酒曲中乳酸菌的篩選及其在板栗糯米飲料發(fā)酵中的應(yīng)用

扈瑩紅，陳曉慧，常學(xué)東，王月穎，鄒 靜

（河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北秦皇島 066000）

板栗原產(chǎn)于我國(guó)，是我國(guó)食用最早的堅(jiān)果之一。近年來(lái)，板栗的栽培面積和總產(chǎn)量迅速擴(kuò)大，2018年我國(guó)板栗栽培面積已達(dá)34.1萬(wàn)公頃，產(chǎn)量達(dá)196.5萬(wàn)噸，與2008年相比收獲面積增長(zhǎng)了31.15%，產(chǎn)量增長(zhǎng)了35.52%[1]。板栗產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)貧困山區(qū)的主要支柱產(chǎn)業(yè)，但是隨著板栗產(chǎn)量的逐年增加，板栗深加工能力弱、工業(yè)轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題已成為制約板栗產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸。因此急需開(kāi)發(fā)附加值高、貨架期長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)豐富、符合大眾健康要求的產(chǎn)品。

乳酸菌是一類可以利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱，具有突出的益生特性和發(fā)酵活性，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)中[2]。研究表明，經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵而成的食品具有一定的益生功效，包括調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[3]、降膽固醇含量[4]、調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制腸道致病菌[5]、改善便秘[6]等，除此之外還具有抗衰老、抗氧化活性及降低腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[7?9]。隨著消費(fèi)多樣化需求的日益增加，除了酸奶等傳統(tǒng)乳酸菌產(chǎn)品外，新興的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品，如發(fā)酵的谷物、水果和蔬菜汁[10]等正逐漸被消費(fèi)者接受。然而，現(xiàn)有乳酸菌存在非乳基質(zhì)中生長(zhǎng)繁殖狀態(tài)不佳及需要馴化的問(wèn)題[11]，因此篩選適合植物基質(zhì)發(fā)酵的乳酸菌是開(kāi)發(fā)新型乳酸菌食品的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

米酒曲是以糧食、麩皮等為原料，通過(guò)自然網(wǎng)絡(luò)微生物或者人工接種而獲得的發(fā)酵劑，也是乳酸菌的主要供體。在釀造過(guò)程中，乳酸菌代謝產(chǎn)生的酸類、酯類物質(zhì)可以影響酒的風(fēng)味品質(zhì)以及出酒率[12]。王丹丹等[13]對(duì)鳳窩酒曲中乳酸菌菌群進(jìn)行鑒定，確定鳳窩酒曲中包含乳桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌（Weissella）兩個(gè)屬的乳酸菌。向凡舒等[14]從建始米酒曲中分離出10株乳酸菌，經(jīng)鑒定4株為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、1株為乳酸片球菌（P.acidilactici）、2株為短乳桿菌（L.brevis）、3株為屎腸球菌（Enterococcus faecium）。乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中分泌的有機(jī)酸既能起到防腐作用，又可以改善原料的口感和風(fēng)味[15]，從而提高產(chǎn)品的附加值，因此產(chǎn)酸能力是評(píng)價(jià)乳酸菌優(yōu)良與否的指標(biāo)之一[16?17]。耐受胃腸液是益生菌的重要特性之一[18]，因?yàn)槿梭w胃腸的極端環(huán)境對(duì)乳酸菌的活性有很大影響，只有能夠耐受低pH、膽鹽和各種消化酶的菌株，才能在人體內(nèi)存活，發(fā)揮其益生作用。

因此，本文以傳統(tǒng)米酒曲為乳酸菌供體，篩選出能夠在模擬胃腸環(huán)境中存活的、可以發(fā)酵植物基質(zhì)的乳酸菌，并用篩選到的菌株為發(fā)酵菌株開(kāi)發(fā)一款具有板栗風(fēng)味的新型乳酸菌飲料，最后分析其品質(zhì)及體外抗氧化能力，為板栗新型產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

安琪甜酒曲 安琪酵母股份有限公司；米曲樣品 來(lái)自四川內(nèi)江、湖北秭歸縣、古塘客家三種自制米曲；燕龍板栗 河北遷安；糯米 吉林龍嘉米業(yè)有限公司；牛膽鹽、胃蛋白酶（3000 U/g）、胰蛋白酶（250 U/g） 上海源葉生物科技有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基，純度≥98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鄰菲啰啉、硫酸亞鐵、30%過(guò)氧化氫 分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氫氧化鈉 分析純，天津歐博凱化工有限公司；MRS培養(yǎng)基 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRSCaCO3培養(yǎng)基 在MRS培養(yǎng)基中補(bǔ)加1% CaCO3。

