云南獨(dú)龍雞和白來航雞卵巢組織轉(zhuǎn)錄組水平的比較分析

任 宇，丁玥竹，農(nóng)燕鴻，郭愛偉，劉莉莉

(西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650224)

獨(dú)龍雞是我國云南貢山縣獨(dú)龍江鄉(xiāng)獨(dú)龍族飼養(yǎng)的獨(dú)有地方品種，2010年被《國家畜禽遺傳資源目錄》收錄[1]。純種獨(dú)龍雞分布在獨(dú)龍江流域最北邊，這里群山環(huán)抱，地形陡峭，環(huán)境惡劣，交通極為不便，幾乎無外來雞種進(jìn)入[2]。經(jīng)過長期自然選擇，獨(dú)龍雞具備了許多其他地方雞種和新品種雞不具備的優(yōu)勢，如覓食力強(qiáng)，產(chǎn)蛋量高，抗病力強(qiáng)，能適應(yīng)高海拔、高濕度的惡劣環(huán)境等[3]。獨(dú)龍雞主要由當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶飼養(yǎng)，雞群多處于小范圍的封閉狀態(tài)，沒有建立良種繁育體系，也缺乏系統(tǒng)的選種選育[3-4]。近年來，隨著交通條件的改善和外地新品種的盲目引入，獨(dú)龍雞品種資源流失嚴(yán)重[5-6]，對其優(yōu)良的蛋品質(zhì)等生產(chǎn)性狀相關(guān)基因的挖掘和研究已成為家禽育種工作者的一項(xiàng)重要任務(wù)。

卵巢是雞蛋形成的主要部位之一，是雌性動(dòng)物調(diào)控生殖的最主要器官，卵巢產(chǎn)生的孕酮、雌二醇等類固醇激素不僅促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟和排卵，還參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)過程[7-8]，因此卵巢組織與蛋的形成及其他蛋品質(zhì)等相關(guān)性狀密切相關(guān)。白來航雞產(chǎn)蛋量高且飼料消耗少，是我國蛋雞生產(chǎn)的主要品種之一。目前，轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing，RNA-seq)在雞重要經(jīng)濟(jì)性狀候選基因鑒定方面的應(yīng)用日漸成熟[9]，但在獨(dú)龍雞上相對滯后，對獨(dú)龍雞蛋品質(zhì)等相關(guān)性狀候選基因的挖掘與鑒定研究更是空白。因此，本研究擬通過RNA-seq技術(shù)比較獨(dú)龍雞和白來航雞卵巢組織的基因表達(dá)水平，以分析獨(dú)龍雞和白來航雞的種質(zhì)差異，為后續(xù)獨(dú)龍雞重要生產(chǎn)性狀候選功能基因篩選、基因功能驗(yàn)證、品種改良和種質(zhì)特性等研究奠定基礎(chǔ)，為保護(hù)云南獨(dú)龍雞品種和開展分子育種改善獨(dú)龍雞蛋品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)雞群和樣品采集

試驗(yàn)所用的種蛋由云南貢山縣神山農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，種蛋在西南林業(yè)大學(xué)綜合實(shí)訓(xùn)基地孵化，同一批次孵化的小雞在同一條件下飼養(yǎng)，自由飲食采水。43周齡時(shí)觀察到獨(dú)龍雞有連續(xù)的產(chǎn)蛋過程，隨機(jī)選取3只健康狀況良好的獨(dú)龍雞解剖并采集卵巢組織，編號為DL1、DL2、DL3，迅速投放入液氮罐中。

1.2 總RNA提取和質(zhì)檢

采用TRIzol法提取卵巢組織總RNA。使用Nanodrop 2000、Agilent 2100 bioanalyzer檢測RNA濃度、純度和完整度，以保障使用合格的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。提取的RNA樣品濃度≥500 ng·μL-1，RIN值≥8且28S:18S≥1。

