乙型腦炎病毒感染PK15細(xì)胞的lncRNA差異表達(dá)譜分析

朱靜靜，戴政列，汪 涵，李向臣，趙阿勇，周曉龍，楊松柏

(浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，臨安 311300)

乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)感染引起的乙型腦炎是一種嚴(yán)重危害人類健康和養(yǎng)豬業(yè)的人畜共患病。乙型腦炎主要流行于亞洲和西太平洋地區(qū)，據(jù)統(tǒng)計(jì)有超過30億人口生活在這些地區(qū)[1]。其中我國是乙型腦炎的高發(fā)區(qū)，曾一度占世界的80%。盡管一些國家在疫苗接種工作中作出了很大努力，乙腦的發(fā)病率也已經(jīng)有了明顯下降，但每年仍有約6.8萬人感染，其中75%是15歲以下青少年，并造成超過1萬人死亡，而其中一半的幸存者會(huì)存在運(yùn)動(dòng)障礙、認(rèn)知功能障礙和癲癇等后遺癥[2]。豬是JEV的重要擴(kuò)增宿主，蚊子是將病毒從豬傳播給人類的重要載體[3]。因此，豬在JEV感染周期中起著至關(guān)重要的作用。此外，JEV感染也給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，母豬感染JEV引起流產(chǎn)和死胎，公豬感染引起無精癥[4-5]。而豬腎上皮PK15細(xì)胞作為一種良好的感染模型，已被廣泛應(yīng)用于JEV感染研究[6-9]。

在人類基因組中，能夠轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)的序列只占2%，而基因組中有大量序列會(huì)轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA(ncRNA)，如果ncRNA的長度超過200個(gè)核苷酸，將它定義為長ncRNA(lncRNA)[10]。像mRNA一樣，大多數(shù)lncRNA都具有5′帽結(jié)構(gòu)，并且具有聚腺苷酸化尾巴。長期以來。由于lncRNA不編碼蛋白質(zhì)，因此被認(rèn)為是“暗物質(zhì)”或“垃圾RNA”[11]。后續(xù)越來越多研究結(jié)果表明，lncRNA參與多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞生長、分化和凋亡[12-13]。利用高通量測序發(fā)現(xiàn)宿主lncRNA在多種病毒感染期后差異表達(dá)，包括PRRSV[14]、PRV[15]和PEDV[16]，隨后通過構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，多個(gè)差異表達(dá)lncRNA與免疫反應(yīng)相關(guān)。

此外，已經(jīng)證實(shí)lncRNA參與免疫反應(yīng)過程來調(diào)控病毒復(fù)制。例如，lncRNA-Lnczc3 h7a結(jié)合TRIM25蛋白增強(qiáng)RIG-I介導(dǎo)的抗病毒先天免疫反應(yīng)[17]。lncRNA#32通過正向調(diào)節(jié)干擾素刺激基因表達(dá)抑制病毒復(fù)制[18]。LncRNA-IVRPIE可以通過促進(jìn)干擾素β1和干擾素刺激基因的表達(dá)來抑制甲型流感病毒的復(fù)制[19]。利用微陣列芯片分析發(fā)現(xiàn)，在JEV感染小鼠后，在腦組織中鑒定出618個(gè)差異表達(dá)lncRNAs，富集分析發(fā)現(xiàn)，這些lncRNA在先天免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中可能起關(guān)鍵作用[20]。但是，JEV感染后的豬lncRNA表達(dá)模式及l(fā)ncRNA在JEV感染過程中的潛在功能仍不清楚。

本研究中，利用高通量技術(shù)對JEV感染后的PK15細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定JEV感染后差異表達(dá)lncRNA，預(yù)測其靶基因并對靶基因進(jìn)行富集分析，最后隨機(jī)選擇9個(gè)差異表達(dá)lncRNAs，利用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步探索lncRNA參與免疫反應(yīng)調(diào)控JEV感染分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒感染

