不同處理方式對米蕎營養(yǎng)成分及抗氧化活性的影響

嚴(yán) 靜，蔡易熹，薛秋艷，李俊健，黎 攀,2，杜 冰,2,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

蕎麥主要有4種栽培種，分別為米蕎、苦蕎、翅蕎和甜蕎。米蕎，是一種長得像米又似蕎且可食用的作物，主要分布于我國云南省普洱、臨滄、西雙版納等地?！拔髅嗣资w”是米蕎中的精品，在云南西盟縣廣泛分布，種植歷史悠久。西盟米蕎具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，籽粒中無機(jī)物的含量約為小麥和精白米的2~3倍，還含有其他谷物中沒有的葉綠素和蘆丁，具有降低膽固醇和人體血脂的功效[1]。據(jù)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究表明，西盟米蕎含有豐富的蘆丁、微量元素及人體必需氨基酸，其中，蘆丁、鐵、鈣、蛋白質(zhì)含量高于其他同類蕎食品，有“蕎中之王”的美譽(yù)，是集營養(yǎng)、保健為一體的優(yōu)質(zhì)糧食作物[2]。

蕎麥?zhǔn)且环N假谷物，具有與谷物類似的栽培方法和利用方式[3]。雖然蕎麥的營養(yǎng)價(jià)值較高，但由于其籽粒中含有高活性的蛋白酶抑制劑、抗性淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)，使人體對其的吸收消化率較低，過量食用還會導(dǎo)致胃脹氣等不良癥狀[4]。而發(fā)芽、發(fā)酵和蒸煮等處理方式，能使蕎麥的營養(yǎng)價(jià)值和利用率提高。董曉萌等[5]的研究表明萌發(fā)處理能使苦蕎茶的總黃酮、γ-氨基丁酸含量提高并改變其感官品質(zhì)，使?fàn)I養(yǎng)價(jià)值大幅提升。陳江[6]以黑曲霉為菌種對苦蕎葉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果表明發(fā)酵處理能使苦蕎葉抗氧化活性提高，且苦蕎葉中的總多酚、總黃酮、蘆丁和槲皮素的含量與抗氧化能力之間存在相關(guān)性。馬藝超[7]研究蒸制、煮制、烤制等不同熱加工方式對苦蕎制品營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果表明蒸制比烤制和煮制處理更能保留苦蕎制品的營養(yǎng)成分且黃酮釋放量較高，體外消化后的抗氧化能力更強(qiáng)。現(xiàn)今，對蕎麥的研究主要聚焦在苦蕎上，而對蕎麥中具有較高營養(yǎng)價(jià)值的其他栽培種如西盟米蕎鮮有研究。

發(fā)芽、發(fā)酵、熱處理等是蕎麥的重要加工方式，在蕎麥深加工方面展現(xiàn)出巨大的潛力。發(fā)芽、發(fā)酵等處理可以降低蕎麥內(nèi)的抗?fàn)I養(yǎng)因子水平，改善其營養(yǎng)成分及感官品質(zhì)，進(jìn)一步提高蕎麥的生物活性。而發(fā)芽、發(fā)酵、熱處理等加工方式對西盟米蕎營養(yǎng)價(jià)值的影響暫未見研究。因此，該文對西盟米蕎進(jìn)行發(fā)芽、乳酸菌發(fā)酵、蒸制和蒸制后發(fā)酵4種處理，研究不同處理方式對米蕎營養(yǎng)成分和抗氧化活性的影響。乳酸芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106分離于傳統(tǒng)的發(fā)酵奶酪，具有良好的發(fā)酵性能，本實(shí)驗(yàn)室相關(guān)研究已表明該菌株具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)免疫和降血脂等功效[8?9]。而植物乳桿菌有較強(qiáng)的發(fā)酵能力，與其他益生菌有協(xié)同作用，故采用乳酸芽孢桿菌和植物乳桿菌進(jìn)行復(fù)配作為米蕎發(fā)酵的菌種。研究不同處理方式對米蕎營養(yǎng)成分及生理活性的影響，旨在提高米蕎的營養(yǎng)價(jià)值及功能特性，為米蕎的深加工及功能性產(chǎn)品研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)，以促進(jìn)米蕎的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米蕎 云南省普洱市西盟縣；DU-106乳酸芽孢桿菌（Bacillussp.）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 現(xiàn)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源食品及功能性原料評價(jià)及研究中心鑒定及保藏，并委托廣州市微生物所制成1×1012CFU/g的菌粉，將二者菌粉按12:1進(jìn)行復(fù)配得實(shí)驗(yàn)所用的菌粉；蘆丁、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院；葡萄糖、福林-酚、碳酸鈉、3，5-二硝基水楊酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉

