新城疫病毒M蛋白與宿主蛋白相互作用的研究進展

段志強，謝玲玲，陳佳琪，唐 宏，王燕碧，趙采芹，趙佳福

(1. 貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽 550025； 2.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025； 3. 貴州省種畜禽種質測定中心，貴陽 550018)

新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)屬于副黏病毒科、正禽腮腺炎病毒屬成員，是一種有囊膜、單股負鏈不分節(jié)段的RNA 病毒，其基因組編碼6種結構蛋白(NP、P、M、F、HN和L蛋白)和2種非結構蛋白(V、W蛋白)[1]。其中M蛋白主要位于病毒粒子囊膜內表面，構成病毒囊膜和核衣殼連接的支架[2]。研究表明，M蛋白是一種細胞核-細胞質穿梭蛋白：在病毒感染早期，M蛋白通過自身攜帶的核定位信號(nuclear localization signal, NLS)進入細胞核[3]，其主要功能是抑制細胞基因的轉錄以及調節(jié)細胞質中病毒基因組的復制和轉錄[4]；而在病毒感染后期，M蛋白則通過攜帶的核輸出信號(nuclear export signal, NES)進入細胞質[5]，在細胞膜內側參與子代病毒粒子的組裝和釋放[6]。近年來的研究還發(fā)現，M蛋白中存在多處功能性氨基酸基序或位點，能直接影響NDV的毒力和復制能力[7-10]。因此，M蛋白是一種多功能病毒蛋白，在NDV整個生活周期中具有重要作用。

和大多數病毒一樣，NDV基因組較小，不能編碼病毒復制所需的所有蛋白，為成功感染宿主并在宿主體內進行高效復制和擴散，通常需要與宿主蛋白進行緊密的相互作用，并利用宿主蛋白實現自身的復制。因此，鑒定與NDV病毒蛋白相互作用的宿主蛋白，對闡明NDV的復制和致病機制具有重要意義。目前，國內外已在M蛋白與NDV毒力和復制的關系[7-10]，以及以M蛋白為核心的病毒樣顆粒(virus-like particles, VLPs)形成和利用方面的研究上取得了較大的進展[11-13]，而對M蛋白與宿主蛋白相互作用調控NDV復制和致病性等方面的研究進展相對緩慢。鑒于M蛋白在NDV生活周期中的重要作用，本文主要從M蛋白的結構特征和細胞內定位特征，以及M蛋白與宿主蛋白相互作用的功能研究方面進行綜述，以期為更好地認識和研究M蛋白在NDV復制和致病性中的作用提供參考。

1 NDV M蛋白及其結構特征

Class I和Class II分支的NDV毒株M基因全長均為1 241 bp，開放閱讀框長度為1 095 bp，共編碼364個氨基酸，蛋白質分子量約為40 ku。M蛋白在NDV進化過程中是一個相對保守的病毒蛋白，從GenBank下載100株NDV M蛋白氨基酸序列進行比對分析，發(fā)現M蛋白之間的相似性可達95.3%～99.5%。對NDV M蛋白[以ZJ1毒株M蛋白(GenBank No. AAL18934.2)為例]氨基酸組成分析發(fā)現，M蛋白含有46個強堿性氨基酸、31個強酸性氨基酸、138個疏水性氨基酸和3 102個極性氨基酸。因此，M蛋白整體呈高度堿性且高度疏水性[14]。同時，M蛋白中也含有豐富的泛素化位點和磷酸化位點，其中K119和K260[15]以及K247[16]被證實存在泛素化修飾，這對M蛋白在細胞內完成細胞核-細胞質穿梭以及NDV VLPs的出芽與釋放有重要作用，但是M蛋白磷酸化位點及其功能的研究尚未見報道。另外，M蛋白中也含有較多的B細胞表位，其中，aa 42—56多肽序列可作為制備M蛋白單克隆抗體的良好免疫抗原[17]，而M蛋白aa 77—82和aa 354—363則可用于LaSota疫苗株與其他基因型重組NDV疫苗的血清學鑒別診斷[18]。