將PK15細(xì)胞(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入含有10%胎牛血清(FBS，HyClone)和1%非必需氨基酸(Gibco)MEM培養(yǎng)基(HyClone)，置于37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天，待細(xì)胞融合度90%時(shí)，感染JEV(SA14-14-2，MOI=1)，吸附1 h后，將細(xì)胞用PBS洗滌3次，加入含2% FBS的MEM培養(yǎng)基置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。未感染的細(xì)胞用作對照組，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。感染后36 h收集細(xì)胞提取RNA，并命名為JEV-1、JEV-2和JEV-3；對照組分別命名為Mock-1、Mock-2和Mock-3。

1.2 文庫構(gòu)建和測序

利用TRIzol試劑(Thermo Fisher)提取總RNA。隨后利用NanoPhotometer分光光度計(jì)(IMPLEN)和1%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測RNA的濃度、純度和完整性。然后每個(gè)樣品取3 μg RNA，通過Ribo-Zero Magnetic試劑盒(Epicenter)去除核糖體RNA，利用NEBNext Ultra RNA文庫制備試劑盒(New England Biolabs)進(jìn)行文庫構(gòu)建。最后，利用Illumina HiSeq 2500系統(tǒng)(Illumina)對文庫進(jìn)行測序。整個(gè)流程委托北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控與lncRNA鑒定

為了保證數(shù)據(jù)的質(zhì)量與可靠性，需要對測序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。包括刪除帶接頭(adapters)的reads，去除包含N>5%的reads和低質(zhì)量(Q≤20)的reads，從而獲得clean reads。

利用TopHat2將clean reads比對到參考基因組上并使用Cufflinks軟件進(jìn)行組裝。利用Cuffcompare軟件將組裝好轉(zhuǎn)錄本和參考基因組進(jìn)行比較，得到lncRNA和mRNA的相互位置關(guān)系。選用CPC、CNCI和Pfam軟件對lncRNA進(jìn)行編碼潛能預(yù)測，3個(gè)軟件預(yù)測都沒有編碼能力的即為候選lncRNA。

1.4 表達(dá)量分析

使用cuffquant和cuffnorm軟件進(jìn)行表達(dá)量分析，利用FPKM進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理樣本，確定lncRNA和mRNA的表達(dá)水平。然后使用Deseq2軟件鑒定差異表達(dá)lncRNA和mRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)為log2Fold Change≥1且Pvalue≤0.05。

1.5 靶基因預(yù)測

LncRNA可以調(diào)控自身和其鄰近編碼基因的轉(zhuǎn)錄。因此根據(jù)lncRNA及其鄰近編碼基因之間的位置關(guān)系，將lncRNA分為5種類型：有義、反義、雙向、內(nèi)含子和基因間lncRNA。有義，當(dāng)它們與蛋白質(zhì)編碼基因的有義鏈重疊時(shí)；反義，當(dāng)它們與蛋白質(zhì)編碼基因的反義鏈重疊時(shí)；雙向，當(dāng)它們位于與蛋白質(zhì)編碼基因相反的鏈上時(shí)，其轉(zhuǎn)錄起始距離少于1 000個(gè) 堿基對；內(nèi)含子，當(dāng)它們完全來自另一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子時(shí)；基因間，不在任何其他蛋白質(zhì)編碼基因座的10 000個(gè)堿基之內(nèi)。將這5種類型的lncRNA歸類為順式調(diào)控lncRNA。使用blat軟件對lncRNA和mRNA(3′UTR)序列進(jìn)行比對，篩選序列相似lncRNA-mRNA對。因此得到多個(gè)順式作用和反式作用的lncRNA-mRNA對，在這些lncRNA-mRNA對中，只有l(wèi)ncRNA和mRNA都為顯著差異表達(dá)，才判定為lncRNA的靶基因。

1.6 GO和KEGG富集分析

利用GO(gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)對差異表達(dá)lncRNA的順式和反式靶基因進(jìn)行功能富集分析。利用超幾何分布進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)得到富集結(jié)果P值，如果P≤0.05，則認(rèn)為該富集結(jié)果顯著。