1.3 文庫構(gòu)建及測序

使用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，然后加入分離緩沖液(fragmentation buffer)將mRNA隨機(jī)打斷。以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(Random Hexamers)合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA Polymerase I合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA。純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭。最后用AMPure XP beads選擇文庫插入的片段大小，并通過PCR富集得到cDNA文庫。構(gòu)建好的文庫用q-PCR法準(zhǔn)確定量，以保證文庫有效濃度>2 nmol·L-1。當(dāng)庫檢合格后，用Illumina高通量測序平臺進(jìn)行測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)及其質(zhì)量控制

測序完成后會產(chǎn)生大量的原始數(shù)據(jù)(raw data)，使用Fastx_toolkit軟件對這些原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾：去除含有接頭的Reads，去除低質(zhì)量的Reads(包括N比例大于10%的Reads和質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整條Read的50%以上的Reads)，由此得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)(clean data)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對和組裝

從NCBI網(wǎng)站上下載雞的參考基因組序列(版本號：GCF_000002315.5)，使用HISAT2(版本：2.0.4)將質(zhì)控后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)比對到參考基因組上。比對分析完成后用StringTie對比對上的Reads進(jìn)行組裝和定量。

1.6 差異表達(dá)分析

以中國農(nóng)業(yè)大學(xué)侯卓成課題組的相似飼養(yǎng)條件和周齡白來航雞卵巢組織測序數(shù)據(jù)(https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR546478)為對照組，以本研究中獨(dú)龍雞樣本為試驗(yàn)組進(jìn)行差異表達(dá)分析。采用FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)作為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo)，將差異倍數(shù)(Fold change，F(xiàn)C)≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate，F(xiàn)DR)<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，使用DESeq2軟件分析樣品間的差異表達(dá)，獲得差異表達(dá)基因集。試驗(yàn)組差異基因的表達(dá)水平高于對照組，為上調(diào)基因(up-regulated gene)，否則為下調(diào)基因(down-regulated gene)。

1.7 差異表達(dá)基因富集分析

Gene Ontology(GO)分析是大規(guī)?；蚬δ芨患芯恐斜容^常用的方法，包含3個(gè)主要分支：生物學(xué)過程(biological process)，分子功能(molecular function)和細(xì)胞組分(cellular component)。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)存儲了大量關(guān)于基因組學(xué)、生物途徑、信號通路、疾病、藥物和化學(xué)物質(zhì)的數(shù)據(jù)。通過KEGG分析有助于把基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體，進(jìn)一步解讀基因的功能。差異表達(dá)基因的GO功能注釋采用Wallenius非中心超幾何分布的GOseq R包實(shí)現(xiàn)，KEGG通路分析采用KOBAS在線網(wǎng)站完成。以P<0.05和富集基因數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因顯著富集的GO條目和KEGG通路。

1.8 差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

STRING(The Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes)是收錄多個(gè)物種預(yù)測的和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，包括直接的物理互作和間接的功能相關(guān)。為了更好的了解差異表達(dá)基因間的互作關(guān)系，使用STRING構(gòu)建差異表達(dá)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。提取的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用對的互作得分>0.9。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證

選取13個(gè)差異表達(dá)基因，對獨(dú)龍雞和白來航雞樣本進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，以檢測測序結(jié)果及數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。以β-actin為內(nèi)參基因，由北京擎科新業(yè)生物有限合成所需引物，序列見表1。擴(kuò)增體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，cDNA模板2.0 μL，7.2 μL水補(bǔ)足20 μL體系。擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用比較Ct值法，即2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對表達(dá)量。采用Graphpad 8.0軟件對每個(gè)基因的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行雙尾非配對T檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)

通過對43周齡獨(dú)龍雞和白來航雞卵巢組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得24.04 Gb高質(zhì)量數(shù)據(jù)，各樣品高質(zhì)量數(shù)據(jù)均達(dá)到2.02Gb，Q30堿基百分比在78.60%及以上，測得數(shù)據(jù)的總量和質(zhì)量都滿足后續(xù)分析的條件。分別將各樣品的高質(zhì)量序列與雞的參考基因組序列進(jìn)行比對，比對效率從77.84%到92.58%不等，具體結(jié)果見表2。各項(xiàng)數(shù)據(jù)表明測序產(chǎn)量和數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可進(jìn)一步分析。

