山羊DGAT1基因的克隆及對(duì)前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積的調(diào)控作用研究

楊昌恒，李 琪，黃 維，林亞秋，王 永，向 華*，朱江江*

(1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041； 2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部/四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610041)

山羊肉是一種高營(yíng)養(yǎng)肉類，具有高蛋白質(zhì)、低膽固醇等特點(diǎn)，然而目前山羊肉的品質(zhì)限制了其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。動(dòng)物肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat, IMF)含量是影響肉質(zhì)風(fēng)味、嫩度的重要因素之一，適當(dāng)提高IMF可改善肉質(zhì)和口感[1-3]。甘油三酯(triacylglyce-rol, TAG)含量與IMF密切相關(guān)，脂質(zhì)的沉積主要受到甘油三酯的合成和分解代謝兩個(gè)方面的影響。一方面，甘油三酯的合成是從3磷酸甘油的sn-1位點(diǎn)優(yōu)先被酯化開始的，這一過(guò)程可由線粒體3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶 (glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAM)催化[4]。之后，磷酸甘油酰基轉(zhuǎn)移酶6 (1-acylglycerol-3-phosphate-O-acyltransferases, AGPAT6) 催化sn-2位點(diǎn)的酯化[5]，最后，二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶1(acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase 1, DGAT1)催化TAG合成最后一步反應(yīng)。新合成的甘油三酯被存儲(chǔ)在脂滴中，而47 ku尾部相互作用蛋白(tail-interacting protein 47, TIP47)和脂肪分化相關(guān)蛋白(adipose differentiation-related protein, ADRP)則是胞內(nèi)脂滴形成的關(guān)鍵調(diào)控蛋白[6]。另一方面，甘油三酯的分解代謝則主要在甘油三酯水解酶 (adipose triglyceride lipase, ATGL)和激素敏感脂酶 (hormone-sensitive lipase, HSL)的催化作用下實(shí)現(xiàn)的[7-8]，分別催化了甘油三酯和甘油二酯(diacylglycerol, DAG)的水解，最終導(dǎo)致甘油一酯和游離脂肪酸的釋放[9]。

DGATs作為機(jī)體甘油三酯合成的關(guān)鍵酶，可催化甘油二酯和脂肪酸最終形成甘油三酯，其最早是在雞肝中被發(fā)現(xiàn)的[10]，分為DGAT1和DGAT2兩種類型。Cases等[11]在1998年首次從小鼠中克隆得到DGAT1基因，并陸續(xù)在人[12]、牛[13]、豬[14]等物種中發(fā)現(xiàn)。DGAT1在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)廣泛，在乳腺、皮膚、小腸、睪丸和脂肪組織中表達(dá)量較高[11]，且在組織中的表達(dá)量與TAG的代謝作用相關(guān)[15]。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)，在FVB小鼠脂肪組織中過(guò)表達(dá)人DGAT1基因后，脂肪組織中的TAG合成量顯著增加。Yu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，敲除DGAT1可抑制飲食引起的小鼠血漿三酰甘油升高，并抑制高脂飲食后脂質(zhì)的吸收[18]。過(guò)表達(dá)DGAT1可增加肝極低密度脂蛋白(VLDL)微粒的分泌和促進(jìn)大脂滴的形成[19]，并增加甘油三酯的沉積[20]，同時(shí)促進(jìn)DAG攝取和骨骼肌IMF的沉積[21-22]。而DGAT1活性缺失則會(huì)抑制小鼠心臟甘油三酯的合成和代謝途徑[23]。在反芻動(dòng)物中，干擾DGAT1的表達(dá)可顯著降低牛乳腺上皮細(xì)胞中的甘油三酯含量[24]。其中，DGAT1基因K232A突變中K等位基因能提高牛奶產(chǎn)量和乳脂率[25-26]。Sun等[27]發(fā)現(xiàn)，丙酸和丁酸鹽處理山羊乳腺上皮細(xì)胞均可上調(diào)DGAT1的表達(dá)，并促使山羊乳脂中三酰甘油和脂滴合成量的增加?？梢?jiàn)，DGAT1對(duì)機(jī)體甘油三酯合成和代謝起到關(guān)鍵作用，深入研究DGAT1的功能對(duì)進(jìn)一步揭示機(jī)體脂質(zhì)代謝調(diào)控的分子機(jī)制具有重要意義。然而，關(guān)于DGAT1在調(diào)控山羊肌內(nèi)脂肪沉積中的作用及其分子機(jī)制還不清楚，而基因序列的缺失嚴(yán)重影響了對(duì)其功能的進(jìn)一步研究。