1.7 熒光定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)lncRNA

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)評估

對JEV感染組和未感染組共6個(gè)樣品進(jìn)行高通量測序，得到70.6～95.3 Mb不等的原始序列。經(jīng)過質(zhì)控之后，共得到68.5～92.7 Mb不等的有效數(shù)據(jù)，有效數(shù)據(jù)比例達(dá)到了96.8 %以上，Q20在97.7 %以上，Q20在93.5 %以上(表2)。測序數(shù)據(jù)和豬參考基因組的比對率均達(dá)到了70.3%以上，97.9 % 以上的序列在參考基因上有唯一的比對位置(表3)。表明測序數(shù)據(jù)較好，滿足后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

表3 參考基因組比對情況

2.2 lncRNA鑒定與差異表達(dá)分析

通過CPC、CNCI和Pfam軟件進(jìn)行篩選后，本研究共鑒定出5 059個(gè)新lncRNAs(圖1A)，

已知lncRNA共3 435個(gè)，已知mRNA共12 818個(gè)， 新mRNA共23 440個(gè)(圖1B)。另外分別對lncRNA和mRNA外顯子數(shù)量和轉(zhuǎn)錄本長度進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)和mRNA相比，lncRNA具有較少的外顯子數(shù)量和較短的轉(zhuǎn)錄本(圖1C、D)。對鑒定出的lncRNA和mRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，結(jié)果表明，差異表達(dá)的lncRNA共856個(gè)，其中452個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)，404個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)(圖2A、B)；差異表達(dá)的mRNA總數(shù)為4 165個(gè)，其中顯著上調(diào)表達(dá)的為2 253個(gè)， 顯著下調(diào)表達(dá)的為1 912個(gè)(圖2A)。從熱圖分析來看，同一個(gè)lncRNA或mRNA在同一組的表達(dá)模式相似，說明組內(nèi)的樣本重復(fù)性較好(圖2C、D)。

2.3 差異表達(dá)lncRNA靶基因GO和KEGG分析

在差異表達(dá)lncRNA和mRNA中，通過比較或者比對lncRNA和mRNA的位置關(guān)系以及序列相似性，得到差異表達(dá)lncRNA的順式和反式作用的靶基因。結(jié)果顯示，共得到潛在靶基因1 041個(gè)，其中順式作用靶基因657個(gè)，反式作用靶基因384個(gè)。為了進(jìn)一步探究這些靶基因參與的生物學(xué)功能，利用GO數(shù)據(jù)庫，將差異lncRNA靶基因進(jìn)行功能注釋。GO功能注釋包括生物學(xué)過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)。結(jié)果顯示，共有821個(gè)GO條目顯著富集。3個(gè)功能分類最顯著的條目分別是先天免疫反應(yīng)(innate immune response)、呼吸鏈(respiratory chain)和NADH脫氫酶活性(NADH dehydrogenase activity)(圖3)。KEGG富集分析結(jié)果顯示，lncRNA的靶基因共富集到156個(gè)通路中，其中10個(gè)通路顯著富集，包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、NF-κB信號(hào)通路(NF-κB signaling pathway)和Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)(圖4)。

A. CPC、CNCI和Pfam預(yù)測的lncRNA的維恩圖；B. 鑒定的lncRNA和mRNA的數(shù)量；C. lncRNA和mRNA的外顯子數(shù)目；D. lncRNA和mRNA的長度A. The Venn diagram of lncRNAs predicted by CPC, CNCI, and the Pfam database; B. The number of lncRNAs and mRNAs identified; C. Exon numbers of lncRNAs and mRNAs; D. Transcript lengths of the lncRNAs and mRNAs圖1 差異lncRNA的鑒定與基因組特征Fig.1 Prediction and genomic features of lncRNAs

A. JEV感染組中上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)lncRNA和mRNA的數(shù)量；B. 差異表達(dá)lncRNA的火山圖，紅點(diǎn)表示上調(diào)的基因，綠點(diǎn)表示下調(diào)的lncRNAs，黑點(diǎn)表示沒有明顯變化的基因；C. 差異表達(dá)lncRNA的聚類熱圖分析；D. 差異表達(dá)mRNA的聚類熱圖分析，紅色表示相對較高的表達(dá)水平，綠色表示相對較低的表達(dá)水平A. The number of upregulated and downregulated differentially expressed lncRNAs and mRNAs in the JEV infected group compared to the mock infected group; B. Volcano plot of differentially expressed lncRNAs. Red dots refer to upregulated and green dots refer to downregulated lncRNAs, and the black dots represent genes with no significant changes; C. Clustering and heatmap analysis of differentially expressed lncRNA; D. Clustering and heatmap analysis of differentially expressed mRNA. Red refers to relative higher expression level, and green refers to relatively lower expression level圖2 差異表達(dá)lncRNA和mRNA鑒定與表達(dá)分析Fig.2 Identification and expression analysis of differentially expressed lncRNA and mRNA

