裸藻非水溶性和水溶性多糖的化學組成及抗氧化活性分析

文愉熙，黃曉舟 ，林曉思

（1.泉州師范學院海洋與食品學院，福建泉州 362000；2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州 350002；3.福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點實驗室，福建泉州 362000）

裸藻是體長約50 μm的微藻類生物，它可以邊進行光合作用邊運動[1]。裸藻含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、葉綠素、DHA、EPA等，共59種營養(yǎng)素，其營養(yǎng)價值超越其他所有藻類，完勝冬蟲夏草、靈芝等生物，它可以全面的補充人體所需的營養(yǎng)[2]。裸藻作為一種新食品原料，在日本已成為一種必需的營養(yǎng)添加劑，廣泛地應(yīng)用于健康食品、保健品和天然調(diào)味料中[3?4]。近年來，裸藻因其具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及其生物活性代謝物而被廣泛研究。

海藻中富含各種高分子多糖，這些多糖可分為非水溶性和水溶性兩類[5]。先前的研究發(fā)現(xiàn)，藻類中水溶性多糖的結(jié)構(gòu)新穎，活性多樣，如抗癌、抗凝血、抗氧化、抗腫瘤和增強免疫等[6]。并且由于來源和結(jié)構(gòu)（單糖組成、糖苷鍵和分子量等）的不同，藻類多糖的生物活性也有很大差異[7]。除裸藻外，其他藻類非水溶性多糖研究較少，裸藻副淀粉（非水溶性多糖）是裸藻體內(nèi)特有的儲存多糖，它是具有特定類型的β-1-3-葡聚糖，多項實驗發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)免疫治療痛風、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血糖和抗氧化等作用[8]。裸藻副淀粉具有顯著的細胞因子相關(guān)免疫增強和免疫刺激作用，可以作為一種安全有效的輔助調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)反應(yīng)的天然因子[8]。此外，當加入到飲食中時，它具有降低膽固醇的作用，并參與調(diào)節(jié)人類餐后血糖和胰島素的反應(yīng)[9]。由于具有抗氧化特性，裸藻副淀粉可抑制四氯化碳引起的小鼠肝損傷，并防止特應(yīng)性皮炎樣病變的發(fā)展[9]，它在健康和醫(yī)療方面具有巨大的生物技術(shù)潛力。但是目前對裸藻中多糖的研究多集中在非水溶性多糖（副淀粉）上，而對于裸藻水溶性多糖結(jié)構(gòu)和活性的研究鮮有報道。研究表明，裸藻水提物的總抗氧化能力遠超于裸藻、裸藻副淀粉和堿溶的裸藻副淀粉，裸藻的水提物具有強抗氧化性作用，但該作用是否與裸藻水溶性多糖有關(guān)尚未可知[10]。

本文以裸藻為研究對象，對其分離純化后的非水溶性和水溶性多糖組分的官能團、分子量、單糖組成等基本結(jié)構(gòu)進行研究，進而對其抗氧化活性比較分析，以期為進一步研究裸藻多糖構(gòu)效關(guān)系提供實驗基礎(chǔ)，同時也為裸藻多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裸藻（藻粉） 上海光語生物科技有限公司；DEAE-52纖維素、Sephadex G-100凝膠、透析袋北京索萊寶科技有限公司；中性蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS） 上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；不同分子量的葡萄糖標準品（純度>98%） Sigma公司；無水乙醇、丙酮、乙醚、濃硫酸、H2O2西隴科學股份有限公司；苯酚、水楊酸、硫酸亞鐵、氯化鈉等試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

Infinite M200 Pro酶標儀 瑞士帝肯公司；TU-1950紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；UGC-24M氮吹儀 力辰科技公司；Nicolet iS50傅里葉紅外光譜儀 Thermo Scientific；LC-10A高效液相色譜儀 Shimadzu公司；RI-10A示差檢測器 Shimadzu；ICS5000離子色譜儀

ThermoFisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 裸藻多糖的制備

1.2.1.1 裸藻非水溶性多糖的提取 參考鞠海軍[11]的方法，稱取100 g裸藻粉末，懸浮于2 L的SDS溶液（8.5 g/L）中，超聲輔助提取18.5 min（60 ℃，45 kHz，200 W），離心（4000 r/min，5 min）取沉淀，并往沉淀中加入3 L SDS溶液（1 g/L），置于95 ℃水浴1 h，離心棄上清，依次用水、丙酮、乙醚反復洗滌沉淀除去蛋白等雜質(zhì)，離心取沉淀后，冷凍干燥得裸藻非水溶性多糖EGP-1。