L530臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀儀器設(shè)備有限公司；UV 2600A紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；SPX-250B-8生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HOMOLAB均質(zhì)機(jī) 意大利FBF公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌菌株的初步篩選 分別取三種酒曲各1 g于200 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃富集培養(yǎng)，梯度稀釋后采用傾注法倒平板，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。挑選溶鈣圈較大的菌落進(jìn)行平板劃線純化，37 ℃培養(yǎng)48 h，反復(fù)多次純化，直至平板上菌落形態(tài)一致，然后進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，初步判定革蘭氏陽(yáng)性菌為乳酸菌[19]。

將上述菌株接種到MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，得到種子液。將種子液以3%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，取5 mL發(fā)酵液稀釋10倍后，滴加酚酞溶液，用0.1 mol/L標(biāo)定后的氫氧化鈉溶液[20]滴定至粉紅色且30 s后不褪色，以未接種乳酸菌的培養(yǎng)基做空白對(duì)照，記錄消耗氫氧化鈉溶液體積，每株菌做3次檢測(cè)，結(jié)果取平均值[21]。其計(jì)算公式如下：

式中：X為樣品產(chǎn)酸量，g/L；V1為消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；V2為空白培養(yǎng)基消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；c為標(biāo)定的氫氧化鈉溶液濃度，mol/L；V為發(fā)酵液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；0.09，乳酸的換算系數(shù)；1000，換算系數(shù)。

將產(chǎn)酸高的菌株純化后，置于20%的甘油中?80 ℃保藏。

1.2.2 乳酸菌菌株的復(fù)篩

1.2.2.1 耐酸能力分析 以2%（V/V）的接種量將篩選的乳酸菌分別接種于pH為3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別于0、3 h取樣，采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)[22?23]。乳酸菌的耐酸能力用公式（2）計(jì)算：

式中：N3為培養(yǎng)3 h的活菌數(shù)，CFU/mL；N0為0 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.2.2 耐膽鹽能力分析 以2%（V/V）的接種量將篩選的乳酸菌分別接種于含0.3 g/100 mL牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算0 h和24 h的活菌數(shù)[22?23]。乳酸菌的膽鹽耐受能力用公式（3）計(jì)算：

式中：N24為膽鹽處理24 h的活菌數(shù)，CFU/mL；N0為膽鹽處理0 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.2.3 模擬胃腸液耐受性分析 模擬胃液：0.35 g胃蛋白酶溶于100 mL 0.2%的無(wú)菌生理鹽水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH3.0過(guò)濾除菌；模擬腸液：胰蛋白酶0.1 g、膽鹽1.8 g溶于含有1.1 g NaHCO3、0.2 g NaCl的100 mL蒸餾水中，用NaOH調(diào)整pH8.0后過(guò)濾除菌[24]。

取10 mL種子液用無(wú)菌水離心洗滌3次后，用10 mL無(wú)菌水重懸，制成菌懸液。分別吸取1 mL待測(cè)菌株的菌懸液接入9 mL無(wú)菌人工模擬胃液中，共接2支，混勻，37 ℃培養(yǎng)3 h，其中，1支試管用于0 h和3 h的平板活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算其耐受胃液能力。另1支試管模擬胃液處理3 h后在無(wú)菌條件下離心，并用無(wú)菌水離心洗滌2次后，用1 mL無(wú)菌水重懸，然后將其加入到9 mL無(wú)菌人工模擬腸液中，37 ℃處理8 h，每隔2 h取樣平板計(jì)數(shù)[24]。乳酸菌對(duì)人工模擬胃腸環(huán)境的耐受能力用公式（4）計(jì)算：

式中：N11為經(jīng)過(guò)模擬胃、腸液處理11 h后的活菌數(shù)，CFU/mL；N0為未處理前的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.2.4 乳酸菌耐受H2O2能力分析 將H2O2通過(guò)0.45 μm濾膜除菌后按比例加入至無(wú)菌的MRS液體培養(yǎng)基中，配制成含有0.4、0.7、1.0 mmol/L H2O2濃度的培養(yǎng)基，以2%（V/V）的接種量將乳酸菌菌懸液分別接種于含0.4、0.7、1.0 mmol/L H2O2的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h后，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落數(shù)，以未加H2O2的培養(yǎng)基做對(duì)照試驗(yàn)[25]。