對NDV M蛋白二級結構分析發(fā)現，M蛋白含有13個α-螺旋(α1-α13)和14個β-折疊(β1-β14)(圖1A)。近年來，已有多個單股負鏈RNA病毒M蛋白的晶體結構被解析。對NDV M蛋白的X-射線晶體衍射(PDB登錄號：4G1L)分析發(fā)現，M蛋白主要以同源二聚體形式存在，形狀近似正方形(圖1B，左)；利用空間結構模型展示M蛋白表面電荷，可以發(fā)現M蛋白表面主要帶正電荷(藍色表示正電荷，紅色表示負電荷)(圖1B，右)[2]。對M蛋白單體進行分析發(fā)現，每個M蛋白單體包含大量的α-螺旋和β-折疊，并且均有兩個相似的折疊結構域，其氨基端和羧基端均包含一個β-三明治樣結構，并且各種α-螺旋位于這些β-三明治樣結構表面(圖1 C)[2]。研究表明，NDV M蛋白羧基端aa 266—280能形成特異的折疊結構與細胞脂質雙分子膜結合[19]，該折疊結構主要由2個α-螺旋(α12和α13)包裹2個反向平行的β-折疊(β13和β14)形成。最近Shtykova等[20]利用X-射線小角散射方法研究M蛋白在中性和酸性pH條件下的晶體結構，結果發(fā)現中性pH條件下的M蛋白二聚體可以形成四聚體，類似于絲狀NDV病毒粒子大小的蛋白螺旋寡聚體，從而允許在沒有其他病毒蛋白存在時，M蛋白形成膜面曲率完成VLPs的出芽；而在酸性pH下的M蛋白寡聚化趨勢減少，這一發(fā)現解釋了NDV通過內吞途徑進入宿主細胞時，可能是通過加速M蛋白的支架解體來促進病毒核衣殼釋放到細胞質[21-22]。

A. NDV M蛋白二級結構示意圖，其包含的α-螺旋和β-折疊分別用紅色和藍色字體表示；B. NDV M蛋白兩個單體(藍色和金色)用帶狀圖表示(左圖)，其表面正電荷和負電荷分別用藍色和紅色標出(右圖)；C. NDV M蛋白單體結構帶狀圖的立體結構示意圖，單體包含兩個相似的β-三明治樣結構域(洋紅色)，兩側有許多α-螺旋(藍綠色)(左圖)；M蛋白單體二級結構示意圖(右圖)A. The secondary structure diagram of NDV M protein, with the α-helices and β-folds shown in red and blue fonts. B. The two monomers (blue and gold) of NDV M protein are shown as a ribbon diagram (Left). The surface charge is represented on a space-filling model (Right), with the positively charged regions shown in blue and the negatively charged regions in red. C. The ribbon drawing of the monomeric structure of NDV M protein shown as a stereo diagram. The M protein monomer contains two similarly folded β-sandwich domains (magenta) that are flanked by several α-helices (cyan) (Left). A schematic diagram representing the secondary structure elements of the M protein monomer (Right)圖1 NDV M蛋白二級和三級結構示意圖[2]Fig.1 The schematic diagram of secondary and tertiary structures of NDV M protein[2]

2 NDV M蛋白細胞內定位特征

早在1988年，研究人員利用單克隆抗體檢測NDV M蛋白在細胞內的分布時，發(fā)現M蛋白具有細胞核定位特征[23]。隨后Peeples等[24]研究發(fā)現，雖然不同毒力NDV感染細胞后的M蛋白分布有所差異，但是在病毒感染早期M蛋白均定位在細胞核和核仁，并且這種定位不依賴于其他病毒蛋白的參與。近年來，研究人員利用綠色熒光蛋白標記的方法研究發(fā)現，M蛋白在早期定位在細胞核和核仁，而在后期則分布在細胞質和細胞膜[25]。另外，研究證實M蛋白在細胞膜內側通過與HN、F和NP蛋白發(fā)生相互作用，來完成VLPs的組裝和出芽[6]。因此，NDV M蛋白在細胞內具有細胞核-細胞質穿梭特征。