2.2 差異表達(dá)基因篩選和富集分析

以白來航雞為對照組，以|log2Fold Change |≥1，F(xiàn)DR<0.01為條件，共篩選出差異表達(dá)基因1 273個(gè)，其中上調(diào)基因522個(gè)，下調(diào)基因751個(gè)。兩組樣品中基因表達(dá)水平的差異以及差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過火山圖顯示(圖1)。對獨(dú)龍雞和白來航雞差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)過程中上調(diào)基因多注釋到蛋白水解(GO: 0006508)、對革蘭氏陰性菌的防御反應(yīng)(GO:0050829)、對革蘭氏陽性菌的防御反應(yīng)(GO:0050830)，而下調(diào)基因主要與翻譯(GO:0006412)、基因表達(dá)的正向調(diào)控(GO:0010628)、細(xì)胞增殖的正向調(diào)控(GO:0008284)有關(guān)；在細(xì)胞組分中，上調(diào)基因多與胞外區(qū)有關(guān)，如細(xì)胞外泌體(GO:0070062)、細(xì)胞外空間(GO:0005615)，而下調(diào)基因集中在膜表面，如膜(GO:0016020)、粘著斑(GO:0005925)、細(xì)胞表面(GO:0009986)；在分子功能中，上調(diào)基因可顯著注釋到血紅素結(jié)合(GO:0020037)、絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性(GO:0004252)，而下調(diào)基因主要與鈣離子結(jié)合(GO:0005509)、核糖體的結(jié)構(gòu)組成部分(GO:0003735)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(GO:0008134)有關(guān)，具體結(jié)果如圖2所示。GO條目表明獨(dú)龍雞中上調(diào)差異基因主要參與免疫相關(guān)的生理生化過程，下調(diào)差異基因多與基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)合成有關(guān)。

KEGG富集分析用于確定差異表達(dá)基因參與的主要生化代謝途徑和信號通路。結(jié)果表明，差異表達(dá)基因在127個(gè)通路中富集，按P值由小到大篩選，前20條通路被展示出來(圖3)，其中7條通路顯著富集(P<0.05)，分別是核糖體(ko03010)、ECM(細(xì)胞外基質(zhì)，extracellular matrix)-受體相互作用(ko04512)、氧化磷酸化(ko00190)、粘著斑(ko04510)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(ko04933)、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)(ko04672)、心肌收縮(ko04260)。

表1 差異表達(dá)基因的引物信息

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

通過對差異基因的富集分析和文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)RPL22、RPL36、JAKMIP1涉及4個(gè)GO條目和1個(gè)KEGG通路，且與蛋白質(zhì)合成有關(guān)，因此這些基因可能與蛋白重、蛋白高度、哈氏單位等蛋白品質(zhì)相關(guān)；ATP5I、ATP5E、COX5A、NDUFAB1參與氧化磷酸化信號通路，卵泡的發(fā)育和成熟是一項(xiàng)復(fù)雜的耗能過程，因此這些基因可能與蛋重、蛋白重、蛋黃重等多種蛋品質(zhì)有關(guān)。

圖1 獨(dú)龍雞和白來航雞卵巢組織的差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 The volcano plot of differentially expressed genes in ovarian tissues of Dulong chickens and White Leghorn chickens

2.3 差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)的蛋白互作進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)共有860個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 124個(gè)相互作用(圖4)，其中，蛋白互作主要集中在RPS23、RPS2、RPL22、RPL30等核糖體組裝的調(diào)控上。

2.4 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

結(jié)合富集分析和STRING蛋白互作結(jié)果，選取13個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示。將測得的qRT-PCR數(shù)據(jù)與RNA-seq結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)13個(gè)基因的上下調(diào)趨勢一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序篩選出來的差異基因是可信的。相較于白來航雞，CATH2、JAKMIP1、SLC1A6、WDR27在獨(dú)龍雞中顯著上調(diào)，ATP5E、ATP5I、PBDC1、RPL22、RPL36、COX5A顯著下調(diào)。GRB14、NDUFAB1、RPL30差異不顯著。