1.2.1.2 裸藻水溶性多糖的提取 參考葛智超等[12]的方法并稍加修改，稱取100 g裸藻藻粉，溶于4 L去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.5~7.9；超聲輔助提取2 h（60 ℃，45 kHz，200 W），離心（5000 r/min，10 min）取上清液；旋蒸濃縮后，加入4倍體積無水乙醇；隨后置于4 °C層析柜中，醇沉過夜；再離心（5000 r/min，10 min）取沉淀于50 ℃烘箱烘干（12 h），粉碎稱重；將粉碎物溶于去離子水，至完全溶解并調(diào)節(jié)pH至7.0~8.0后，加入11.2%粗多糖重量的中性蛋白酶（100 U/mg）50 ℃水浴1 h，100 ℃沸水煮10 min；離心（5000 r/min，10 min）取上清，濃縮；最后用8~14 kDa分子量（MW）透析袋處理濃縮液2 d；濃縮凍干得裸藻水溶性粗多糖EGP-2。

1.2.2 多糖和蛋白含量的測定 采用苯酚-硫酸法對各組分多糖含量進行測定[11]。取1 mL樣品（標準品），依次加入1 mL 5%苯酚和5 mL濃硫酸，于490 nm處測其吸光度。以D-無水葡萄糖標準溶液（0、10、20、50、80、100 mg/mL）建立標準曲線，回歸方程為y=0.006x+0.05413，R2=0.99，根據(jù)其計算樣品中多糖的含量。

采用考馬斯亮藍試劑盒對各組分中的蛋白含量進行測定。以牛血清蛋白（BSA）標準溶液建立標準曲線，回歸方程為y=0.0052x+0.0391，R2=0.99，根據(jù)其計算樣品中蛋白的含量。

1.2.3 裸藻水溶性多糖的分離純化

1.2.3.1 離子層析柱分離純化 采用DEAE-52纖維素柱對裸藻水溶性多糖進行分離純化[13]。將制備的裸藻水溶性粗多糖，過0.45 μm濾膜后上樣，以0、0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L的NaCl溶液為洗脫液。用苯酚-硫酸法測多糖含量，收集單一組分的多糖溶液，用1000 Da透析袋在DI水的條件下透析48 h除去NaCl，旋蒸濃縮后凍干。

1.2.3.2 凝膠層析柱分離純化 采用Sephadex G-100凝膠柱對DEAE-52過柱后得到的餾分進一步分離純化[14]。樣品以10 mg/mL的濃度，上樣2 mL，以DI水為洗脫液，苯酚-硫酸法對多糖含量測定，收集單一組分多糖溶液，濃縮凍干得多糖組分，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 純度鑒定 采用紫外-可見光吸收光譜掃描分析多糖組分純度[11]。將裸藻水溶性多糖和非水溶性多糖分別溶解于DI水和0.50 mol/L NaOH溶液中配制成0.5 mg/mL的多糖溶液，再分別以DI水和0.50 mol/L NaOH為空白對照，在200~400 nm波長范圍進行掃描。

1.2.5 結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.5.1 分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）進行測定[15]。精密稱取樣品和標準品（標準品的分子量為5000、11600、23800、48600、80900、148000、273000、409800、667800、3693000 Da），分別采用DMSO溶液/0.05 mol/L NaCl溶液配制成5 mg/mL溶液，12000 r/min離心10 min，上清液用有機微孔濾膜（0.22 μm）過濾，然后將樣品轉(zhuǎn)置于1.8 mL進樣小瓶中。

非水溶性多糖色譜方法：色譜柱：BRT806色譜柱（8 mm×300 mm）；流動相：DMSO溶液；流速：0.6 mL/min，柱溫：60 ℃；進樣量：50 μL；檢測器：示差檢測器RI-10A。

水溶性多糖色譜方法：色譜柱：BRT105-104-102串聯(lián)凝膠柱（8 mm×300 mm）；流動相：0.05 mol/L NaCl溶液；流速：0.6 mL/min，柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；檢測器：示差檢測器RI-10A。

1.2.5.2 紅外光譜 采集背景數(shù)據(jù)去除干擾后，在4000~650 cm?1區(qū)域掃描樣品，對主要峰（強度和波數(shù)）進行識別和分析[13]。