有研究表明，分子量小于50 ku的蛋白質可以通過自由擴散的方式穿過核孔復合體。然而研究發(fā)現，雖然猿猴空泡病毒40(Simian virus 40, SV40)的大T抗原分子量小于50 ku，但它卻能通過由多個堿性氨基酸組成的NLS(126PKKKRKV132)進入細胞核[26]，并且這一現象也在非洲爪蟾核質蛋白的細胞核定位研究中得到證實[27]。隨后，研究人員還發(fā)現許多小分子量的蛋白質還可以通過由疏水性氨基酸(如亮氨酸L、異亮氨酸I和纈氨酸V等)組成的NES進入細胞質[28]。因此，由NLS和NES介導的蛋白質完成細胞核-細胞質穿梭受到越來越多的關注。NDV M蛋白的分子量為40 ku，但是研究人員通過多序列比對分析和氨基酸點突變試驗證實，M蛋白(ZJ1株)中存在1個由兩簇堿性氨基酸組成的NLS[3]和3個由疏水性氨基酸組成的NES[5](表1)，分別介導M蛋白的細胞核-細胞質穿梭。另外，M蛋白還具有核仁定位特征，其中aa 30—60可能是M蛋白的假定核仁定位信號(putative nucleolar localization signal, pNoLS)[29](表1)。

表1 NDV M蛋白攜帶的定位信號

3 NDV M蛋白與宿主蛋白相互作用的功能研究進展

3.1 M蛋白與宿主蛋白互作促進腫瘤細胞的凋亡

NDV具有溶瘤特性且不感染人，能刺激腫瘤細胞產生抗腫瘤免疫應答，因而在抗腫瘤治療方面具有良好的研究價值和應用前景[30]。有研究證實，NDV在細胞中的快速復制會激活ATM依賴的雙鏈DNA斷裂(DNA double-strand break, DSB)反應，并且NDV強毒株F和HN蛋白在協同誘導細胞膜融合過程中激活ATM依賴的DSB反應，進而促進NDV靶向殺傷腫瘤細胞[31-32]。另外，NDV NP和P蛋白引起的細胞自噬和內質網應激在抑制腫瘤細胞增殖方面也發(fā)揮了重要作用[33]。在病毒M蛋白誘導細胞凋亡研究方面，研究人員發(fā)現水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)M蛋白第51位氨基酸介導的線粒體途徑可以誘導腫瘤細胞凋亡[34]，而狂犬病病毒(rabies virus, RABV)M蛋白第95位氨基酸能通過caspase依賴和非依賴的兩種途徑誘導腫瘤細胞凋亡[35]。對NDV M蛋白的研究發(fā)現，在腫瘤細胞中表達M蛋白可以誘導腫瘤細胞凋亡，并且使促凋亡蛋白Bax重新分布在線粒體；進一步的分析發(fā)現M蛋白氨基端區(qū)域(aa 23—37)存在一個Bcl-2同源域3(Bcl-2 homology 3, BH3)類似結構域，該結構域的缺失導致M蛋白誘導腫瘤細胞凋亡能力下降[36]。另外，免疫共沉淀試驗結果表明M蛋白通過BH3結構域與Bax蛋白發(fā)生相互作用[36]，因而證實NDV M蛋白與Bax蛋白相互作用可以促進腫瘤細胞的凋亡。