分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、重蒸苯酚 美國Sigma公司；沒食子酸 標(biāo)準(zhǔn)品，上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司；5-磺基水楊酸 煙臺健碩化工有限公司。

UV759型紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；ANKE TDL-5-A型離心機(jī) 上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司；Labserv K3型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；Agilent 1260型高效液相色譜 安捷倫科技有限公司；JDS-BA型恒溫水浴振蕩器 精達(dá)儀器有限公司；Elementar rapid N exceed型杜馬斯定氮儀 Elementara公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市華普達(dá)數(shù)字儀器有限公司；DHP-600型恒溫培養(yǎng)箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；FD-1型真空冷凍干燥機(jī) 鄭州科創(chuàng)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 生米蕎粉：挑選沒有破損，顆粒大小基本一致，成熟飽滿的米蕎，用清水洗凈后，低溫冷凍干燥，粉碎，過80目篩。

生米蕎發(fā)芽：參考周一鳴等[10]的方法，略有修改。取一定量的米蕎清洗后，用體積分?jǐn)?shù)5%的次氯酸鈉浸泡15 min后用清水洗凈，室溫下浸泡12 h，置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，于溫度20 ℃、相對濕度75%的環(huán)境中萌發(fā)3 d，每d三次向培養(yǎng)皿內(nèi)噴水，使濾紙保持濕潤狀態(tài)。米蕎長出小芽時(shí)，視為萌發(fā)成功。挑選萌發(fā)成功的米蕎于-20 ℃冰箱保存，低溫冷凍干燥，粉碎，過80目篩。

生米蕎發(fā)酵：稱量0.5 gBacillussp. DU-106和植物乳桿菌復(fù)配菌粉，于0.9%生理鹽水中活化。取60 g米蕎于錐形瓶中，料水比1:3（g/mL），白砂糖添加量為2%。復(fù)合菌粉按2%接種，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，發(fā)酵結(jié)束后凍干、粉碎，過80目篩，備用。

熟米蕎：在蒸鍋中加入去離子水，水沸騰后，將裝有60 g米蕎的蒸籠置于蒸鍋內(nèi)，蒸制20 min，蒸煮結(jié)束后于?20 ℃冰箱凍存，低溫冷凍干燥，粉碎，過80目篩。

熟米蕎發(fā)酵：蒸制結(jié)束后，進(jìn)行發(fā)酵處理，處理方法同“生米蕎發(fā)酵”。

1.2.2 還原糖的測定 采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）于25 mL比色管中，補(bǔ)水至2 mL，加1.5 mL DNS溶液，混勻，于沸水浴中加熱5 min，取出，冷卻至室溫后用水定容至25 mL，在540 nm處測定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.3593x?0.0102，決定系數(shù)R2=0.9988。

樣品中還原糖的提?。喝? g樣品放入50 mL錐形瓶中，用少量蒸餾水?dāng)嚢柚梁隣?，再加?5 mL蒸餾水，攪拌均勻，于50 ℃水浴浸提20 min。抽濾，用蒸餾水清洗濾渣，收集濾液，加水定容至50 mL。

還原糖含量的測定：取待測液1 mL置于25 mL比色管中，加1 mL蒸餾水和1.5 mL DNS溶液，搖勻后在沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫后加水定容至25 mL，于波長540 nm下測定吸光度，根據(jù)下式計(jì)算樣品的還原糖含量。

