氣相色譜法測定乳及其制品中肌醇含量的方法優(yōu)化

黃 中，梁依依

百躍羊乳（南寧）有限公司，廣西南寧530105

0 引言

肌醇，別名肌糖、環(huán)己六醇、纖維醇，化學(xué)式（CHOH）6，廣泛分布在動植物體內(nèi)，是動植物和微生物的生長因子[1]；可由玉米浸泡液中提取，具有類似維生素B1和生物素的作用，可使脂肪很快轉(zhuǎn)化為熱能而被消耗，有效預(yù)防在人體內(nèi)特別是心血管內(nèi)的沉積[2]?！禛B 14880—1994 食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》實(shí)施后，肌醇常作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，加入保健食品、嬰幼兒配方乳粉和兒童調(diào)制乳粉中?！禛B 14880—2012 食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中調(diào)制乳粉肌醇添加要求為210~250 mg/kg，《GB 10765—2021 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》《GB 10766—2021 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)較大嬰兒配方食品》《GB 10767—2021 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)幼兒配方食品》中肌醇限量為1.0~9.6 mg/100 kJ。目前，檢測食品中肌醇含量的國標(biāo)法有氣相色譜法、微生物法、化學(xué)法。除國標(biāo)法外，部分學(xué)者還開發(fā)了液相色譜法[3]、氣質(zhì)聯(lián)用法[4]、液質(zhì)聯(lián)用法[5，6]、離子色譜法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]。其中氣相色譜法是利用硅烷化試劑與肌醇衍生反應(yīng)，使肌醇的6 個羥基均被硅烷化試劑衍生成六（三甲硅氧基）環(huán)己烷，其具有揮發(fā)性，以利于用氣相色譜進(jìn)行定量分析[9]。而國標(biāo)法-氣相色譜法測定食品中肌醇含量的方法存在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、離心等操作步驟繁瑣，結(jié)果穩(wěn)定性不高，檢測時間長的不足。試驗(yàn)擬在《GB 5009.270—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中肌醇的測定》第二法氣相色譜法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，通過優(yōu)化前處理步驟和儀器色譜條件，縮減前處理時間和色譜分析時間，使檢測方法更方便、更快速、更精準(zhǔn)、更節(jié)約。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

肌醇標(biāo)準(zhǔn)品，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；正己烷，色譜純，西隴科技股份有限公司，無水乙醇，色譜純，西隴科技股份有限公司；三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；N，N-二甲基甲酰胺，分析純，西隴科技股份有限公司；0.22 μm微孔濾膜；25 mL帶金屬螺紋蓋的頂空瓶，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.1.2 儀器

超聲波清洗機(jī)：KQ700DE，昆山舒美超聲儀器有限公司；離心機(jī)：TG16-WS，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；氣相色譜儀：7890A，安捷倫科技（中國）有限公司；電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 樣品前處理

1.2.1 溶解

稱取1 g樣品于25 mL容量瓶中，加入7.5 mL 40 ℃溫水溶解，超聲20 min。

1.2.2 沉淀

將溶解好后的樣液，用無水乙醇定容，靜置20 min，轉(zhuǎn)移至50 mL的離心管，以不低于4 000 r/min離心5 min。

1.2.3 衍生與提取

吸取上清夜2.5 mL于頂空瓶中，放至于鼓風(fēng)干燥箱中（103±2）℃烘干2 h。待冷卻后，加入10 mL按8:2:1混合后的N-N二甲基甲酰胺、六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷，擰緊蓋子超聲5 min后置于（80±5）℃水浴鍋中水浴75 min。每隔20 min取出上下震搖，衍生后加入5 mL正己烷，反復(fù)振蕩提取3 min，靜置分層。在帶有0.22 μm微孔濾膜的注射器中加入少量無水硫酸鈉，吸取上層清液加入注射器中。棄除1~2 mL濾液后獲取待測液。

1.3 肌醇標(biāo)準(zhǔn)測定液的制備

稱取（105±1）℃烘干2 h的肌醇標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，加水溶解定容至100 mL。吸取10 mL 1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液移至100 mL的容量瓶中，加入20 mL的水，混勻后加無水乙醇定容。分別吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL的0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液至頂空瓶中，放至于鼓風(fēng)干燥箱中（103±2）℃烘2 h，其余步驟同1.2.3。

1.4 儀器條件

色譜柱：安捷倫HP-5（填料（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷，柱長30 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；檢測器溫度：300 ℃；色譜柱流量：3 mL/min；

分流比：10:1；進(jìn)樣量：1 μL；程序升溫條件：初始120 ℃，以10 ℃/min升至190 ℃，保持8 min；再以40 ℃/min升至240 ℃，保持5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