3.2 M蛋白與宿主蛋白互作促進病毒基因組的復制和轉錄

多種副黏病毒如尼帕病毒(Nipah virus, NiV)、亨德拉病毒(Hendra virus, HeV)、仙臺病毒(Sendai virus, SeV)、麻疹病毒(measles virus, MeV)和NDV，以及單股負鏈RNA 病毒如VSV和呼吸道合胞體病毒(respiratory syncytial virus, RSV)的M蛋白在病毒感染期間均能定位在細胞核，其主要功能是抑制宿主細胞基因的轉錄以及調節(jié)病毒基因組在細胞質中的復制和轉錄[4, 37-41]。目前，對于副黏病毒M蛋白與何種宿主蛋白相互作用調節(jié)病毒基因組的復制和轉錄報道較少。溴結構域包含蛋白2(bromodomain-containing protein 2, BRD2)是含溴結構域和額外終端結構域(bromodomain and extra-terminal domain, BET)家族蛋白成員之一，主要位于細胞核，在細胞周期調控、基因轉錄調節(jié)、抗病毒免疫應答等方面具有重要作用[42-44]。本課題組近期研究發(fā)現NDV M蛋白與雞BRD2蛋白在細胞核中存在相互作用，這種互作主要是通過M蛋白C-端區(qū)域(aa 264—313)結合雞BRD2蛋白C-端ET結構域(aa 619—683)進行的；進一步研究發(fā)現M蛋白能以劑量依賴的方式降低雞胚成纖維細胞(DF-1)內BRD2基因的轉錄，并且干擾DF-1細胞中BRD2蛋白的表達，能顯著上調NDV基因組的復制和轉錄水平，而在細胞內過表達BRD2基因則得到相反的結果[45]。因此，M蛋白與雞BRD2蛋白相互作用通過降低BRD2基因的表達和促進NDV基因組的復制和轉錄，進而增強NDV的復制能力和致病性，這也增加了對BRD2蛋白功能的認識。

3.3 M蛋白與宿主蛋白互作促進M蛋白的細胞核和核仁定位

蛋白質進行細胞核-細胞質穿梭除了需要自身攜帶的NLS和NES，還需要與細胞內的核轉運受體蛋白(如importin α、importin β、CRM1、exportin-t等)發(fā)生相互作用[46-47]。本課題組利用酵母雙雜交系統從DF-1細胞cDNA文庫中篩選到importin β1與NDV M蛋白存在相互作用，進一步的試驗證實M蛋白通過其NLS與importin β1發(fā)生相互作用，并且在RanGTP的幫助下進入細胞核[48]。另外，研究還發(fā)現importin α5可以與importin β1相互作用形成importin α5/importin β1/M三元復合物，降低M蛋白的入核效率，進而影響NDV的復制和致病性[48]。CRM1是一種核輸出受體蛋白，能與大多數NES相互作用，使蛋白質由細胞核進入細胞質[49]。有研究發(fā)現NDV M蛋白攜帶3個NES，但是CRM1抑制劑并不能降低NES的核輸出能力，也不影響NDV的復制和致病性，說明M蛋白進入細胞質不依賴于CRM1[5]。因此，M蛋白的核輸出受體蛋白還有待于進一步研究。

研究表明，核仁是真核生物細胞核中最為明顯的結構，大多數病毒蛋白能夠定位在核仁來促進病毒的復制[50-51]，其中核磷蛋白B23、核仁素蛋白C23和核仁纖維蛋白是核仁蛋白中最為豐富的三個蛋白，它們在病毒蛋白進入核仁中發(fā)揮著重要作用[52-54]。NDV M蛋白具有明顯的核仁定位特征[24-25]，研究人員利用酵母雙雜交技術發(fā)現M蛋白與核磷蛋白B23存在相互作用，并且M蛋白aa 30—60與核磷蛋白B23 aa 188—245是相互作用區(qū)域；干擾DF-1細胞內核磷蛋白B23的表達不僅減少了M蛋白的核仁定位，而且顯著減弱了NDV的復制效率和致病性[29]。另外，熒光共定位試驗結果表明，在NDV感染早期M蛋白與核磷蛋白B23具有明顯的核仁定位，但是在NDV感染后期M蛋白表現為細胞核和細胞質定位，而核磷蛋白B23卻由核仁定位轉變?yōu)楹速|定位[29]。因此，NDV M蛋白通過與核磷蛋白B23相互作用進入核仁，但是M蛋白在核仁中可能會破壞核磷蛋白B23的結構和功能來影響細胞蛋白的翻譯，以此促進NDV的復制和致病性[55]。