1.2.5.3 單糖組成 通過對比樣品與單糖標準品的出峰時間來確定組分的單糖組成[16]。精密稱量樣品10 mg，加入3 mol/L三氟乙酸10 mL，120 ℃水解3 h。準確吸取酸水解溶液轉(zhuǎn)移至管中氮吹吹干，加入5 mL水渦旋混勻，取100 μL加入900 μL DI水，離心（12000 r/min，5 min）取上清液，進離子色譜儀分析。

色譜柱：DionexCarbopacTMPA20 （3 mm×150 mm）；流動相：A：H2O，B：15 mmol/L NaOH，C：15 mmol/L NaOH &100 mmol/L NaOAC（3:20）；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；檢測器：電化學檢測器。

1.2.6 抗氧化活性分析

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力 參考栗曉慶等[17]的方法，測定樣品對DPPH自由基的清除能力。分別稱取EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1和VC溶于水或DMSO中配制成樣品溶液。量取樣品和DPPH-乙醇溶液（0.2 mmol/L）各100 μL，充分混勻靜置反應(yīng)30 min，于517 nm處測定其吸光度。同時對照組用無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，空白組用水或DMSO替代樣品溶液。按下列公式計算：

1.2.6.2 羥自由基清除能力 參考宋佳敏等[18]的方法，通過水楊酸法進行測定。按1.2.6.1方法制備EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1和VC的不同系列樣品溶液。取0.5 mL樣品溶液，依次加入FeSO4（6 mmol/L）和H2O2溶液（6 mmol/L）各0.5 mL，室溫反應(yīng)10 min，再加入6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液0.5 mL，搖勻，37 ℃反應(yīng)30 min后，于510 nm處測定吸光度，對照組用水代替H2O2溶液，空白組用水代替樣品。按下列公式計算清除率：

1.2.6.3 還原能力 參考董揚等[19]的方法，采用鐵氰化鉀法進行測定。按1.2.6.1方法制備EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1和VC的不同系列樣品溶液。取樣品溶液、1%鐵氰化鉀溶液和磷酸緩沖液（pH6.6）各1.0 mL，混勻后在50 ℃反應(yīng)20 min，加入10%三氯乙酸2.0 mL，3000 r/min離心10 min，取上清液和水各2.0 mL、0.3%三氯化鐵0.4 mL，50 ℃反應(yīng)10 min，測定700 nm波長處的吸光度。對照組以水代替三氯化鐵溶液。按下列公式計算還原力：

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗在相同條件下重復測定3次，結(jié)果都以均值±標準差的方式表示。采用SPSS 25和Origin 2019軟件進行作圖和數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 裸藻各組分多糖和蛋白的含量

通過苯酚-硫酸法測得裸藻粗多糖中非水溶性多糖和水溶性多糖含量分別為93.89±2.36%和69.62±0.60%。

通過考馬斯亮藍法測得從裸藻中提取得到的非水溶性多糖和水溶性多糖每100 μg中的蛋白含量分別為0.10 μg和5.62 μg。

2.2 水溶性多糖分離純化的結(jié)果

圖1為EGP-2在DEAE-52層析柱上的洗脫曲線圖。以0、0.1、0.3、0.5和0.7 mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，得到2個主要洗脫組分（EGP-2A和EGP-2B），其他組分的含量較低，很難進行后續(xù)的實驗。所以僅對DEAE-52柱層析分離得到的2個主要組分收集后進行透析并冷凍干燥備用，進一步采用Sephadex G-100繼續(xù)分離純化。EGP-2A和EGP-2B組分經(jīng)Sephadex G-100凝膠層析柱洗脫得到兩個主要的洗脫峰，如圖2所示，收集兩個主要組分，透析后將其命名為EGP-2A-1和EGP-2B-1。

圖1 裸藻水溶性粗多糖DEAE-52層析柱洗脫曲線Fig.1 The elution curve of DEAE-52 column of water-soluble crude polysaccharide of Euglena gracilis

圖2 裸藻EGP-2A和EGP-2B組分多糖的凝膠層析洗脫曲線Fig.2 Gel column elution curve EGP-2A and EGP-2B fraction polysaccharides of Euglena gracilis

2.3 多糖組分純度鑒定

紫外可見分光光度法可于260和280 nm處定性測量核酸及蛋白質(zhì)[20]。如圖3所示，糖及其復合物于200 nm處擁有非常強的吸收峰，樣品溶液符合多糖的紫外吸收特征，并且掃描結(jié)果顯示在260和280 nm處的核酸和蛋白質(zhì)吸收峰平坦，表明樣品中均不含或含極少量蛋白質(zhì)、核酸，具有較髙的純度。