式中：C表示查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得水解后還原糖含量，mg；V1表示提取液總體積，mL；V2表示測定時(shí)取用液體積，mL；m表示樣品質(zhì)量，mg。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定 參考王欽權(quán)等[11]的方法，略有修改。將一定量的米蕎樣品裝入錫箔紙中，包好并壓走空氣，記錄重量。將樣品放入杜馬斯定氮儀的樣品盤中，自動進(jìn)樣檢測，儀器軟件根據(jù)內(nèi)置的校準(zhǔn)曲線，從測得的峰面積及樣品重量，得出每個(gè)樣品的氮含量（%）。再用蛋白質(zhì)換算因子（6.25）將氮含量（%）換算成蛋白質(zhì)含量，以百分比（%）表示。

1.2.4 游離氨基酸含量的測定 取0.1 g樣品于離心管中，加入3 mL 5%磺基水楊酸溶液，振蕩混勻后靜置1 h，于室溫下12000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液采用全自動氨基酸分析儀進(jìn)行測定。

1.2.5γ-氨基丁酸含量的測定 參考范霞等[12]的方法，略有修改。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1.9963x+0.0623，R2=0.9992。取0.25 g米蕎樣品，用蒸餾水溶解后定容至25 mL，60 ℃超聲浸提1 h，4000 r/min離心20 min，取上清液后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待測。取0.5 mL待測液，加入0.5 mL硼酸鹽緩沖液和1 mL重蒸苯酚，充分搖勻，2~3 min后加入1 mL次氯酸鈉溶液，混勻后沸水浴10 min，取出立即冰浴20 min，不斷振蕩，出現(xiàn)藍(lán)綠色化合物，加入60%乙醇溶液2 mL，再次振蕩均勻，靜置后于645 nm波長處的吸光度。

式中：C表示GABA濃度，mg/mL；V表示提取液體積，mL；N表示稀釋倍數(shù)；m表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.6 總黃酮含量的測定 參照國標(biāo)NY/T 1295-2007《蕎麥及其制品中總黃酮含量的測定》進(jìn)行測定。

1.2.7 蘆丁和槲皮素含量的測定 參考遲明艷等[13]的實(shí)驗(yàn)方法，略有修改?；旌蠈φ掌啡芤旱闹苽洌悍Q取槲皮素對照品2 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得槲皮素對照品溶液；稱取蘆丁對照品8 mg，置于10 mL容量瓶中，加槲皮素對照品溶液1 mL，用甲醇定容，制成蘆丁、槲皮素質(zhì)量濃度分別為0.8018、0.0198 mg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：稱量0.5 g米蕎樣品置于三角瓶中，加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放至室溫，加70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，抽濾，10000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。

色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbaxsb-C18（150 mm×4.6 m，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫（0~7 min，20%→40% A；7~14 min，40%→60% A；14~18 min，60%→90% A；18~20 min，90%→20% A），后運(yùn)行時(shí)間8 min；柱溫：40 ℃；檢測波長：360 nm。槲皮素的出峰時(shí)間為10.13 min，蘆丁出峰時(shí)間為13.72 min。

式中：C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線中蘆丁、槲皮素的質(zhì)量濃度，mg/mL；V表示提取液總體積，mL；N表示稀釋倍數(shù)；m表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.8 總酚含量的測定 稱量沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，用水溶解后定容于250 mL容量瓶中，得到0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。分別移取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL置于10 mL具塞試管中，分別加入1 mL福林-酚試劑，搖勻后再分別加入2 mL 12% Na2CO3溶液，用水定容至10 mL，搖勻。室溫下避光反應(yīng)1 h后，在765 nm波長下測定吸光度。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=76.705x+0.1026，R2=0.9989。

稱取0.5 g樣品于25 mL錐形瓶中，加入10 mL 60%乙醇溶液，混勻，在75 ℃下超聲50 min。提取液以3000 r/min離心20 min，取上清液，量取提取液體積。吸取1 mL稀釋了5倍的總多酚提取液于10 mL具塞試管中，分別加入1 mL福林-酚試劑及2 mL 12%碳酸鈉溶液并用60%乙醇定容至刻度，在室溫下避光反應(yīng)1 h，在765 nm波長處測定樣品的吸光度。