3.4 M蛋白與宿主蛋白互作促進病毒粒子的組裝和出芽

研究人員在SeV和MeV病毒粒子中發(fā)現有細胞骨架蛋白存在，推測細胞骨架蛋白參與了副黏病毒的組裝和出芽[38]。早期有研究發(fā)現，NDV M蛋白與細胞骨架蛋白actin存在直接的相互作用[56]，但是兩者互作在NDV組裝和出芽中的作用卻未見報道。后來Ren等[57]對雞胚尿囊液中的NDV純化后進行蛋白質組學分析，發(fā)現NDV病毒粒子中有大量的細胞骨架蛋白存在，如actin、ARP2、ARP3、tubulin、ANXA2等。最近，Koga等[58]報道了同為副黏病毒成員的MeV，其M蛋白與細胞骨架蛋白ANXA2存在相互作用；干擾ANXA2的表達不僅減少M蛋白在細胞膜內側的分布，而且降低了病毒的出芽效率，結果說明M蛋白與ANXA2的相互作用有助于MeV的組裝和出芽。本課題組近期利用免疫共沉淀方法發(fā)現NDV M蛋白與ANXA2存在相互作用，并且干擾ANXA2的表達降低了NDV的復制能力和出芽效率(結果待發(fā)表)，暗示了M蛋白與ANXA2的相互作用可能在NDV組裝和出芽過程中具有重要作用。

對囊膜病毒的出芽機制進行研究發(fā)現，囊膜病毒蛋白中存在晚期結構域，并且通過招募宿主細胞空泡蛋白分選(vacuolar protein sorting, VPS)系統形成內體分選轉運蛋白復合體(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)實現病毒的出芽[59-60]。NDV M蛋白具有與副流感病毒5型(parainfluenza virus 5, PIV5)和腮腺炎病毒(mumps virus, MuV)M蛋白相似的FPIV晚期結構域，這對M蛋白的出芽和病毒的復制至關重要，并且M蛋白的出芽還需要宿主細胞ESCRT的參與[61]，但是M蛋白與宿主蛋白的相互作用參與NDV的出芽報道較少。帶電的多泡體蛋白(charged multivesicular body proteins, CHMPs)是ESCRT-III的主要成分，主要參與表面受體蛋白的降解和內吞多泡體的形成[62]。Li等[63]研究證實CHMP4B與M蛋白在細胞質存在相互作用，在細胞中干擾CHMP4B的表達或過表達CHMP4B/C蛋白均能顯著抑制NDV的復制，表明M蛋白與CHMP4B蛋白相互作用調節(jié)NDV的出芽過程。因此，研究M蛋白與宿主蛋白的相互作用，對深入認識宿主蛋白調控病毒的組裝和出芽機制具有重要意義。

3.5 M蛋白與宿主蛋白互作參與NDV的免疫逃避

M蛋白抑制宿主免疫應答已在多種RNA病毒中被報道，如RABV M蛋白能通過結合RelAp43蛋白來抑制NF-κB信號通路產生炎性細胞因子[64]；VSV M蛋白在小鼠L929細胞中能分別抑制NF-κB活性和干擾素應答反應[65]；最近研究人員發(fā)現新型嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型M蛋白能指引細胞自噬標志物LC3轉位到線粒體顯著削弱Ⅰ型干擾素的產生，而無法與LC3互作的M蛋白突變體則表現出較弱的干擾素拮抗效應，表明M蛋白能通過促進線粒體自噬拮抗宿主固有免疫反應[66]。王蕾等[67]最早報道了NDV M蛋白能抑制宿主細胞表達促炎性細胞因子，進而抑制宿主免疫應答來促進NDV的復制。本課題組最新的研究發(fā)現NDV M蛋白在細胞質中能以劑量依賴的方式降低具有叉頭相關結構域的TRAF相互作用蛋白[TNF receptor associated factor (TRAF)-interacting protein with a Forkhead-associated (FHA) domain, TIFA]的表達，并且通過抑制TIFA/TRAF6/NF-κB信號通路產生炎性細胞因子促進NDV的復制[68]，因而首次揭示了M蛋白參與了NDV的免疫逃避。