1.2.3.1 完整細(xì)胞懸液和發(fā)酵上清液的制備 將菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后，在5000 r/min條件下離心15 min，收集上清液即為菌株的發(fā)酵上清液。菌體用PBS緩沖溶液（pH7.4）離心洗滌三次后將菌體重懸于同體積的PBS緩沖溶液中得到完整細(xì)胞懸液。

1.2.3.2 清除DPPH自由基能力 取2 mL待測(cè)液（菌懸液或上清液），加入2 mL 0.01%的DPPH乙醇溶液，室溫下靜置30 min后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度[26]。DPPH自由基清除率用公式（5）表示：

式中：A1為2 mL樣品+2 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；A2為2 mL無(wú)水乙醇+2 mL樣品的吸光度；A0為2 mL蒸餾水+2 mL DPPH乙醇溶液的吸光度。

1.2.3.3 清除羥自由基能力 取1 mL待測(cè)液（同1.2.3.2）于試管中，分別加入0.75 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液、2.5 mL磷酸緩沖溶液（pH7.4）、0.5 mL 0.1% H2O2、0.75 mL 7.5 mmol/L 鄰菲羅啉于37 ℃保溫1 h后在536 nm處測(cè)定吸光度[26]，羥自由基清除率用公式（6）表示：

式中：Ai為樣品組吸光度；A0為無(wú)樣品無(wú)H2O2組吸光度；A為無(wú)樣品組吸光度。

1.2.3.4 SOD酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn) 參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定》中鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD酶活力[27]。

平常日子，腦子轉(zhuǎn)的速度不必那樣快，步子的頻率不必那樣高，聲音的分貝不必那樣強(qiáng)，睡眠的時(shí)間也不必那樣晚……

1.2.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定 將篩選得到的菌株送往華大基因進(jìn)行菌株的16S rDNA序列測(cè)序。然后登陸GenBank中的BLAST程序比對(duì)測(cè)序菌株，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，利用MEGA5軟件中的鄰接算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 板栗糯米乳酸菌發(fā)酵飲料的制備及指標(biāo)測(cè)定

1.2.5.1 工藝流程

1.2.5.2 操作要點(diǎn) a.乳酸菌發(fā)酵劑的制備：將菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后，在5000 r/min條件下離心15 min棄上清液，菌體用無(wú)菌水同等條件下離心洗滌兩次后，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)菌落數(shù)至約108CFU/mL。

b.板栗發(fā)酵：板栗去殼后洗凈、破碎成塊，蒸30 min冷卻后按0.4%（質(zhì)量比）添加安琪甜酒曲，按0.3%（質(zhì)量比）的添加量添加乳酸菌，30 ℃發(fā)酵24 h后，按料液比1:4（g/mL）加水破壁機(jī)打漿1 min。

c.糯米發(fā)酵：取糯米50 g，淘洗3次后，加200 mL水浸泡12 h，瀝干水分后蒸30 min，冷卻，按0.4%（質(zhì)量比）添加安琪甜酒曲，按0.3%（質(zhì)量比）添加乳酸菌，30 ℃發(fā)酵48 h后，按料液比1:4加水?dāng)嚢杈鶆蚝蠹啿歼^(guò)濾得發(fā)酵糯米汁。

d.混合：將板栗汁與糯米汁按體積比為1:4混合。

e.均質(zhì)：紗布過(guò)濾除去大顆粒后，添加0.1%黃原膠，使用均質(zhì)機(jī)在60 ℃、35 MPa條件下均質(zhì)兩次。

f.滅菌：罐裝后放入85 ℃水浴鍋中15 min。

1.2.5.3 感官評(píng)價(jià) 邀請(qǐng)10位有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員（男:女=1:1），根據(jù)表1對(duì)板栗糯米飲料的顏色、組織狀態(tài)、口感、風(fēng)味四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，記錄數(shù)據(jù)取平均值。

表1 板栗糯米乳酸飲料感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory rating of chestnut glutinous rice lactic acid beverage

1.2.5.4 酸度測(cè)定 參照國(guó)標(biāo)GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》滴定酸度[28]。