式中：C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中總酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；V表示提取液總體積，mL；N表示稀釋倍數(shù)；m表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.9 不同處理方式對米蕎抗氧化能力的影響

1.2.9.1 米蕎提取液的制備 參考楊紅葉等[14]的方法，略有修改。稱取0.5 g米蕎樣品，按料液比1:25加入50%丙酮，于55 ℃下超聲25 min，離心，收集上清液。反復(fù)提取兩次，合并濾液，用50%丙酮定容至50 mL，置于冰箱冷藏，備用。

1.2.9.2 DPPH自由基清除率的測定 參考趙武等[15]的實(shí)驗(yàn)方法，略有修改。稱取19.7 mg DPPH用50%丙酮溶解并定容至50 mL，于4 ℃下避光保存，即得DPPH儲備液，備用。使用前，量取5 mL DPPH儲備液用50%丙酮定容至50 mL，制成濃度為0.1 mol/L的工作液。吸取2 mL不同濃度的樣液，加入2 mL DPPH溶液，渦旋搖勻，避光30 min后于510 nm處測定吸光度A1。清除率公式為：

式中：A1表 示樣品測定的吸光值；A2為50%丙酮代替樣品的吸光值；A3為50%丙酮代替DPPH溶液的吸光值。

1.2.9.3 Fe3+還原能力的測定 參考趙武等[15]的實(shí)驗(yàn)方法，略有修改。移取2.5 mL不同濃度的樣品溶液于試管中，加入2.5 mL 10%鐵氰化鉀和2.5 mL pH6.6的磷酸緩沖液，混勻后于50 ℃水浴鍋中水浴20 min，水浴結(jié)束后立馬轉(zhuǎn)移到冰水中冷卻至室溫。加入2.5 mL 10%三氯乙酸，搖勻后離心10 min，再取5 mL上清液于另一支試管中，加入1 mL 1%三氯化鐵混勻后靜置1 min，于700 nm測定吸光值，吸光值代表抗氧化能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)操作，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.0等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對米蕎還原糖含量的影響

不同處理方式對米蕎還原糖含量的影響如圖1所示。米蕎發(fā)芽過程中存在復(fù)雜的生理反應(yīng)，如蛋白質(zhì)、脂類和糖類的轉(zhuǎn)化，發(fā)芽米蕎的還原糖含量極顯著降低，由3.36%下降至2.59%（P<0.01），相比于生米蕎下降了22.92%，與鄭麗娜等[16]的研究結(jié)果一致。而經(jīng)發(fā)酵處理后的生米蕎還原糖含量增加至3.62%，主要是因?yàn)槿樗峋l(fā)酵可利用自身酶系降解米蕎中的淀粉等組分生成果糖、葡萄糖和半乳糖等還原糖，使還原糖含量增加[17]，為米蕎提供發(fā)酵所需能量和其他需求。蒸制過程中還原糖與α-氨基酸會發(fā)生美拉德反應(yīng)[18]，消耗還原糖，故蒸煮處理使米蕎還原糖含量極顯著下降（P<0.01）。而對蒸制后的米蕎進(jìn)行發(fā)酵處理會進(jìn)一步導(dǎo)致還原糖含量下降至2.03%（P<0.01），這可能與乳酸菌在發(fā)酵過程中可將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸使還原糖含量下降有關(guān)。

圖1 不同處理方式對米蕎還原糖含量的影響Fig.1 Effects of different treatments on reduction sugar content of rice buckwheat