圖3 裸藻EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1組分多糖的紫外光譜掃描圖Fig.3 Ultraviolet spectrum of EGP-1, EGP-2A-1 and EGP-2B-1 fraction polysaccharides of Euglena gracilis

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

2.4.1 分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法測定EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1的分子量。如圖4所示，三個組分的HPGPC圖譜為單一對稱峰，平均分子量分別為1.01×104、2.91×106和1.70×106Da。多糖來源和制備方法的不同會導致單糖組成和分子量的較大差異，從而影響其生物功能活性[7]。同一來源的多糖由于其分子量的不同，往往具有不同的功能活性，較高分子量的多糖具有更為復雜的結(jié)構(gòu)，其表現(xiàn)出的生物活性也更為廣泛，分子量過低，難以形成具有活性的聚合結(jié)構(gòu)[21]。因此，分子量較高的EGP-2A-1和EGP-2B-1可能在某些方面具有優(yōu)勢。

圖4 EGP-1（A）、EGP-2A-1（B）和EGP-2B-1（C）的HPGPC色譜圖Fig.4 HPGPC chromatograms of EGP-1（A）, EGP-2A-1（B）and EGP-2B-1（C）

2.4.2 紅外光譜 EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1的紅外譜圖如圖5所示。結(jié)果顯示，三種組分在3400和2930 cm?1附近具有O-H和C-H伸縮振動峰，符合糖類的一般結(jié)構(gòu)特征[22?23]；1650 cm?1附近的吸收峰反映了C=O的非對稱振動，可能存在糖醛酸[24]；1380 cm?1附近的吸收峰被認為是CH3?的對稱變角振動引起的伸縮帶[25]；1250 cm?1處是吡喃糖環(huán)上的C-O-H和C-O-C的C-O伸縮振動引起的吸收峰，在1000~1200 cm?1附近是吡喃糖環(huán)的C-O-C和CO-H的單鍵吸收峰[26]；890 cm?1處是β-D-吡喃葡萄糖特征峰[27]；834 cm?1附近的特征峰說明多糖含有α-吡喃糖苷鍵[28]；803 cm?1處的吸收峰可能是樣品含有吡喃甘露糖殘基[29]（表1）。以上結(jié)果表明，EGP-1是一種含有β-糖苷鍵和吡喃葡萄糖環(huán)的多糖，EGP-2A-1和EGP-2B-1是含有α-和β-糖苷鍵并具有吡喃糖環(huán)的多糖。

表1 裸藻多糖傅里葉紅外光譜數(shù)據(jù)Table 1 Fourier infrared spectroscopy data of Euglena gracilis polysaccharide

圖5 裸藻多糖的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum of Euglena gracilis polysaccharide

2.4.3 單糖組成 圖6為混合單糖標品與EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1的離子色譜圖。在三個樣品中，EGP-1中鑒定出葡萄糖、甘露糖、巖藻糖和鼠李糖四種主要單糖，其摩爾比為0.873:0.066:0.030:0.030，其中葡萄糖摩爾含量最高。在鞠海軍[11]的研究中，裸藻中分離出的非水溶性多糖的主要是β-葡聚糖，單糖主要為葡萄糖，與本文的結(jié)果一致。然而，與EGP-1相比，EGP-2A-1和EGP-2B-1組分含有至少9種單糖，并且二者的單糖組成類型相同，均為巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，只是摩爾比例略有差異，比分別為0.150:0.208:0.014:0.002:0.015:0.007:0.010:0.588:0.005 和 0.151:0.218:0.010:0.003:0.025:0.008:0.012:0.565:0.008。摩爾比值表明，兩種多糖的甘露糖含量最高，葡萄糖醛酸含量較低，并且兩種多糖均在其紅外光譜803 cm?1和1650 cm?1附近出現(xiàn)特征峰。葛智超等[12]從裸藻中分離出分子量為3~5 kDa的水溶性多糖組分中含量較高的單糖為半乳糖、巖藻糖、木糖，該結(jié)果與EGP-2A-1和EGP-2B-1的結(jié)果不同，造成這種差異的可能原因是提取的是不同分子量段的多糖，導致其結(jié)構(gòu)存在差異。