本研究以我國(guó)第二個(gè)肉用山羊培育品種—簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)檠芯繉?duì)象，克隆DGAT1基因序列，探討其在 不同組織中的表達(dá)水平，利用生物信息學(xué)等方法預(yù)測(cè)其功能，并進(jìn)一步在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中初步驗(yàn)證其功能。這些結(jié)果將為進(jìn)一步揭示DGAT1在調(diào)控山羊IMF形成中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年在西南民族大學(xué)青藏高原研究院完成。從四川省簡(jiǎn)陽(yáng)市大哥大牧業(yè)有限公司隨機(jī)選取7只健康的10月齡簡(jiǎn)州大耳公羊，在實(shí)驗(yàn)室清晨空腹屠宰，經(jīng)DEPC處理水洗凈后，立即采集心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌、臂三頭肌、大腸、小腸組織樣本，洗凈分裝后凍存至液氮罐中。

主要試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol試劑、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ與BamH Ⅰ購(gòu)自大連TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、通用型DNA純化回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；2×5 Super PCR Mix、pClone007載體購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；組織細(xì)胞甘油三酯酶法測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因有限公司；I型膠原酶購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山羊DGAT1基因克隆與生物信息學(xué)分析 使用RNA提取試劑盒提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書獲得cDNA，選擇GenBank中已公布的山羊DGAT1預(yù)測(cè)基因(XM_018058728.1)作為參考序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)DGAT1基因特異性PCR引物(表1)，采用Touchdown PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，25 μL的擴(kuò)增體系如下：ddH2O 9.5 μL，模板cDNA 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×5 Super PCR Mix 12.5 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，每個(gè)循環(huán)減1 ℃，15個(gè)循環(huán)；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，20個(gè) 循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用膠回收試劑盒回收目的片段，構(gòu)建pClone007載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落PCR鑒定(條件同基因克隆PCR)，送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

獲得目的基因序列后，使用NCBI中Blastn程序?qū)Σ煌锓N的DGAT1基因序列進(jìn)行比對(duì)；使用ExPASy Proteomics Server在線軟件對(duì)DGAT1的氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)和疏水性(http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；使用Tmpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)；使用EBI 在線軟件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；使用phyre2 (http//: www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2) 在線軟件對(duì)山羊DGAT1蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；使用MEGA5.0軟件對(duì)DGAT1基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 pcDNA3.1-DGAT1表達(dá)載體構(gòu)建 克隆完成后設(shè)計(jì)亞克隆引物，上、下游引物分別加入Hind Ⅲ和BamH Ⅰ兩個(gè)酶切位點(diǎn)(表1下劃線部分)，同時(shí)上游引物加入Kozak序列(GCCACC)和Flag標(biāo)簽序列，由上海生工生物工程有限公司合成(表1)，以保存的DGAT1菌液為模板，以亞克隆引物擴(kuò)增，膠回收后酶切純化與pcDNA3.1載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定正確后擴(kuò)繁提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，最后送測(cè)序。

表1 DGAT1克隆與亞克隆引物

1.2.3 山羊原代肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分離、培養(yǎng)與傳代 山羊原代肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)采用實(shí)驗(yàn)室前期建立的培養(yǎng)方法[28]。將2日齡簡(jiǎn)州大耳羊(n=1)饑餓24 h，用新吉爾滅清洗3次，75%酒精擦拭后，頸動(dòng)脈放血處死，在無(wú)菌細(xì)胞間采集背最長(zhǎng)肌組織，PBS清洗3次，在超凈工作臺(tái)修剪后加入I型膠原酶消化，37 ℃消化1 h，每隔5 min輕輕振蕩1次。加入等體積的10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，經(jīng)過(guò)200目篩網(wǎng)過(guò)濾后將濾液分裝到離心管中，2 000 r · min-1離心5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液吹散沉淀，靜置5 min，2 000 r · min-1離心5 min， 加入完全培養(yǎng)基重懸沉淀，吸取適量重懸液接種于60 mm培養(yǎng)皿中，即獲得原代肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，置于37 ℃， 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)融合度達(dá)80%時(shí)開始傳代，加入胰酶消化，1 000 r · min-1離心5 min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸沉淀，吸取重懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，每2 d換1次液。將細(xì)胞傳至F3代，接種于六孔板，生長(zhǎng)達(dá)80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

