miR-652對非小細胞肺癌H460細胞凋亡和遷移的影響

王建宇 馬文俊 王 瑩

在全球范圍內(nèi)，肺癌在過去幾十年中一直是最常見的癌癥之一。2018年，肺癌新診斷有210萬例，占全球癌癥總量的12%[1]。肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因之一。在過去10年中，腫瘤的治療經(jīng)歷了巨大的變化，靶向治療的發(fā)展，開創(chuàng)了個性化醫(yī)學(xué)和免疫治療的時代。這些治療方法的發(fā)展為腫瘤患者的長期生存奠定了一定的基礎(chǔ)，提高了對腫瘤轉(zhuǎn)移患者進行有效治療的可能性。過去10年中，除了遺傳研究之外，表觀基因組研究特別是對miRNA的研究在數(shù)量和質(zhì)量上都迅速增長。

miRNAs是一種長度19～25 nt的小非編碼RNA，可以調(diào)控多種靶基因。miRNAs參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，如細胞周期、分化、增殖、凋亡、耐受性、能量代謝和免疫應(yīng)答等[2]。對于miRNA的非調(diào)控表達在包括癌癥在內(nèi)的大多數(shù)人類疾病的發(fā)病機制中已經(jīng)得到了很好的研究[3-4]。miRNA的異常表達通常是由于遺傳修飾導(dǎo)致的，它們既可能是腫瘤抑制因子，也可能是癌基因，這對人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要[4]。研究證實了miRNAs潛在的致癌潛力，如調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞周期、分化、發(fā)育、遷移、血管生成和凋亡[5-6]。miR-652最近被鑒定為腫瘤相關(guān)基因。本研究就miR-652對非小細胞肺癌H460細胞凋亡和遷移的影響進行分析?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系與細胞培養(yǎng) 肺癌細胞株H460在RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，人支氣管上皮細胞（HBE）在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 主要儀器 ECLIPSE TE2000-S倒置顯微鏡、SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀、GE AI600多功能成像儀。

1.2 方法

將H460肺癌細胞隨機分為對照組、miR-652組、miR-652+AMO-652組和亂序組。

1.2.1 細胞計數(shù) 在轉(zhuǎn)染miR-652的前1 d，將細胞接種到6孔板上（每孔5×104個細胞）。用X-tremeGENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑將miR-652轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，用臺盼藍染色，用細胞計數(shù)儀計數(shù)細胞數(shù)。1）用qRT-PCR技術(shù)分別檢測了H460細胞與HBE細胞中的miR-652表達水平。2）應(yīng)用細胞記數(shù)儀分別計數(shù)對照組、亂序組、不同濃度miR-652處理過的H460細胞數(shù)量，miR-652的濃度分別為10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L。3）以0、24、48、72、96 h時間點分別計數(shù)對照組、亂序組、50 nmol/L miR-652處理過的H460細胞數(shù)量。

1.2.2 細胞遷移試驗 細胞劃痕實驗評估細胞遷移。在轉(zhuǎn)染24 h后，在融合細胞單層上用200 μl吸管尖端進行劃痕。為了觀察H460細胞傷口愈合情況，分別在處理后0、24、48和72 h拍攝圖像。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測蛋白表達 用X-treme-GENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-652（50 nmol/L）、miR-652+AMO-652、亂序轉(zhuǎn)染H460細胞。H460細胞于轉(zhuǎn)染前1 d接種于6孔板（5×104個/孔）。轉(zhuǎn)染后，提取總蛋白進行蛋白質(zhì)免疫印跡法分析。約70 μg天然蛋白在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠中變性和電泳。電泳后，用電泳印跡法將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在含5%脫脂牛奶的PBS中室溫封閉2 h。免疫印跡分別與一抗（Bax或caspase-9）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）共同孵育，4 ℃孵育過夜。膜用磷酸鹽緩沖液（PBS-T）洗滌，然后用二抗Alexa Fluor在室溫下孵育1 h。最后，用GE AI600多功能成像儀收集蛋白質(zhì)免疫印跡條帶，以GAPDH為內(nèi)參，用Odyssey v1.2軟件測量各組的強度（面積×OD）。將數(shù)據(jù)進行歸一化處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較使用t檢驗，多組實驗結(jié)果比較使用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-652對H460細胞計數(shù)的影響

H460細胞中miR-652表達明顯低于HBE細胞中miR-652表達（P＜0.05）（圖1A）。對照組與亂序組、10 nmol/L miR-652組、25 nmol/L miR-652組的H460細胞數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而當(dāng)miR-652的濃度分別為50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L時與對照組比較H460細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；隨著miR-652的濃度增加，H460細胞數(shù)量逐漸減少（P＜0.05），在miR-652的濃度達到50 nmol/L及以上時，H460細胞數(shù)量減少明顯（P＜0.05）（圖1B）。miR-652組與對照組、亂序組的H460細胞數(shù)量不同時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），尤其是72 h后差異明顯（P＜0.05），miR-652轉(zhuǎn)染的H460細胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05）（圖1C）。

圖1 miR-652對H460細胞數(shù)量的影響

2.2 miR-652對H460細胞遷移的影響

與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-652的H460細胞的遷移速度下降；AMO-652的共轉(zhuǎn)染則取消了miR-652對H460細胞的這種作用；而亂序組對H460細胞的遷移速度無影響。見圖2、表1。

表1 各組H460細胞遷移率比較(%,±s)

表1 各組H460細胞遷移率比較(%,±s)