2.2 不同處理方式對米蕎蛋白質(zhì)含量的影響

不同處理方式對米蕎蛋白質(zhì)含量的影響如圖2所示。由圖2可得，經(jīng)發(fā)芽處理后，米蕎的蛋白質(zhì)含量相比于未發(fā)芽的米蕎增加約17.75%，主要是因?yàn)槊劝l(fā)過程中，需要消耗大量的供能物質(zhì)，使總干基質(zhì)量減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量相對增加[19]。LEE等[20]的研究表明對大豆進(jìn)行發(fā)芽處理也有利于蛋白質(zhì)的合成，與本文的研究結(jié)果相類似。適當(dāng)?shù)恼糁铺幚砟苁姑资w蛋白質(zhì)含量由8.24%增加至10.32%。而對生米蕎和熟米蕎進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵處理時(shí)，蛋白質(zhì)含量均有不同程度的降低，分別下降了14.34%和20.53%，該結(jié)果主要是因?yàn)榘l(fā)酵處理會使蛋白質(zhì)發(fā)生水解，產(chǎn)生更多的短肽、多肽和游離氨基酸等非蛋白肽[21]，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量降低。

圖2 不同處理方式對米蕎蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on protein content of rice buckwheat

2.3 不同處理方式對米蕎游離氨基酸含量的影響

不同處理方式對米蕎游離氨基酸含量的影響如表1所示。米蕎發(fā)芽前的游離氨基酸含量為（2026.77±16.52）μg/g，發(fā)芽3 d后游離氨基酸含量顯著降低（P<0.05）。米蕎在萌發(fā)過程中，細(xì)胞不斷分裂，合成較多的核酸或含氮物質(zhì)，需要米蕎儲存蛋白質(zhì)提供氮源，從而導(dǎo)致游離氨基酸總量降低[22]。但經(jīng)發(fā)芽處理后，米蕎的必需氨基酸占比由21.26%增加至42.58%，這與靳穎[22]研究的大豆發(fā)芽過程中必需氨基酸的變化趨勢相一致。發(fā)芽米蕎中的甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸等必需氨基酸含量均有不同程度的增加，說明發(fā)芽處理能使米蕎蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值提高。

表1 不同處理方式對米蕎游離氨基酸含量的影響（μg/g ）Table 1 Effects of different treatments on free amino acid content of rice buckwheat(μg/g)

同樣，對生米蕎進(jìn)行發(fā)酵處理后，游離氨基酸總量下降，但必需氨基酸占比明顯增加。在7種必需氨基酸中，除了纈氨酸的含量由（221.43±1.39）μg/g下降至（120.12±0.63）μg/g，其余必需氨基酸的含量均增加，其中，苯丙氨酸和亮氨酸的含量增加最顯著（P<0.05），其他谷物中缺乏的賴氨酸和豆類中缺乏的甲硫氨酸含量分別增加至（79.44±0.65）μg/g和（39.15±1.10）μg/g，說明發(fā)酵處理能提高米蕎的營養(yǎng)利用率。生米蕎發(fā)酵過程中乳酸菌自身分泌的蛋白酶可促使米蕎蛋白分解成氨基酸，且乳酸菌的自身代謝也可促進(jìn)氨基酸含量的增加，這均能使米蕎的必需氨基酸含量增加[23]。劉磊等[24]研究發(fā)現(xiàn)5種乳酸菌復(fù)合發(fā)酵使脫脂米糠提取物的必需氨基酸含量提高了21.23%，與本文研究結(jié)果相一致。對米蕎進(jìn)行蒸制處理時(shí)游離氨基酸含量最高，為（2574.71±19.09）μg/g，但必需氨基酸占比相比于生米蕎下降至17.68%。而對熟米蕎進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵處理時(shí)，游離氨基酸總量顯著下降（P<0.05），僅為（342.10±13.20）μg/g，必需氨基酸占比也下降至15.20%。