1.2.5.5 抗氧化能力測(cè)定 板栗糯米飲料離心后取上清液，參照1.2.3.3中方法測(cè)定羥基自由基清除率，參照1.2.3.4中方法測(cè)定SOD酶活力；將上清液稀釋10倍，參照1.2.3.2中方法測(cè)定DPPH自由基清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)間的分析采用單因素方差分析和Duncan多重比較法，顯著性水平設(shè)定為0.05；繪圖采用Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒曲中高產(chǎn)酸乳酸菌的初篩

產(chǎn)酸能力是乳酸菌的重要益生特性，乳酸可以降低pH、抑制或殺死病原菌、提高胃腸道消化酶活性[29]。從四川內(nèi)江甜酒曲、湖北秭歸縣黃酒曲、古塘客家甜酒餅中共分離出84株具有溶鈣圈、革蘭氏染色呈陽(yáng)性的菌株，初步判定為乳酸菌。以在MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基上形成的透明溶鈣圈的大小來(lái)初步判定其產(chǎn)酸能力，測(cè)定了其中38株溶鈣圈大的菌株產(chǎn)酸能力，具體產(chǎn)酸量見(jiàn)表2，這38株菌的產(chǎn)酸量均大于10 g/L，最大值為18.14 g/L，最小值為10.07 g/L。

表2 38株乳酸菌的產(chǎn)酸能力Table 2 Acid production capacity of 38 lactic acid bacteria

2.2 具有較強(qiáng)耐受能力乳酸菌的篩選

2.2.1 耐酸乳酸菌的篩選 乳酸菌經(jīng)由胃后進(jìn)入小腸，而胃液pH通常在3.0左右，因此乳酸菌在低pH下的存活能力即耐酸能力是評(píng)價(jià)其益生性的重要指標(biāo)之一[30]。根據(jù)食物在胃部的停留時(shí)間，本文將初篩的38株乳酸菌在pH3.0的液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，篩選耐酸能力強(qiáng)的乳酸菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。王帥等[31]的研究表明菌株耐受能力超過(guò)60%時(shí)，具有較好的耐受胃腸環(huán)境能力，因此本文以耐受能力60%為指標(biāo)，篩選出25株菌的耐酸能力≥60%，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，其中，耐酸能力達(dá)到90%以上的共有6株（詳見(jiàn)表3）。

表3 38株乳酸菌的耐酸能力Table 3 Acid tolerance of 38 strains of lactic acid bacteria

2.2.2 耐膽鹽菌株的篩選 小腸是乳酸菌發(fā)揮益生作用的重要部位，正常人體小腸中膽汁鹽含量在0.03%~0.3%范圍內(nèi)波動(dòng)，膽鹽可以改變菌體外膜的通透性并對(duì)菌體的脫氧核糖核酸產(chǎn)生傷害，進(jìn)而影響乳酸菌在人體腸道的定植[30]，因此，耐膽鹽能力是評(píng)價(jià)乳酸菌能否在人體胃腸道發(fā)揮益生作用的重要指標(biāo)。以25株耐酸能力強(qiáng)的乳酸菌為出發(fā)菌株，按照方法1.2.2.2測(cè)定其耐膽鹽能力，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，共有10株乳酸菌對(duì)0.3%濃度的膽鹽耐受能力≥60%，其中最高的是菌株DH24，其耐受能力為（96.48%±0.46%），因此，以這10株乳酸菌進(jìn)行后續(xù)的篩選。

圖1 25株乳酸菌耐膽鹽能力分析Fig.1 Ability of tolerance bile salt of 25 strains lactic acid bacteria