1.2.4 pcDNA3.1-DGAT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞 參照Lipofectamine?3000試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。本試驗(yàn)以轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-DGAT1質(zhì)粒作為試驗(yàn)組，轉(zhuǎn)入pcDNA3.1質(zhì)粒作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染前棄掉完全培養(yǎng)液，PBS清洗3次，每孔加入900 μL Opti饑餓處理4 h。吸取50 μL Opti與3 μL lip3000配成預(yù)混液A，吸取50 μL Opti、2.5 μL P3000、1 000 ng質(zhì)粒配成預(yù)混液B，將A液與B液充分混勻，靜置30 min后轉(zhuǎn)入細(xì)胞，放入37 ℃， 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，6 h后更換終濃度為50 μmol · L-1油酸的完全培養(yǎng)基[29]，48 h后收集細(xì)胞。

1.2.5 油紅O染色和甘油三酯含量測(cè)定 利用油紅O染色法觀察過(guò)表達(dá)DGAT1后山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂滴生成的變化情況。用于染色的肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞接種于6孔板，過(guò)表達(dá)DGAT1基因2 d后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，10%甲醛固定30 min，吸棄甲醛，PBS清洗3次，加入1 mL油紅O工作液染色20 min，棄去油紅O工作液后使用PBS清洗3次，于顯微鏡下觀察并拍照[28]，最后使用700 μL異丙醇提取油紅O并檢測(cè)OD510 nm值[30]。按照甘油三酯測(cè)定試劑盒(E1013，北京普利萊基因技術(shù)有限公司)的說(shuō)明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定在波長(zhǎng)為550 nm處的吸光度。

1.2.6 細(xì)胞總RNA提取及RT-qPCR 使用TRIzol法提取收集細(xì)胞的總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度及OD260 nm/OD280 nm，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄cDNA，稀釋10倍，存放于-20 ℃?zhèn)溆?。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)定量引物，過(guò)表達(dá)DGAT1后檢測(cè)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，以UXT基因作為試驗(yàn)的內(nèi)參基因[31]，見(jiàn)表2。RT-qPCR反應(yīng)體系：cDNA稀釋液1 μL，上、下游引物各1 μL，熒光染料(TB Green)10 μL，ddH2O 7 μL。RT-qPCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè) 技術(shù)重復(fù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR以泛表達(dá)轉(zhuǎn)錄子 (ubiquitously expressed transcript,UXT)為內(nèi)參基因，使用2-△△Ct法進(jìn)行分析，其中△△Ct=[(Ctgene-CtUXT)]試驗(yàn)組-[(Ctgene-CtUXT)]對(duì)照組。本研究中所有的結(jié)果數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，顯著性檢驗(yàn)使用SPSS20.0軟件中One-way ANOVA分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表2 RT-qPCR引物信息