圖6 混標、EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1的離子色譜圖Fig.6 Ion chromatograms of mixed standard, EGP-1,EGP-2A-1 and EGP-2B-1

2.5 抗氧化活性分析

2.5.1 DPPH自由基清除能力 人類的多種疾病均與自由基有關(guān)，包括炎癥、癌癥、糖尿病等等。自由基屬于強氧化劑，一旦在人體內(nèi)蓄積過量，會加速細胞老化甚至凋亡[30]?？寡趸瘎┛上杂苫瑢θ梭w正常的新陳代謝有重要意義。

根據(jù)作用方式的不同，抗氧化劑主要分為兩大類：初級（鏈斷裂）抗氧化劑和次級（預防性）抗氧化劑[31]。初級抗氧化劑通常充當自由基的受體，抑制起始步驟或干擾自氧化的傳播步驟，能夠?qū)湓泳栀浗o自由基[32]。次級抗氧化劑能夠通過多種不同機制減緩氧化反應(yīng)的速率[33]。例如，次級抗氧化劑可以提供H原子給初級抗氧化劑，用作氧清除劑或?qū)溥^氧化物轉(zhuǎn)換為非自由基物質(zhì)[34]。

DPPH法是檢測抗氧化能力的常用標準方法，DPPH自由基能夠接受來自抗氧化劑的H原子形成穩(wěn)定的分子，導致溶液顏色變淺。如圖7所示，各樣品均對DPPH·具有一定的清除活性，當多糖濃度從0.1增加到10.0 mg/mL時，3種多糖對DPPH自由基清除能力隨樣品濃度的升高而增大。IC50是指清除率為50%時物質(zhì)的質(zhì)量濃度，物質(zhì)IC50值越小，表明其抗氧化性越好[35]。裸藻EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1的IC50值分別為11.954、5.397和9.458 mg/mL，說明3種樣品的初級抗氧化能力較強。因此，還需對裸藻多糖樣品的次級抗氧化活性進行研究，以確定它們的總抗氧化能力。

圖7 DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH free radical scavenging ability

2.5.2 羥基自由基清除能力 用水楊酸法測定裸藻多糖樣品的次級抗氧化能力。3種多糖和VC對羥基自由基的清除能力如圖8所示，其自由基清除率和樣品濃度成線性依賴關(guān)系，存在明顯的劑量效應(yīng)。且在相同濃度下，樣品的清除能力強弱依次為EGP-2A-1>EGP-2B-1>EGP-1，但其清除能力與VC相比還有一定的差距，經(jīng)計算得EGP-1、EGP-2A-1、EGP-2B-1和VC的IC50值分別為13.264、4.327、9.142和0.539 mg/mL。先前的文獻報道，羊棲菜多糖在濃度為9.85 mg/mL時，其羥自由基清除能力接近50%[36]，紫菜、羅漢果和山藥多糖在濃度為2 mg/mL時，清除率均低于20%[37]。相比之下，EGP-2A-1具有較好的次級抗氧化活性。

圖8 羥基自由基清除能力Fig.8 OH radical scavenging ability

2.5.3 還原能力 吸光度值表示物質(zhì)的還原能力，物質(zhì)的還原力越高，表明其抗氧化性越好[19]。如圖9所示，裸藻多糖的還原能力隨著樣品濃度的增加而增強，在濃度為1~2 mg/mL時，EGP-2A-1和EGP-2B-1組分的還原能力低于EGP-1，而在4~10 mg/mL范圍內(nèi)，EGP-2A-1和EGP-2B-1的還原能力逐漸高于EGP-1，差距不斷拉大。當濃度達到10 mg/mL時，EGP-2A-1和EGP-2B-1的吸光度分別為0.23和0.18。雖然陽性對照VC的還原能力遠高于3種組分多糖，但本實驗仍能證明裸藻多糖具有一定的還原能力，還原能力大小依次為：EGP-2A-1>EGP-2B-1>EGP-1。

圖9 還原能力Fig.9 Reduction ability

2.5.4 總體抗氧化能力分析 EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1組分在質(zhì)量濃度10 mg/mL時的抗氧化能力可以通過在雷達圖上面積的比較進行分析。如圖10所示，EGP-2A-1的面積最大，說明該組分多糖的抗氧化能力最強。三種組分的抗氧化活性大小為：EGP-2A-1>EGP-2B-1>EGP-1。

圖10 裸藻多糖的抗氧化能力雷達圖Fig.10 Radar chart of the antioxidant capacity of Euglena gracilis polysaccharides