Viperin是一種干擾素誘導蛋白，從低等脊椎動物到高等哺乳動物均表現出高度的保守性，主要參與宿主抗病毒的先天性免疫應答，對許多病毒都具有抗病毒作用[69-70]。Shah等[71]研究發(fā)現雞viperin蛋白具有抵抗NDV感染的作用，利用反向遺傳操作技術在NDV基因組中表達雞viperin蛋白，能明顯降低NDV的復制和致病性；進一步通過生物信息學分析和免疫共沉淀試驗證實NDV M蛋白與雞viperin蛋白存在相互作用。該研究結果表明，M蛋白通過與viperin蛋白發(fā)生相互作用，降低宿主對NDV的抗病毒免疫應答，這有利于NDV在宿主體內的復制。另外，有研究表明，酸性亮氨酸核磷酸蛋白32B(acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32B, ANP32B)可作為免疫調節(jié)器參與宿主免疫應答，在抗病毒感染方面發(fā)揮著一定的作用[72]。最近，Günther等[73]研究報道了ANP32B蛋白可以與多種副黏病毒(包括NiV、HeV、SeV、NDV和犬瘟熱病毒)M蛋白發(fā)生相互作用，其中NiV和HeV M蛋白均以ANP32B蛋白依賴的方式進入細胞核，但是ANP32B蛋白與M蛋白相互作用在NDV以及其他副黏病毒復制中的作用還有待進一步研究。因此，以上研究結果表明NDV M蛋白在參與病毒免疫逃避和促進病毒復制方面具有重要作用。

4 展 望

NDV M蛋白與其他副黏病毒(如SeV、MeV、NiV和HeV)和單股負鏈RNA病毒(如VSV和RSV)M蛋白均具有相同的細胞內定位特征和功能[4, 37-41]，這就決定了M蛋白需要與多種宿主蛋白相互作用來發(fā)揮其功能。目前，雖然對NDV M蛋白與宿主蛋白相互作用的功能有了一定的認識，但相比其他副黏病毒和單股負鏈RNA病毒M蛋白的研究仍不夠深入。近些年來的研究表明，VSV M蛋白在細胞核中與宿主蛋白Rae1和Nup98相互作用形成復合物，能有效地抑制細胞基因轉錄和阻止細胞mRNA的核輸出[74-75]；而M蛋白在細胞質中能與LMP2相互作用干擾細胞免疫蛋白酶體的形成，進而使VSV逃避宿主免疫系統的監(jiān)視[76]，同時M蛋白也可以與真核細胞翻譯起始因子3i相互作用促進VSV基因組的轉錄，并通過抑制細胞干擾素刺激基因的表達來促進VSV的復制[77]。另外，研究發(fā)現PIV5 M蛋白與血管抑素結合蛋白1(angiomotin-like 1, AmotL1)相互作用能促進病毒的感染和病毒粒子的釋放[78]；進一步的研究發(fā)現AmotL1蛋白可將M蛋白連接到NEDD4泛素連接酶家族成員上，這對促進PIV5子代病毒粒子的釋放具有重要作用[79]。因此，上述相關研究結果為深入研究NDV M蛋白與宿主蛋白相互作用的功能提供了借鑒和參考。

目前，基于免疫共沉淀結合蛋白質譜鑒定的方法已經篩選到多種與NDV M蛋白相互作用的宿主蛋白[15, 80]，主要涉及細胞骨架蛋白、核轉運受體蛋白、核孔復合物蛋白、蛋白質合成相關蛋白、E3泛素連接酶相關蛋白、細胞凋亡相關蛋白和免疫相關蛋白等。這些宿主蛋白與已經報道的NDV M蛋白功能有關，但是還需要進一步的相互作用驗證和功能研究。另外，除了已報道的宿主蛋白importin β1和BRD2與NDV M蛋白相互作用能促進M蛋白的細胞核定位和病毒基因組復制與轉錄以外[45, 48]，本課題組前期利用酵母雙雜交系統還篩選到3種與NDV M蛋白相互作用的宿主蛋白(包括真核細胞翻譯延伸因子2、絲氨酸和精氨酸剪接因子3和核基質蛋白3)[48]，其中核基質蛋白3和BRD2均參與了細胞基因的轉錄，并且兩者還存在相互作用[43]，暗示M蛋白與核基質蛋白3和BRD2可以形成復合物，因此三者之間的相互作用對NDV復制和致病性的影響及其作用機制也值得深入研究。總之，開展與NDV M蛋白相互作用宿主蛋白的鑒定和功能研究不僅有助于拓展M蛋白的功能，而且對深入認識M蛋白在NDV復制和致病性中的作用具有重要意義。