2.2.3 耐模擬胃腸道環(huán)境菌株的篩選 盡管前面已經(jīng)通過(guò)酸度以及膽鹽含量來(lái)模擬了人體的胃腸環(huán)境，但真正的人體胃腸中還含有胃蛋白酶和胰蛋白酶，這些酶可以水解微生物的菌體蛋白質(zhì)，抑制甚至殺死微生物[32]，因此，對(duì)耐酸耐膽鹽的10株乳酸菌的耐模擬胃腸環(huán)境能力進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過(guò)3 h的模擬胃液處理，10株乳酸菌的活菌數(shù)均明顯降低，這說(shuō)明胃液環(huán)境對(duì)微生物有明顯的抑制甚至殺滅作用。經(jīng)模擬胃液消化后DH16和DH24活菌數(shù)下降了1~2 lg CFU/mL，菌株DH20和DH35活菌數(shù)下降了2~3 lg CFU/mL，其余乳酸菌活菌數(shù)減少量超過(guò)3 lg CFU/mL。經(jīng)模擬腸液消化后，乳酸菌的活菌數(shù)持續(xù)減少，其中，在模擬腸道環(huán)境中存活能力最好的是菌株DG39，活菌數(shù)僅減少了0.32 lg CFU/mL。經(jīng)處理11 h后的結(jié)果表明菌株DH24的活菌數(shù)最高為6.02 lg CFU/mL，DH16和DH20的活菌數(shù)略低于菌株DH24，分別為5.98、5.54 lg CFU/mL，其余菌株活菌數(shù)均小于5 lg CFU/mL。菌株DH16、DH20和DH24三株乳酸菌對(duì)模擬胃腸環(huán)境有較好的耐受性，耐受能力≥60%，進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 10株乳酸菌耐受人工模擬胃腸液能力分析Fig.2 Tolerance ability of 10 strains lactic acid bacteria in artificial simulated gastric and intestinal fluid

2.2.4 菌株耐受H2O2能力 氧化劑可以激發(fā)機(jī)體氧化防御系統(tǒng)產(chǎn)生各種酶，當(dāng)微生物受到低濃度H2O2處理時(shí)，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生適應(yīng)能力，來(lái)保護(hù)自身免受更高濃度氧化劑的危害，因此 H2O2耐受力可作為衡量菌體抗氧化活性的一個(gè)指標(biāo)[33]。本研究將三株乳酸菌接種于含有不同濃度H2O2的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h后的活菌數(shù)見(jiàn)表4。由表4可知三株菌在含有0.4、0.7、1.0 mmol/L濃度的H2O2培養(yǎng)基中的活菌數(shù)與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05），這表明這三株乳酸菌均具有氧化防御系統(tǒng)，對(duì)H2O2有一定的耐受力。

表4 乳酸菌對(duì)過(guò)氧化氫的耐受能力Table 4 Resistance of lactic acid bacteria to hydrogen peroxide

2.3 菌株體外抗氧化能力分析

當(dāng)機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基含量過(guò)高時(shí)，生物大分子與其結(jié)合會(huì)造成機(jī)體損傷，引發(fā)多種疾病[34]。因此探究了這三株乳酸菌的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力以及SOD酶活力。由表5可知，同一株乳酸菌的上清液和細(xì)胞懸液對(duì)DPPH自由基的清除能力不同，發(fā)酵上清液要優(yōu)于完整細(xì)胞懸液，三株乳酸菌的發(fā)酵上清液均表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，發(fā)酵上清液中以菌株DH16的清除率最高為（98.56%±0.74%），完整細(xì)胞懸液中以菌株DH20對(duì)DPPH自由基的清除能力最高為（22.49%±0.71%）。林祥娜等[33]研究的8株乳酸菌發(fā)酵上清液和完整細(xì)胞懸液的DPPH自由基清除能力也發(fā)現(xiàn)上清液的DPPH自由基清除力要高于細(xì)胞懸液。菌株DH16發(fā)酵上清液和完整細(xì)胞懸液對(duì)羥自由基的清除能力均高于另外兩株，且菌株DH24和DH20發(fā)酵上清液、菌體的羥自由基清除能力差異不顯著（P>0.05）。同樣可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵上清液的羥自由基清除能力高于完整細(xì)胞懸液，這可能是因?yàn)榫臧l(fā)酵上清液的SOD酶活力高于完整細(xì)胞懸液[35]，也可能因?yàn)槿樗峋x產(chǎn)物中存在更多的清除自由基活性物質(zhì)，比如硫氧還蛋白、谷胱甘肽等還原性物質(zhì)[36]。此外，這3株乳酸菌發(fā)酵上清液的SOD酶活力差異顯著，菌株DH16的發(fā)酵上清液SOD酶活力高于另外兩株（P<0.05）。

表5 3株乳酸菌的抗氧化能力Table 5 Antioxidant capacity of three strains lactic acid bacteria

2.4 菌株鑒定

對(duì)這3株乳酸菌的16S rDNA基因序列進(jìn)行分析、比對(duì)，利用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示。由圖3可知菌株DH16、DH20、DH24與戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此將這三株菌鑒定為戊糖片球菌（P.pentosaceus）。有研究表明戊糖片球菌（P.pentosaceus）可抑制食源性致病菌、調(diào)節(jié)腸道免疫功能、降低膽固醇、抗氧化、抗腫瘤等，用于發(fā)酵食品工業(yè)化生產(chǎn)中，可以提高產(chǎn)品的品質(zhì)、安全性及生產(chǎn)效率[2, 37]。