2.4 不同處理方式對米蕎的γ-氨基丁酸含量的影響

γ-氨基丁酸（GABA）是一種非蛋白氨基酸，是中央神經(jīng)系統(tǒng)的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，是谷氨酸在谷氨酸脫氫酶作用下形成的，具有降壓、改善肝功能等作用[25]。由圖3可知，發(fā)芽處理能使米蕎中的γ-氨基丁酸含量極顯著增加（P<0.01），相比于未發(fā)芽的米蕎γ-氨基丁酸含量增加了約4倍，可能與米蕎在發(fā)芽處理過程中內(nèi)部的谷氨酸脫氫酶被激活后利用米蕎本身所含的谷氨酸作為底物從而生成γ-氨基丁酸有關(guān)[26?27]。蒸煮處理會使米蕎中γ-氨基丁酸含量下降，主要是因?yàn)棣?氨基丁酸在高溫環(huán)境中易被破壞。而乳酸菌發(fā)酵處理均能使生米蕎和熟米蕎的γ-氨基丁酸含量極顯著增加（P<0.01），分別增加至4.84和2.81 mg/g，其中生米蕎發(fā)酵的γ-氨基丁酸含量最高，約為生米蕎的5倍。增加的γ-氨基丁酸可能是由兩種途徑生成的，一種是在發(fā)酵過程中隨著乳酸菌的生長代謝，蛋白酶活性會積累，從而水解蛋白質(zhì)生成一定量的谷氨酸；另一種是乳酸菌在發(fā)酵過程中直接激活了潛在的谷氨酸脫氫酶，催化谷氨酸脫去α-羧基生成γ-氨基丁酸[28]。由此可得，發(fā)芽、發(fā)酵處理均能使米蕎的γ-氨基丁酸含量增加，且對生米蕎進(jìn)行發(fā)酵處理γ-氨基丁酸的含量最高。

圖3 不同處理方式對米蕎γ-氨基丁酸含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on GABA content of rice buckwheat

2.5 不同處理方式對米蕎總黃酮含量的影響

不同處理方式對米蕎總黃酮含量影響如圖4所示。對米蕎進(jìn)行發(fā)芽處理總黃酮含量極顯著增加（P<0.01），主要因?yàn)樵诮莅l(fā)芽過程中，大量結(jié)合態(tài)的黃酮類化合物被酶水解而釋放，使黃酮含量增加[29]。黃酮類物質(zhì)的合成受查爾酮異構(gòu)酶（CHI）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）等關(guān)鍵酶共同作用，在特定酶的作用下，植物會向著某一特定黃酮類化合物方向進(jìn)行合成[30]。相關(guān)研究表明，在發(fā)芽的苦蕎中CHI和PAL的活性與總黃酮含量呈正相關(guān)[31]。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，生米蕎的總黃酮含量顯著增加（P<0.01），由2.23%增加至4.63%，乳酸菌發(fā)酵過程中會產(chǎn)生多種活性較強(qiáng)的酶系，而細(xì)胞壁的纖維等物質(zhì)會被這些酶系代謝，從而促進(jìn)黃酮類物質(zhì)的釋放[32]。蒸制處理后，米蕎的總黃酮含量由2.23%極顯著增加至4.15%（P<0.01）。在蒸制過程中，米蕎內(nèi)部結(jié)構(gòu)會遭到破壞，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，淀粉糊化，與大分子物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合黃酮類化合物釋放，導(dǎo)致總黃酮含量上升[7]。對熟米蕎再進(jìn)行發(fā)酵處理時(shí)，也能增加總黃酮含量，但無顯著性差（P>0.05）。由上可得，不同處理方式均能使米蕎的黃酮含量增加，且對生米蕎進(jìn)行發(fā)酵處理時(shí)黃酮含量增加最顯著（P<0.01）。

圖4 不同處理方式對米蕎總黃酮含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on total flavonoids content of rice buckwheat