3 討 論

獨(dú)龍雞是我國云南少數(shù)民族獨(dú)龍族飼養(yǎng)的獨(dú)有地方品種，有關(guān)其種質(zhì)特性和習(xí)性的研究相對欠缺，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序篩選獨(dú)龍雞和白來航雞卵巢組織中的差異表達(dá)基因，然后利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析差異表達(dá)基因參與的信號通路和生物學(xué)過程，探索獨(dú)龍雞的種質(zhì)特性，為獨(dú)龍雞優(yōu)良生產(chǎn)性狀相關(guān)基因的挖掘和研究提供理論基礎(chǔ)。

通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因主要富集在生物學(xué)過程中的蛋白水解和免疫防御，細(xì)胞組分中的細(xì)胞外泌體，細(xì)胞外空間，以及分子功能中的結(jié)合活性。研究表明，蛋白水解在機(jī)體適應(yīng)特殊環(huán)境中起著關(guān)鍵作用[10]，蛋清蛋白及其水解產(chǎn)物具有抗菌、抗炎、抗高血壓、抗血栓和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[11-13]，這些活性可能與獨(dú)龍雞對高海拔的惡劣環(huán)境有較強(qiáng)的的適應(yīng)性有關(guān)。外泌體是細(xì)胞在一定條件下分泌的多囊泡體，是細(xì)胞間信號傳遞的重要工具[14]。大量研究表明，細(xì)胞外泌體不僅可通過轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞間抗原成分、殺傷性蛋白分子、炎癥因子等免疫相關(guān)物質(zhì)參與機(jī)體固有免疫的調(diào)節(jié)，還可通過介導(dǎo)抗原提呈過程增強(qiáng)機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)[14-15]。細(xì)胞外泌體相關(guān)基因如APAF1、BST1、CPQ、GALNT3等上調(diào)提示了相較于白來航雞，獨(dú)龍雞有著較強(qiáng)的抗性，為獨(dú)龍雞的抗病育種研究提供了理論依據(jù)。

圖2 獨(dú)龍雞和白來航雞卵巢組織的差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of differentially expressed genes in ovarian tissues of Dulong chicken and White Leghorn chicken

圖3 獨(dú)龍雞和白來航雞卵巢組織的差異表達(dá)基因KEGG通路分析Fig.3 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes in ovarian tissues of Dulong chicken and White Leghorn chicken