圖3 基于16S rDNA基因序列的片球菌屬系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Evolutionary tree of Pediococcus based on 16S rDNA gene sequence

2.5 板栗糯米乳酸菌飲料的品質(zhì)評(píng)價(jià)

2.5.1 感官評(píng)分 感官評(píng)分是食品品質(zhì)測(cè)評(píng)的重要方法，綜合四項(xiàng)指標(biāo)得分發(fā)現(xiàn)3株乳酸菌發(fā)酵的板栗糯米乳酸飲料酸甜可口、組織狀態(tài)均勻一致，板栗風(fēng)味濃郁，感官評(píng)分較高，其中以DH20菌株發(fā)酵的飲料評(píng)分最高。

表6 不同乳酸菌發(fā)酵飲料的感官得分Table 6 Sensory scores of beverages fermented by different lactic acid bacteria

2.5.2 酸度 乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酸可以起到改善產(chǎn)品風(fēng)味口感的作用，因此產(chǎn)品的酸度是評(píng)判產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)，也可作為評(píng)判菌株發(fā)酵能力的指標(biāo)之一，由圖4可知，不同乳酸菌發(fā)酵得到的板栗糯米飲料酸度有所差異，酸度由高到低分別是菌株DH20>DH24>DH16，說(shuō)明菌株DH20在板栗糯米飲料中發(fā)酵能力最強(qiáng)。

圖4 不同乳酸菌發(fā)酵飲料的酸度Fig.4 Acidity of fermented beverages by different lactic acid bacteria

2.5.3 體外抗氧化活性 對(duì)三株乳酸菌發(fā)酵的板栗糯米飲料的羥自由基、DPPH自由基清除率、SOD酶活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可以看出乳酸菌發(fā)酵的板栗糯米飲料有一定的抗氧化能力，DH16發(fā)酵飲料的DPPH自由基、羥自由基清除率顯著高于另外兩株（P<0.05）。3株乳酸菌發(fā)酵的板栗糯米飲料的SOD酶活力大小依次為菌株DH16>DH20>DH24，其中，DH16和DH20發(fā)酵飲料的SOD酶活力差異不顯著（P>0.05）。本研究中乳酸菌發(fā)酵的板栗糯米飲料，口感協(xié)調(diào)，感官良好且具有一定的抗氧化能力，因此，本實(shí)驗(yàn)篩選的乳酸菌適宜生產(chǎn)板栗糯米發(fā)酵飲料，可為其他植物基發(fā)酵飲料的研發(fā)提供參考依據(jù)。

圖5 不同乳酸菌發(fā)酵飲料的抗氧化活性分析Fig.5 Antioxidant activity of fermented beverages by different lactic acid bacteria

3 結(jié)論

本研究從三種米酒曲樣品中分離出了84株乳酸菌，經(jīng)篩選后得到3株戊糖片球菌（P. pentosaceus），產(chǎn)酸量大于10 g/L、模擬胃腸環(huán)境試驗(yàn)后活菌數(shù)大于5.5 lg CFU/mL，同時(shí)具備一定的自由基清除能力和SOD酶活性。用其發(fā)酵得到的板栗糯米乳酸菌飲料，酸甜適中、口感協(xié)調(diào)、抗氧化能力較好，具有一定的應(yīng)用前景。其中，以菌株DH20發(fā)酵的飲料感官評(píng)分值最高，達(dá)到82.2分，酸度為1.76 g/L，DH16發(fā)酵的飲料抗氧化活性最強(qiáng)，DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、SOD酶活力分別為28.8%、36.47%、14 U/mL，在實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)實(shí)際需求選擇合適的菌株，或?qū)?株乳酸菌按一定比例復(fù)配應(yīng)用到生產(chǎn)中，以發(fā)揮出每個(gè)菌株各自的優(yōu)勢(shì)。因此本實(shí)驗(yàn)中的3株乳酸菌可作為植物發(fā)酵的潛在益生菌，改善當(dāng)前適用于植物基發(fā)酵乳酸菌較少的現(xiàn)狀，促進(jìn)非乳制品乳酸菌發(fā)酵行業(yè)的發(fā)展，對(duì)提高乳酸菌類生物制品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力有重要意義。