2.6 不同處理方式對米蕎蘆丁和槲皮素的含量

不同處理方式對米蕎的蘆丁和槲皮素含量的影響如圖5和圖6所示。生米蕎的蘆丁含量為13.05 mg/g，槲皮素含量為1.65 mg/g；蒸煮后蘆丁含量下降至8.23 mg/g，槲皮素的含量增加至5.64 mg/g。研究表明，蒸煮過程會使米蕎內(nèi)的蘆丁降解酶活性增加，從而迅速分解蘆丁產(chǎn)生蕓香糖和槲皮素，加快蘆丁向槲皮素轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致蘆丁含量下降，槲皮素含量增加[7]。對生米蕎進(jìn)行發(fā)芽、發(fā)酵處理均能使蘆丁含量有不同程度的增加，其中，生米蕎發(fā)酵的蘆丁含量最高為39.80 mg/g；而經(jīng)發(fā)芽、發(fā)酵處理的生米蕎槲皮素含量較低，均低于1 mg/g，表明蘆丁和槲皮素含量的變化趨勢基本相反。蘆丁廣泛存在于植物中，但其在可食用部分相對罕見，而發(fā)芽、發(fā)酵處理能使蘆丁含量極顯著增加（P<0.01），說明對原料進(jìn)行發(fā)芽和發(fā)酵處理是積累生物活性黃酮的好方法。

圖5 不同處理方式對米蕎蘆丁含量的影響Fig.5 Effects of different treatments on rutin content of rice buckwheat

圖6 不同處理方式對米蕎槲皮素含量的影響Fig.6 Effects of different treatments on quercetin content of rice buckwheat

2.7 不同處理方式對米蕎總酚含量的影響

酚類物質(zhì)是重要的抗氧化物質(zhì)，可抑制組織和膜內(nèi)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，起到抗氧化的作用。一般認(rèn)為谷物中的大部分酚類物質(zhì)都是與多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)以共價(jià)鍵形成聚合物，不易被提取出來[33]。由圖7可知，發(fā)芽處理能使米蕎的總酚含量極顯著增加（P<0.01），發(fā)芽過程中酚類合成酶如苯丙氨酸解氨酶的活性顯著增加，而大分子物質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)會發(fā)生溶解，使酚類物質(zhì)溶出，故發(fā)芽過程中酚類物質(zhì)增加[34]。

圖7 不同處理方式對米蕎總酚含量的影響Fig.7 Effects of different treatments on total phenol content of rice buckwheat

相對于生米蕎，蒸煮處理能使米蕎的總酚含量從9.37 mg/g增加到11.54 mg/g，增加了23.16%。由于一定程度的蒸煮處理會加快米蕎細(xì)胞的膨脹，使米蕎細(xì)胞間隙變大或細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破裂，從而釋放更多的酚類化合物，使熟米蕎的總酚含量增加[35]。PRADEE等[36]的研究表明對小米進(jìn)行蒸制處理能顯著提高總酚含量，與本文研究結(jié)果一致。乳酸菌發(fā)酵處理使生米蕎和熟米蕎的總酚含量分別增加至13.63 mg/g和12.55 mg/g。米蕎多酚以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)形式存在于米蕎細(xì)胞中，乳酸菌在發(fā)酵過程中會代謝產(chǎn)生各種分解細(xì)胞壁的酶，從而促進(jìn)酚類物質(zhì)的釋放，并且發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的乳酸等有機(jī)酸，形成酸性的環(huán)境有利于酚類化合物的穩(wěn)定[17]。綜上所述，發(fā)芽、發(fā)酵和蒸制處理均能使米蕎的總酚含量有不同程度的增加，且生米蕎發(fā)酵的總酚含量最高。

2.8 不同處理方式對米蕎抗氧化能力的影響

2.8.1 DPPH自由基清除率的測定 由圖8可得，經(jīng)不同處理的米蕎對DPPH自由基均有較好的清除能力，并且在濃度0.04~0.3 mg/mL內(nèi)呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。另外，對生米蕎直接發(fā)酵處理清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，而未做處理的生米蕎清除DPPH自由基能力最弱。結(jié)果表明，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵處理的生米蕎抗氧化活性最強(qiáng)，主要是因?yàn)槿樗峋旧砭途哂锌寡趸钚裕耶?dāng)遇到較多的過氧自由基時(shí)會產(chǎn)生超氧化物歧化酶（SOD）、NADH氧化酶、GSH-Px等過氧化物酶類等物質(zhì)清除活性氧[37?38]。JIN等[39]對經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的豆?jié){進(jìn)行體外抗氧化活性測定，發(fā)現(xiàn)與未發(fā)酵的豆?jié){相比DPPH自由基清除率顯著增強(qiáng)，抗氧化能力明顯提高，與本文的研究結(jié)果一致。