KEGG通路富集分析顯著性最可靠的是核糖體通路、ECM受體互作通路、氧化磷酸化通路和粘著斑等，研究表明這些信號通路與雞的蛋品質(zhì)和產(chǎn)蛋性能等性狀有關(guān)[16]。蛋白是包裹在蛋黃周圍的透明膠狀物，主要由卵白蛋白、卵球蛋白、卵類黏蛋白和伴清蛋白組成[14]。輸卵管膨大部含有很多核糖體，是蛋白質(zhì)合成的主要部位[17]。膨大部的核糖體首先組裝在mRNA上，然后沿著mRNA鏈翻譯，合成的蛋白質(zhì)包裹在卵黃的外面，由于輸卵管的蠕動(dòng)，包有蛋白質(zhì)的卵也跟著旋轉(zhuǎn)前進(jìn)，逐漸形成卵黃外的濃、稀蛋白層，濃蛋白層越高，對應(yīng)的哈氏單位值越大，蛋品質(zhì)就越好[18]。在評價(jià)蛋品質(zhì)高低的諸多性狀中，哈氏單位是一個(gè)非常關(guān)鍵的性狀，因此，核糖體通路很有可能與蛋白比例、蛋白高度、哈氏單位等蛋品質(zhì)性狀有關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)是由數(shù)百種蛋白質(zhì)組成的、分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞間的大分子，這些大分子物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，為調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活動(dòng)和組織發(fā)育提供三維支持[19]。卵丘細(xì)胞外基質(zhì)對卵丘的擴(kuò)張和卵母細(xì)胞的成熟至關(guān)重要。當(dāng)母雞接近性成熟時(shí)，肝臟在雌激素的作用下逐漸合成和分泌卵黃前體，這些前體物質(zhì)通過血液循環(huán)到達(dá)卵泡，并與卵母細(xì)胞表面的受體蛋白結(jié)合，從而通過胞吞作用進(jìn)入卵細(xì)胞[20-21]。ECM為結(jié)合卵母細(xì)胞表面受體提供了細(xì)胞粘附結(jié)構(gòu)域，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號傳遞[22]。因此，我們推測ECM受體互作、粘著斑極有可能與蛋黃重、蛋黃比例有關(guān)。氧化磷酸化是能量代謝通路，雞卵母細(xì)胞生長完全依賴于卵黃提供營養(yǎng)成分，因此需要較高的能量代謝以確保足夠的卵黃前體物質(zhì)沉積到發(fā)育的胚胎中，維持產(chǎn)蛋過程[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于白來航雞，獨(dú)龍雞在核糖體通路、ECM受體互作通路、氧化磷酸化通路上主要基因均以下調(diào)為主，RNA-seq結(jié)果顯示RPS29、RPL22、RPL36的下調(diào)倍數(shù)在1.23～2.88之間，COL10A1、COL6A3、ITGA7的下調(diào)倍數(shù)在1.24～3.33之間，ATP5E、ATP5I、COX5A的下調(diào)倍數(shù)在1.94～2.19之間。獨(dú)龍雞和白來航雞屬兩個(gè)不同類型品種，白來航雞為著名蛋用型品種，性成熟早、無就巢性，產(chǎn)蛋量高[24]，而獨(dú)龍雞為地方肉蛋兼用型品種，覓食力強(qiáng)，就巢性強(qiáng)[2]。白來航雞為維持較高的產(chǎn)蛋能力有更高的基因表達(dá)量。本研究提示了可以通過分子育種手段從獨(dú)龍雞的核糖體通路和ECM受體互作等信號通路提高獨(dú)龍雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)，同時(shí)也提示了獨(dú)龍雞作為優(yōu)質(zhì)的本地品種具有較大的遺傳改良潛質(zhì)。

圖中的節(jié)點(diǎn)(node)為蛋白質(zhì)，邊(edge)為連接的兩個(gè)節(jié)點(diǎn)間的互相作用關(guān)系?；プ骶W(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的大小、顏色梯度(由紅到綠)與此節(jié)點(diǎn)的度(degree)成正比，即與此節(jié)點(diǎn)相連的邊越多，它的度越大，節(jié)點(diǎn)也就越大，對應(yīng)的顏色也就越深(紅)The node in the diagram is the protein and the edge is the interaction between the two nodes connected. The size and colour gradient (from red to green) of a node in an interworking network is proportional to the degree (degree) of this node, i.e. the more edges connected to this node, the greater its degree, the larger the node will be and the darker (red) the corresponding colour will be圖4 獨(dú)龍雞和白來航雞卵巢組織的差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Analysis of differential protein interaction network in ovarian tissue of Dulong chicken and White Leghorn chicken

圖5 13個(gè)差異表達(dá)基因的qRT-PCR 驗(yàn)證Fig.5 qRT-PCR validation of seventeen selected genes that are differentially expressed