2 結(jié) 果

2.1 山羊DGAT1基因克隆與生物信息學(xué)分析

本試驗(yàn)以簡(jiǎn)州大耳羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞cDNA為模板，通過(guò)RT-PCR法獲得與預(yù)期目的片段大小的特異條帶，回收純化連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌落PCR鑒定后送測(cè)序。結(jié)果表明，成功克隆得到DGAT1基因序列1 651 bp(GenBank登錄號(hào)：MT221183)，包含5′ UTR 125 bp， CDS區(qū)1 470 bp，3′ UTR 56 bp，編碼489個(gè)氨基酸殘基(圖1)。Blastn分析表明，山羊DGAT1基因與GenBank中綿羊(NM_001110164.1)、牛(NM_174693.2)、豬(NM_214051.1)、人(NM_012079.6)的核苷酸相似性分別為99.52%、97.35%、91.50%、88.00%，且山羊與綿羊、牛及豬的DGAT1基因CDS區(qū)均為1 470 bp， 而人的DGAT1基因CDS區(qū)長(zhǎng)1 467 bp(表3)。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DGAT1蛋白分子式為C2567H3940N690O661S21，分子量為55 717.01 u。等電點(diǎn)PI為9.61，該蛋白體外半衰期在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞離體狀態(tài)下為30 h，其蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為38.95。脂肪系數(shù)為99.35，總平均親水系數(shù)為0.144。山羊DGAT1的氨基酸序列共發(fā)現(xiàn)10個(gè)跨膜區(qū)域，分別位于氨基酸第84～103、148～118、161～184、207～189、252～267、305～280、320～350、424～403、428～444、 476～454位，N端在膜外側(cè)(圖2A)。山羊DGAT1蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè)最大值是2.867(第135位氨基酸)，最小值是-2.889(第15位氨基酸)。在5～85區(qū)有較強(qiáng)的親水性，在86～122、130～145、151～205、405～448、456～476區(qū)有較強(qiáng)的疏水性(圖2B)，綜合來(lái)看，DGAT1蛋白大部分為較強(qiáng)的疏水區(qū)域，表現(xiàn)為疏水性，推測(cè)DGAT1為疏水性蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，山羊DGAT1蛋白不存在信號(hào)肽序列。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，DGAT1蛋白中α螺旋占70%，無(wú)規(guī)則卷曲占21%，無(wú)β折疊;三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，山羊、綿羊、人、牛、豬、小鼠的DGAT1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似，均以α螺旋結(jié)構(gòu)為主，無(wú)β折疊(圖3)。利用MEGA5.0軟件對(duì)GenBank中6個(gè)不同物種DGAT1基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖4顯示，山羊與綿羊(NM_001110164.1)親緣關(guān)系最近，與牛(NM_174693.2)、豬(NM_214051.1)、人(NM_012079.6)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與小鼠(NM_010046.3)、大鼠(NM_053437.1)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表3 不同物種DGAT1基因CDS區(qū)序列比對(duì)

2.2 山羊DGAT1基因組織表達(dá)

以UXT為內(nèi)參基因，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)DGAT1基因在山羊不同組織中的mRNA表達(dá)譜。結(jié)果顯示，山羊DGAT1基因在所檢測(cè)的組織中均有表達(dá)，且在小腸中的表達(dá)量最高(P<0.01)，在脾中的表達(dá)量最低(圖5)。

2.3 pcDNA3.1-DGAT1載體構(gòu)建

DGAT1基因序列通過(guò)亞克隆，并純化后和pcDNA3.1質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行Hind Ⅲ與BamH Ⅰ雙酶切，T4 Ligase連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性菌落送測(cè)序，同時(shí)擴(kuò)繁提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，在1 200 和2 000 bp之間有條帶(圖6)，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致，證明pcDNA3.1-DGAT1載體構(gòu)建成功。

2.4 DGAT1過(guò)表達(dá)對(duì)山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞脂代謝的影響

pcDNA3.1-DGAT1轉(zhuǎn)染肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞并誘導(dǎo)48 h后，收集細(xì)胞，利用RT-qPCR檢測(cè)DGAT1過(guò)表達(dá)效率，結(jié)果顯示，pcDNA3.1-DGAT1組相比pcDNA3.1組的DGAT1基因表達(dá)水平上升282.3倍(圖7，P<0.01)。

油紅O染色結(jié)果顯示，pcDNA3.1-DGAT1組較pcDNA3.1組脂滴明顯增加(圖8A和8B)，且pcDNA3.1-DGAT1組OD510 nm值極顯著高于pcDNA3.1組(圖8C，P<0.01)。甘油三酯測(cè)定結(jié)果顯示，pcDNA3.1-DGAT1組甘油三酯含量極顯著高于pcDNA3.1組(圖8D，P<0.01)。

在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DGAT1基因后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GPAM顯著上調(diào)1.34倍(P<0.05)，ADRP和過(guò)氧化物酶?；o酶A氧化酶1 (ACOX1)基因分別極顯著上調(diào)1.35和2.17倍(P<0.01)，而AGPAT6顯著下調(diào)0.66倍(P<0.05)，丙二酰輔酶A去羧化酶(MLYCD)、HSL基因分別極顯著下調(diào)0.64、0.59倍(P<0.01)，DGAT2、TIP47、LPL、ATGL的mRNA表達(dá)量無(wú)明顯變化(圖9)。