圖3 差異表達(dá)lncRNA靶基因GO分析Fig.3 GO analysis of target genes of differentially expressed lncRNAs

2.4 定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)lncRNA

本研究利用熒光定量PCR方法對測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。首先將JEV感染PK15細(xì)胞，感染不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后隨機(jī)選取9個(gè)差異表達(dá)lncRNAs(6個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)，3個(gè)顯著下調(diào)表達(dá))，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，與0 h未感染組相比，6個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)lncRNAs(TCONS_00091590、TCONS_00061989、TCONS_00057383、TCONS_00035357、TCONS_00022902、TCONS_00071284)在JEV感染36 h顯著上調(diào)表達(dá)，而且在感染的整個(gè)過程中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢；3個(gè) 顯著下調(diào)表達(dá)lncRNAs(TCONS_00035689、TCONS_00036059、TCONS_00087848)在JEV感染36 h顯著下調(diào)表達(dá)，并且在JEV感染過程中呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(圖5)。表明熒光定量PCR結(jié)果和測序結(jié)果一致，說明測序結(jié)果可靠。

圖4 差異表達(dá)lncRNA靶基因KEGG分析Fig.4 KEGG analysis of target genes of differentially expressed lncRNA

3 討 論

目前，關(guān)于JEV感染后引起宿主基因mRNA及miRNA[21]等的表達(dá)譜變化已有報(bào)道，但JEV感染后引起的豬lncRNA表達(dá)譜變化尚未見報(bào)道。研究表明，lncRNA在調(diào)控病毒宿主基因互作以及病毒增殖中起到關(guān)鍵作用[22]。在一項(xiàng)小鼠的研究中，利用微陣列芯片方法在JEV感染的小鼠腦組織中鑒定出多個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，通過lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)這些lncRNA可能調(diào)控JEV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[20]。本課題組前期通過熒光定量PCR技術(shù)檢測到4個(gè)lncRNAs在JEV感染PK15細(xì)胞后差異表達(dá)，并鑒定出lncRNA-SUSAJ1顯著抑制JEV增殖[23-24]。本研究中，通過高通量測序方法鑒定JEV感染PK15細(xì)胞后的lncRNA表達(dá)譜。結(jié)果顯示，共鑒定出5 059個(gè)新lncRNA。和mRNA相比，這些lncRNA具有較短的轉(zhuǎn)錄本和較少的外顯子，這些lncRNA特征和之前的研究結(jié)果一致[25-27]。進(jìn)一步通過表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，感染組有856個(gè)差異表達(dá)lncRNAs。

在病毒感染細(xì)胞的不同階段，宿主基因以及l(fā)ncRNA往往會(huì)呈現(xiàn)出不同的表達(dá)譜。杜程濤等[23]在研究JEV感染PK15細(xì)胞動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)，在感染后的36 h時(shí)，病毒的滴度已經(jīng)達(dá)到較高水平，而且這時(shí)細(xì)胞并沒有發(fā)生明顯病變。因此本研究選擇了JEV感染36 h的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。為了驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性以及選擇JEV感染時(shí)間點(diǎn)的普遍代表性，利用JEV感染PK15細(xì)胞，在感染不同時(shí)間點(diǎn)(0、12、24、36和48 h)收集細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后隨機(jī)選取轉(zhuǎn)錄組測序篩選到的9個(gè)差異表達(dá)lncRNAs進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示，這些lncRNAs在感染后36 h以及在病毒感染的整個(gè)過程中的表達(dá)趨勢和測序結(jié)果一致。說明測序結(jié)果的可靠性高以及選擇感染時(shí)間點(diǎn)具有代表性。