為驗(yàn)證差異基因在獨(dú)龍雞和白來航雞上種質(zhì)導(dǎo)致的表達(dá)差異，本研究篩選了13個(gè)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。qPCR結(jié)果與測序結(jié)果一致。RPL22、RPL36是60S大核糖體亞基的蛋白質(zhì)組成部分，Collart等[25]研究表明RPL22的突變可以改變蛋白質(zhì)的合成效率。ATP5I、ATP5E是ATP合成酶的重要組成部分，與線粒體氧化磷酸化有關(guān)[26]。線粒體是真核細(xì)胞有氧呼吸的主要場所，為細(xì)胞增殖、遷移、生存提供所需能量，同時(shí)線粒體也與體內(nèi)鈣、鐵平衡、凋亡、衰老等細(xì)胞活動(dòng)有關(guān)[27]。Havlíckov等[26]研究表明，HEK細(xì)胞中ATP5E亞基的沉默導(dǎo)致ATP合成酶復(fù)合物的活性和含量降低。Wilde等[28]利用siRNA技術(shù)敲低ATP5I的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)低PH環(huán)境能通過影響ATP合成酶增加線粒體ATP(mitochondrial ATP，mtATP)從線粒體基質(zhì)中輸出，這意味著當(dāng)處于應(yīng)激條件時(shí)，機(jī)體可得到最大能量供應(yīng)以支撐抗逆境需求，這也解釋了獨(dú)龍雞為什么能在高寒缺氧的惡劣環(huán)境生存并維持一定的產(chǎn)蛋能力。Xiao等[29]也指出了COX5A是參與線粒體電子傳輸?shù)哪┒搜趸傅暮司幋a亞基，與能量合成有關(guān)。CATH2是抗菌肽家族的一員，研究表明抗菌肽不僅能抑制和殺滅病源微生物，還具有多種免疫調(diào)節(jié)活性[30]。蛋殼是雞蛋抵御微生物入侵的主要屏障，蛋殼品質(zhì)的好壞與雞蛋儲存時(shí)間和破損率有關(guān)，蛋殼品質(zhì)越差，雞蛋變質(zhì)速度越快。研究表明：禽類CATH2具有與哺乳動(dòng)物抗菌肽相似的保守信號肽和cathelin結(jié)構(gòu)域，且在呼吸道、胃腸道、淋巴器官、生殖器官等多種組織中均有表達(dá)[31]，因此該基因可能與蛋殼品質(zhì)有關(guān)。趙凈穎等[32]也證實(shí)了CATH2表達(dá)量的雞種具有更高的免疫機(jī)能。JAKMIP1是一種與JAK激酶和微管相互作用的蛋白質(zhì)，在JAK家族介導(dǎo)的信號通路中起著重要作用[33-34]。當(dāng)細(xì)胞因子與受體結(jié)合后，受體上JAK激酶構(gòu)象改變并磷酸化，招募下游轉(zhuǎn)錄因子STAT磷酸化，使其以二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)[34]。研究表明，JAK-STAT信號通路參與細(xì)胞增殖，分化、遷移和凋亡等過程，對機(jī)體免疫防御，乳腺發(fā)育和泌乳，脂肪形成，兩性生長至關(guān)重要[35]。Zhang等[36]研究發(fā)現(xiàn)JAK-STAT信號通路參與雞生殖細(xì)胞體內(nèi)分化過程，尤其是對雄性生殖細(xì)胞的早期形成具有重要調(diào)控作用。Richard等[37]指出激活的JAK-STAT可通過影響AOX、FAS等酶的表達(dá)直接調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，在本研究中，JAKMIP1顯著上調(diào)，意味著獨(dú)龍雞卵母細(xì)胞中可能沉積了更多的卵黃物質(zhì)。本研究表明，ATP5I、ATP5E、COX5A、NDUFAB1、JAKMIP1、CATH2等可能在調(diào)節(jié)獨(dú)龍雞蛋品質(zhì)相關(guān)性狀和免疫反應(yīng)中起著重要作用，可作為重要的候選基因進(jìn)行深入研究。

4 結(jié) 論

本研究首次利用RNA-seq技術(shù)分析了獨(dú)龍雞和白來航雞的基因表達(dá)差異，然后通過富集分析工具GO、KEGG、STRING數(shù)據(jù)庫篩選了獨(dú)龍雞和白來航雞卵巢組織差異表達(dá)基因，其中RPL22、ATP5I、COX5A、JAKMIP1、CATH2基因主要富集在抗性、產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)相關(guān)通路中，可進(jìn)一步深入研究。本研究為獨(dú)龍雞后續(xù)基因功能、品種改良和種質(zhì)特性等研究奠定了基礎(chǔ)。