有研究表明，分子量也是影響多糖抗氧化性的一方面因素，高分子量多糖的空間結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，這有利于維持生物活性，但也有研究表明低分子量多糖由于松散的構(gòu)象，更容易被吸收，具有更好的活性[38]。在本研究中，分子量的大小為：EGP-2A-1>EGP-2B-1>EGP-1，可見分子量的大小對于裸藻多糖的抗氧化活性具有一定影響，在三種多糖組分中，分子量越大抗氧化活性越好。

Luo和Wang等[39?40]研究了石斛多糖單糖組成與抗氧化活性之間的關(guān)系，結(jié)果表明石斛多糖是否具有抗氧化活性受葡萄糖的影響，但是其活性大小受甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖的影響。艾于杰[38]對茶多糖和抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖和甘露糖含量與抗氧化活性正相關(guān)，而隨著葡萄糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖含量的增加，DPPH自由基清除能力降低。黃依佳等[41]對比了兩種藍藻多糖的羥基自由基清除能力及其單糖組成之間存在的差異，研究發(fā)現(xiàn)以甘露糖為主要單糖的CB-2-1比以葡萄糖為主要組分的CCB活性更好。

本研究純化的三個組分中均含有葡萄糖，實驗證明都具有抗氧化活性，與劉袆帆等的結(jié)果一致[42]。但是EGP-1的抗氧化活性最低，可能是由于EGP-1中葡萄糖含量為87.3%，成分較單一，并且甘露糖和鼠李糖只含有6.6%和3.0%，從而導致其活性不高。組分EGP-2A-1和EGP-2B-1均表現(xiàn)較好的清除DPPH活性，其中甘露糖和鼠李糖為主要單糖，并且EGP-2A-1組分中半乳糖和葡萄糖醛酸的含量低于EGP-2B-1，但是在EGP-2A-1中阿拉伯糖的含量更高，經(jīng)過各種單糖的協(xié)同作用最后表現(xiàn)出裸藻多糖的DPPH清除能力為EGP-2A-1高于EGP-2B-1，存在極顯著差異（P<0.01）。EGP-2A-1的羥基自由基清除能力遠高于EGP-2B-1，具有極顯著差異（P<0.01），根據(jù)兩者的單糖組成分析，可能有甘露糖含量的影響，但是因兩者單糖組成相似，并且多糖的活性還與糖苷鍵、空間構(gòu)象等有密切關(guān)系，其更深入的原因需要進一步的研究。

3 結(jié)論

本研究中，首次對裸藻水溶性多糖和非水溶性多糖的主要組分的結(jié)構(gòu)進行研究分析，并對其抗氧化能力進行比較分析。通過不同方法對裸藻中水溶性多糖和非水溶性多糖進行提取，并進一步分離純化后得到3個主要組分多糖EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1。結(jié)合紫外可見光、紅外光譜、凝膠色譜、離子色譜等多種技術(shù)對3個組分多糖進行分析。紫外光譜表明3種樣品均不含或含少量蛋白和核酸，純度較高；紅外光譜結(jié)果表明3個組分多糖均存在糖的羰基、羥基、吡喃環(huán)等多糖常見官能團和結(jié)構(gòu)，其中EGP-1含有β-糖苷鍵，EGP-2A-1和EGP-2B-1中均含有α-和β-糖苷鍵。通過滲透色譜測定EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1的相對分子質(zhì)量分別為1.01×104、2.91×106和1.70×106Da。離子色譜分析表明EGP-1中鑒定出葡萄糖、甘露糖、巖藻糖和鼠李糖四種主要單糖，EGP-2A-1和EGP-2B-1組分均由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸組成。通過體外抗氧化研究發(fā)現(xiàn)，裸藻多糖對DPPH和OH自由基均具有清除作用，且均具有一定的還原能力。各組分活性存在差異，在相同質(zhì)量濃度下，抗氧化活性VC>EGP-2A-1>EGP-2B-1>EGP-1。綜上所述，裸藻多糖具有抗氧化能力，且其水溶性多糖的抗氧化能力強于非水溶性多糖，推測這可能是由于單糖組成和分子量的不同造成的，這種差異還可能與多糖的糖苷鍵類型、三螺旋結(jié)構(gòu)等因素有關(guān)，因此后續(xù)還需進一步通過實驗來深入探究裸藻多糖結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性之間的關(guān)系。