注：H460細胞各分組遷移率統(tǒng)計；與對照組比較，aP＜0.05；與miR-652+AMO-652組比較，bP＜0.05

組別 細胞遷移對照組 1 miR-652組 0.47±0.03ab miR-652+AMO-652組 0.82±0.05亂序組 1.02±0.06

圖2 miR-652對H460細胞遷移的影響

2.3 miR-652對H460細胞中Bax和caspase-9蛋白表達的影響

與對照組比較，miR-652組凋亡蛋白Bax和caspase-9的表達明顯增加，而與miR-652組比較，AMO-652的共轉(zhuǎn)染miR-652+AMO-652組凋亡蛋白Bax和caspase-9的表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組H460細胞凋亡蛋白Bax和caspase-9表達比較(±s,n=5)

表2 各組H460細胞凋亡蛋白Bax和caspase-9表達比較(±s,n=5)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與miR-652組比較，bP＜0.05

組別 凋亡蛋白Bax 凋亡蛋白caspase-9對照組 1 1 miR-652組 18.88±1.24a 18.64±1.12a miR-652+AMO-652組 5.22±0.36b 5.43±0.32b亂序組 0.92±0.06 6.84±0.46

3 討論

miR-652已經(jīng)在幾個組織中得以確認，并被證明發(fā)揮著重要的功能。越來越多的證據(jù)表明miR-652是一個參與多種生物學(xué)過程的多功能分子，例如miR-652通過抑制CD4+T細胞的分化來減輕肝纖維化[7]；參與了許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病，包括缺血性中風(fēng)，是這些疾病的重要生物標(biāo)志物[8]；miR-652-3p在骨肉瘤、直腸癌和乳腺癌中上調(diào)，但在惡性胸膜間皮瘤中下調(diào)[9]；miR-652可以作為區(qū)分惡性胸膜間皮瘤和反應(yīng)性間皮細胞增殖的合適生物標(biāo)志物[10]；miR-652是一個主要在骨髓調(diào)節(jié)中起作用的因子[11]，可能參與了免疫細胞炎癥信號的介導(dǎo)作用；miR-652可以通過靶向E盒結(jié)合鋅指蛋白1（ZEB1）來抑制胰腺癌細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。

我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-652在NSCLC中表達下降，并且促進NSCLC細胞凋亡。本實驗通過對以濃度變化和以不同時間的細胞計數(shù)觀察，發(fā)現(xiàn)miR-652的過表達對H460細胞增殖有抑制作用，且呈劑量依賴性和時間依賴性。我們還通過細胞劃痕實驗評價miR-652對H460細胞遷移的影響，發(fā)現(xiàn)miR-652能夠抑制H460細胞的遷移。而AMO-652的共轉(zhuǎn)染則取消了miR-652對細胞遷移的抑制作用。

Bcl-2家族蛋白分別具有抗凋亡作用（Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w、Mcl-1和A1/BFL-1）或促凋亡作用（Bax、Bak和Bok/MTD）。Bax基因位于19號染色體上，是Bcl-2基因家族中一個促進凋亡的成員。Bax在被激活后會引起細胞膜去極化、線粒體外膜通透性增加、線粒體孔開放和細胞色素C等線粒體內(nèi)容物的漏出、線粒體腫脹和破裂，從而誘導(dǎo)下游細胞效應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡。caspase-9是caspases家族中的一員，是細胞凋亡信號的主要執(zhí)行者。caspase-9一旦被激活，就能切割效應(yīng)子caspase-3，從而誘導(dǎo)細胞凋亡相關(guān)的形態(tài)學(xué)和功能改變。越來越多的證據(jù)顯示caspase-9參與了細胞自噬的調(diào)控，是細胞凋亡和自噬之間平衡的重要決定因素[13]。

在癌癥的化療、放療和免疫治療期間，惡性腫瘤細胞可以通過激活細胞凋亡這一途徑而被破壞。Bax和caspase-9參與了腫瘤細胞的凋亡過程。誘導(dǎo)癌細胞凋亡的機制包括外在途徑和內(nèi)在途徑。在細胞凋亡的外在途徑中，細胞表面的細胞受體接收到的信號激活了caspase-8。在細胞凋亡的內(nèi)在途徑中，Bax被激活、表達增加，進而激活下游caspases。通過一系列caspases的級聯(lián)激活，caspase-2、caspase-3和caspase-9被激活。caspase2、3、9共同實現(xiàn)死亡信號的級聯(lián)放大，促進細胞凋亡。在實驗中我們進一步做了肺癌細胞凋亡蛋白的表達，檢測了miR-652對H460細胞中Bax和caspase-9蛋白表達的影響。我們發(fā)現(xiàn)miR-652的過表達促進了凋亡蛋白Bax和caspase-9的表達，而AMO-652的共轉(zhuǎn)染則取消了miR-652對凋亡蛋白表達的促進作用。由此可見，miR-652促進了凋亡蛋白的表達，并且至少是部分通過Bax和caspase-9起到抑癌作用。

以上這些數(shù)據(jù)表明miR-652的過表達可以抑制H460細胞生長和遷移，促進細胞凋亡，提示miR-652在H460細胞中起抑癌基因作用。以miR-652作為治療非小細胞肺癌H460的潛在靶點還需要進一步的體內(nèi)實驗研究。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明miR-652在非小細胞肺癌H460組織中下調(diào)，miR-652在非小細胞肺癌H460細胞中具有抑癌作用。miR-652可能是非小細胞肺癌H460診斷、治療的新靶點。