并未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[29]。上述結(jié)果表明,KGM成功將PC進(jìn)行了包封,且在該反應(yīng)過程中未改變KGM和PC的化學(xué)性質(zhì)。結(jié)合粒徑與掃描電鏡的結(jié)果,推測(cè)PC隨KGM的吸水過程進(jìn)入KGM顆粒內(nèi)部,凍干后附著在KGM顆粒內(nèi)的孔洞結(jié)構(gòu)中,從而達(dá)到KGM負(fù)載PC的效果。
圖5 KGM、PC、KGM-PC混合物和KGM/PC微粒的紅外譜圖Fig.5 The FT-IR spectra of KGM, PC, KGM-PC mixture and KGM/PC particles
KGM/PC微粒體外緩釋測(cè)定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖6所示。經(jīng)胃部和小腸模擬消化后,KGM-PC混合凝膠和KGM/PC微粒凝膠中PC的釋放率分別為32.46%和 20.53%,微粒凝膠較混合凝膠降低了36.75%的釋放率。PC釋放差異性的原因可能與KGM-PC混合粉和KGM/PC微粒形成的凝膠結(jié)構(gòu)有關(guān),當(dāng)KGM/PC微粒吸水形成凝膠時(shí),由于PC被包封于KGM內(nèi)部,不影響KGM與水分子和KGM分子以氫鍵結(jié)合形成凝膠[30],而在 KGM-PC混合體系中PC在一定程度上會(huì)阻礙KGM分子間的締合,從而影響凝膠結(jié)構(gòu)的形成。所以微粒凝膠結(jié)合更牢固,在胃部和小腸階段的PC釋放率更低。
圖6 KGM/PC微粒和KGM-PC混合物的體外緩釋結(jié)果Fig.6 The in vitro sustained release results of KGM/PC particles and KGM-PC mixture
在模擬結(jié)腸消化階段,KGM/PC微粒凝膠和KGM-PC混合凝膠分別于8和7 h后達(dá)到完全釋放,對(duì)比凝膠在模擬胃部和小腸階段的釋放情況,發(fā)現(xiàn)模擬結(jié)腸環(huán)境中PC的釋放速度更快,這主要是因?yàn)榻Y(jié)腸環(huán)境中的β-甘露聚糖酶具有降解KGM的特性[31],從而促進(jìn)了PC的釋放。同時(shí),凝膠表面附近的PC主要通過KGM吸水溶脹過程中形成的水孔或通道擴(kuò)散,KGM的酶降解在一定程度上導(dǎo)致了新孔的出現(xiàn),網(wǎng)絡(luò)部分受損,孔徑增大,使得PC的釋放速率進(jìn)一步增加[32]。綜上所述,KGM/PC微粒凝膠經(jīng)過胃部和小腸消化后,還有80%左右的PC可到達(dá)結(jié)腸部位釋放,因此判斷微??梢云鸬浇Y(jié)腸靶向的作用。
本實(shí)驗(yàn)通過正交試驗(yàn)確定KGM/PC微粒的最優(yōu)制備工藝為:乙醇濃度10%、PC添加量為11%、KGM添加量為16%,在該條件下可得到負(fù)載率為(14.75%±0.27%)的KGM/PC微粒,并以粒徑、表觀結(jié)構(gòu)及紅外光譜分析證實(shí)了在乙醇體系下利用KGM吸水微溶脹特性制備優(yōu)良KGM/PC微粒的可行性。同時(shí),利用體外模擬消化實(shí)驗(yàn)確定該KGM/PC微粒具有較好的體外緩釋性能,可為PC的結(jié)腸靶向遞送提供借鑒意義。本實(shí)驗(yàn)制備的KGM/PC微粒的工藝相比于文中提到的其它方法(復(fù)凝聚法、泡沫墊干燥法等)更簡單,且無需對(duì)KGM進(jìn)行改性處理,從而確保了KGM/PC微粒的食品安全性,可為工業(yè)生產(chǎn)提供一種簡單有效、安全風(fēng)險(xiǎn)更低、生產(chǎn)成本更小的包封技術(shù)。