與0 h未感染組相比，*.P<0.05；**.P<0.01Compared with 0 h of uninfected group,*.P<0.05;**.P<0.01圖5 熒光定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)lncRNAFig.5 Validation of differentially expressed lncRNAs by qRT-PCR

lncRNA能夠通過順式作用調(diào)控鄰近基因的表達(dá)或通過反式作用調(diào)控不同染色體上的基因表達(dá)[28]。因此，本研究通過判定lncRNA和mRNA的相對位置以及序列相似性預(yù)測差異表達(dá)lncRNA的順式和反式調(diào)控的靶基因。進(jìn)一步通過GO分析發(fā)現(xiàn)這些靶基因在生物學(xué)功能中最顯著富集于先天免疫反應(yīng)。說明這些差異表達(dá)lncRNA可以通過調(diào)控宿主先天性免疫反應(yīng)激活模式識(shí)別受體信號(hào)通路從而誘導(dǎo)干擾素和細(xì)胞因子的表達(dá)。例如，在一項(xiàng)丙肝病毒(HCV)的研究中發(fā)現(xiàn)，干擾素處理或HCV感染能誘導(dǎo)lncRNA-CMPK2的表達(dá)，同時(shí)在干擾素刺激的肝細(xì)胞中，敲低lncRNA-CMPK2表達(dá)后正調(diào)控干擾素信號(hào)通路進(jìn)而抑制HCV復(fù)制[29]。lncRNA-NRAV通過組蛋白修飾抑制干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而促進(jìn)甲型流感病毒的復(fù)制[30]。lncRNA-ITPRIP-1通過激活MDA5誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)，而lncRNA-EPS通過調(diào)控核小體的狀態(tài)抑制免疫反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄[31-32]。lncRNA-LncATV抑制RIG-I介導(dǎo)的先天免疫從而促進(jìn)多種RNA病毒(包括丙型肝炎病毒、寨卡病毒)的復(fù)制[33]。因此本研究中篩選到的差異表達(dá)lncRNA參與先天性免疫反應(yīng)調(diào)控JEV復(fù)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

差異表達(dá)lncRNA靶基因的KEGG富集結(jié)果中，顯著富集的通路包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路。研究表明，Toll樣受體(TLR)通過識(shí)別病毒復(fù)制產(chǎn)物，傳遞一系列信號(hào)激活細(xì)胞因子和I類干擾素表達(dá)啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)發(fā)揮抗病毒作用，其中TLR3、TLR7和TLR8可以識(shí)別病毒RNA[34]。Toll樣受體在宿主抗JEV感染發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，敲低TLR3基因表達(dá)后顯著促進(jìn)JEV復(fù)制[35-36]。在小鼠的腦組織中特異性敲低TLR7基因的表達(dá)后再感染JEV，發(fā)現(xiàn)在腦組織中IFN-α和抗病毒蛋白顯著降低，同時(shí)病毒的載量顯著升高[37]。研究表明，lncRNA能調(diào)控Toll樣受體信號(hào)通路基因表達(dá)。比如lncRNA MEG3通過抑制TLR4信號(hào)通路基因表達(dá)促進(jìn)呼吸道合胞病毒(RSV)的感染[38]。本研究篩選到多個(gè)差異表達(dá)lncRNA靶向免疫相關(guān)信號(hào)通路，因此,推測這些lncRNA介導(dǎo)先天性免疫反應(yīng)相關(guān)通路調(diào)控JEV感染。

4 結(jié) 論

利用高通量測序技術(shù)對乙型腦炎病毒(JEV)感染后的PK15細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，篩選到多個(gè)差異表達(dá)lncRNA，并預(yù)測這些差異表達(dá)lncRNA的順式作用和反式作用的靶基因。進(jìn)一步通過GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，這些靶基因主要富集于免疫反應(yīng)相關(guān)通路。推測lncRNA通過參與免疫反應(yīng)調(diào)控JEV復(fù)制。本研究為進(jìn)一步從lncRNA角度探究宿主基因參與調(diào)控JEV感染提供了理論依據(jù)。