對比國標(biāo)法的制備，本方法將中間液的濃度提高了10 倍，以減少加入頂空瓶中標(biāo)準(zhǔn)工作液的量，加快干燥的時間。將肌醇含量0.02 mg、0.04 mg、0.08 mg、0.10 mg、0.12 mg作為橫坐標(biāo)，檢測的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制出肌醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得線性關(guān)系y=511.81x+0.2074，其相關(guān)系數(shù)0.9996，表明在0.02~0.12 mg范圍內(nèi)具有良好的線性，滿足對肌醇的定量分析檢測（圖1）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 前處理優(yōu)化對肌醇測定的影響

對比國標(biāo)法的前處理，直接干燥代替旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，樣品定容體積和吸取上清液的體積減少1/2。在控制干燥時間的同時，也為了在大批量的試驗(yàn)中控制乙醇在鼓風(fēng)干燥箱的揮發(fā)量，確保試驗(yàn)的安全性。帶有無水硫酸鈉的注射器過濾除水方式代替帶有無水硫酸鈉的離心管，減去離心管離心除水的步驟，對用優(yōu)化后的前處理與國標(biāo)前處理分別進(jìn)行分析，分別對3 個樣品用國標(biāo)法與本方法進(jìn)行測試。結(jié)果如表1所示，相對偏差分別為4.5%、1.5%、1.2%。前處理改變后減少了試劑用量，提高了檢測效率，同時保證了結(jié)果與國標(biāo)法的一致性。

表1 國標(biāo)法與本方法的肌醇測定對比結(jié)果

2.3 色譜條件對肌醇測定的影響

國標(biāo)法程序升溫單次運(yùn)行63 min，本試驗(yàn)使用HP-5的氣相色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化了升溫程序，該法具有良好的重線性及分離度。如圖2所示，單次進(jìn)樣僅21.25 min，減少了樣品檢測的分析時間。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)液與樣品液色譜圖

2.4 兩種不同的處理方式對肌醇測定的影響

為了探討樣品在不去除蛋白質(zhì)的情況下直接進(jìn)行干燥衍生對肌醇測定的影響。稱取1 g樣品按1.2-1.4的方法處理進(jìn)行3 個平行測試，另稱取0.2 g于頂空瓶中，放置于鼓風(fēng)干燥箱中（103±2）℃烘2 h，衍生提取測定同1.2-1.4步驟。結(jié)果如表2所示，未經(jīng)沉淀蛋白處理的結(jié)果平均值與沉淀處理的相對偏差為2.34，但未經(jīng)沉淀處理的結(jié)果穩(wěn)定性不高，RSD值為8.05%。該處理方式對樣品的均勻性、稱樣準(zhǔn)確度、人員操作有比較大的要求。

表2 試驗(yàn)經(jīng)沉淀蛋白處理與未經(jīng)沉淀蛋白的結(jié)果對比

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 精密度測試

分別對2 個不同含量的樣品按1.2-1.4方法處理的6 個平行樣進(jìn)行測試，結(jié)果如表3顯示，2 個不同樣品進(jìn)行6 平行測試后，變異系數(shù)分別為2.47、0.43，均小于3.8。符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測的要求。

表3 樣品精密度測試的分析結(jié)果

2.5.2 加標(biāo)回收率的測試

對已知的樣品稱取1 g，分別加入0.2 mL、0.5 mL、1 mL濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，按1.2-1.4方法處理，每個梯度進(jìn)行3 個水平測試。結(jié)果如表4所示，加標(biāo)回收率分別為100.3%、97.8%、95.1%，均在95%~105%范圍內(nèi)。符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測的要求。9 個樣品的加標(biāo)回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.55%，說明本方法具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性。

表4 加標(biāo)回收率的分析結(jié)果

3 結(jié)論

與國標(biāo)對比，對樣品的溶解、標(biāo)品配制、干燥衍生、色譜條件進(jìn)行了改變，試樣液經(jīng)過氣相色譜分析。結(jié)果顯示，0~ 0.12 mg含量范圍，相關(guān)線性R=0.9996，線性良好。樣品的三梯度加標(biāo)回收率分別為100.3%、97.8%、95.1%，RSD為2.55%。色譜條件優(yōu)化后進(jìn)樣測試時間由63 min縮短至21.5 min。前處理方法縮減了旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、離心脫水的步驟，很大程度上縮短檢驗(yàn)時間、減少乙醇試劑用量、降低檢驗(yàn)成本及前處理過程對檢驗(yàn)員的危害。有利于大批量的試樣處理，同時保證檢驗(yàn)的精密度、準(zhǔn)確度不受影響。