圖8 不同處理方式對米蕎DPPH自由基活性的影響Fig.8 Effects of different treatments on DPPH free radical scavenging ability of rice buckwheat

2.8.2 FRAP離子的還原能力的測定 各米蕎樣品在不同濃度下的鐵離子還原能力如圖9所示，與DPPH自由基清除能力的變化趨勢相似，在0.1~0.5 mg/mL質(zhì)量濃度之間，鐵離子還原能力大小依次為生米蕎發(fā)酵>熟米蕎發(fā)酵>熟米蕎>生米蕎發(fā)芽>生米蕎，且隨著質(zhì)量濃度的增大，其對應(yīng)的吸光度值增大，還原能力增強(qiáng)。經(jīng)發(fā)酵處理的生米蕎鐵離子還原能力最強(qiáng)，在濃度0.5 mg/mL時(shí)吸光值達(dá)1.07，而生米蕎的鐵離子還原能力最低。結(jié)合樣品清除DPPH自由基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，發(fā)酵米蕎是一種較好的天然抗氧化資源。

圖9 不同處理方式對米蕎還原能力的影響Fig.9 Effects of different treatments on the reducing power of rice buckwheat

2.9 相關(guān)性分析

經(jīng)不同處理的米蕎清除DPPH自由基能力和鐵離子還原能力的變化趨勢與其總黃酮和總酚變化趨勢相一致。因此，該文進(jìn)一步分析了不同處理方式米蕎對DPPH自由基的清除能力和鐵離子還原能力與總黃酮和總酚之間的相關(guān)性。由表2可知，米蕎的抗氧化能力（清除DPPH自由基能力和鐵離子還原能力）與總黃酮含量（r=0.984；r=0.934，P<0.01）及總酚含量（r=0.950；r=0.994，P<0.01）具有極顯著相關(guān)。說明米蕎中的總酚和總黃酮是主要的抗氧化物質(zhì)。

表2 抗氧化成分與抗氧化活性斯皮爾曼相關(guān)性Table 2 Spearman correlation of antioxidant ingredients with antioxidant activity

3 結(jié)論

該文研究了不同處理方式對米蕎的營養(yǎng)成分及抗氧化性的影響。結(jié)果表明，米蕎經(jīng)發(fā)芽、發(fā)酵、蒸制、蒸制后發(fā)酵處理后均能提高總酚、總黃酮含量以及抗氧化活性。由相關(guān)性分析可得，米蕎抗氧化活性與總黃酮、總酚含量顯著相關(guān)，說明總黃酮和總酚是米蕎主要的抗氧化物質(zhì)。經(jīng)發(fā)芽和乳酸菌發(fā)酵處理的生米蕎，蘆丁含量顯著增加，而槲皮素含量較低，均低于1 mg/g。而蒸制處理后米蕎的還原糖、蘆丁和γ-氨基丁酸含量均有所下降，說明蒸制處理會使部分營養(yǎng)物質(zhì)被破壞。

總體來看，在這四種處理方式中，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵處理的生米蕎最佳，其還原糖、總酚、總黃酮、γ-氨基丁酸和蘆丁均最高以及DPPH自由基清除活性和鐵離子還原能力最強(qiáng)。由此可得，發(fā)酵處理可以使米蕎中的營養(yǎng)物質(zhì)更好的釋放出來，可進(jìn)一步提高米蕎的營養(yǎng)價(jià)值和生物活性。乳酸菌中含有豐富的酶系，能將米蕎中的大分子物質(zhì)分解成易被人體吸收的小分子物質(zhì)；另外，乳酸菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物，從而使米蕎的營養(yǎng)成分更加均衡和豐富。本研究為米蕎的精加工提供了一定的參考，為后續(xù)開發(fā)具有保健功效的米蕎制品提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。