3 討 論

Angiolillo等[32]通過(guò)對(duì)3個(gè)不同品種9只山羊進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從而得到了DGAT1基因的序列為1 552 bp，且與牛、豬、人均具有較高的序列相似性(>90%)，可見(jiàn)DGAT1基因在不同物種具有較高的序列保守性，然而，該報(bào)道僅僅上傳了DGAT1的部分CDS序列，這嚴(yán)重影響了后續(xù)對(duì)DGAT1基因的驗(yàn)證。本研究以四川地區(qū)的簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)樵囼?yàn)材料，利用RT-PCR的方法克隆得到了山羊DGAT1基因CDS區(qū)全序列，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，一部分序列與前人上傳的序列完全一致。這彌補(bǔ)了山羊DGAT1基因序列不完整的缺陷，從而為后續(xù)研究DGAT1調(diào)控山羊脂質(zhì)代謝的作用奠定了基礎(chǔ)。

Cao[33]對(duì)48種生物的59種DGAT1進(jìn)行DGATs多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)DGAT1同種型的氨基酸殘基平均數(shù)量為(515±44)，其中疏水性殘基超過(guò)40%。本試驗(yàn)從肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中得到的山羊DGAT1基因序列編碼489個(gè)氨基酸殘基，并具有較高疏水性的特征，與前人研究結(jié)果相似。Liu等[34]預(yù)測(cè)DGAT1具有8～10個(gè)疏水區(qū)域并認(rèn)為是構(gòu)成跨膜的結(jié)構(gòu)域，這與DGAT1定位于細(xì)胞內(nèi)

三酰甘油是一種儲(chǔ)存脂質(zhì)，可作為能量?jī)?chǔ)存庫(kù)以及信號(hào)分子和膜生物發(fā)生底物的來(lái)源[34]。DGAT1通過(guò)催化二?；视秃王ヵ］o酶A的連接來(lái)形成甘油三酯[37-38]。過(guò)表達(dá)DGAT1可顯著增加小鼠脂肪組織與骨骼肌TAG的含量[16,22]，促進(jìn)骨骼肌IMF的沉積[21]，而在小鼠DGAT1活性缺失后心臟甘油三酯合成受到抑制[23]。本研究中，DGAT1基因的過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)山羊前體脂肪細(xì)胞甘油三酯形成和脂質(zhì)沉積?？梢?jiàn)，DGAT1在不同物種中對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)的合成均具有重要的調(diào)控作用。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)DGAT1還可促進(jìn)GPAM、ADRP等其他脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)。GPAM催化三?；视秃土字铣煞磻?yīng)的第一步，可調(diào)控甘油三酯的量[4]。ADRP被認(rèn)為參與了脂滴形成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌過(guò)程，余康[6]發(fā)現(xiàn)，在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ADRP基因后甘油三酯含量提高。另一方面，過(guò)表達(dá)DGAT1也顯著下調(diào)了MLYCD、HSL等脂解相關(guān)基因的表達(dá)。MCD(MLYCD)可催化丙二酰輔酶A脫羧為乙酰輔酶A，從而阻斷脂肪酸的從頭合成[39]。HSL則是脂肪分解的限速酶，可促進(jìn)機(jī)體脂肪動(dòng)員[8]。推測(cè)DGAT1可通過(guò)提高脂質(zhì)的合成和抑制脂質(zhì)的分解從而促進(jìn)脂質(zhì)沉積。然而，DGAT1促進(jìn)脂質(zhì)沉積的具體分子機(jī)制還需要更進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究克隆得到1 651 bp的山羊DGAT1基因序列，包含5′UTR 125 bp，CDS 1 470 bp，3′ UTR 56 bp，編碼489個(gè)氨基酸殘基；山羊DGAT1在小腸中表達(dá)量最高，而在脾中表達(dá)量最低；過(guò)表達(dá)DGAT1基因可促進(jìn)山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)合成，并對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)有顯著影響。這些結(jié)果將為進(jìn)一步闡明DGAT1在山羊肌內(nèi)脂肪沉積過(guò)程中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。