內(nèi)標(biāo)法測定養(yǎng)正消積膠囊中黃芪甲苷含量

王一波，張 燦，李曉鵬，張永鋒,4，李文烈,4，柏艷柳,4*

（1.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050035；2.河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050035）；3.絡(luò)病研究與創(chuàng)新中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗室，河北 石家莊 050035； 4.石家莊市復(fù)方中藥技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050035；

養(yǎng)正消積膠囊是石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司研制的復(fù)方中藥，主要用于健脾益腎、化瘀解毒。適用于不宜手術(shù)的脾腎兩虛、淤毒內(nèi)阻型原發(fā)性肝癌輔助治療等[1]。處方由黃芪、女貞子、人參等十六味藥組成?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2020年版一部，標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項目為女貞子中的齊墩果酸和熊果酸[1]。方中藥味黃芪中的黃芪皂苷類有效成分有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用[2-4]，以黃芪甲苷為代表成分。為了更好地控制養(yǎng)正消積膠囊中黃芪甲苷含量，本研究參考中國藥典[1]及相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]，采用高效液相-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）法對其進(jìn)行含量測定，但ELSD的影響因素較多，且本方中黃芪甲苷含量限度較低，因此穩(wěn)定性會受到影響。采用內(nèi)標(biāo)法[8-9]，可避免因樣品前處理及進(jìn)樣體積誤差對測定結(jié)果的影響，因此本文采用內(nèi)標(biāo)法，建立HPLC-ELSD測定養(yǎng)正消積膠囊中黃芪甲苷含量的方法，有利于控制該藥品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 高效液相色譜儀（美國Waters公司，Waters 2695 Separations Module，Waters 2998 Photodiode Array Detector， Waters 2424 ELS Detector）；AT-201電子分析天平（Mettler Toledo公司）；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)；KQ250B型超聲波清洗儀（250 W，40 kHz）。

1.2 試藥

黃芪甲苷對照品（批號：110781-201717）、木蘭脂素對照品（批號：110882-201708）均來源于中國食品藥品檢定研究院；養(yǎng)正消積膠囊6批次（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～18 min，33 % A；18～30 min，33 %→65 % A；30～32 min，65 % A；32～37 min，65 %→90 % A；37～38 min，90 %→33 % A；38～48 min，33 % A）；流速：1.0 ml/min；蒸發(fā)光散射檢測器（漂移管溫度70 ℃，氣體壓力25 psi）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)儲備液制備 取木蘭脂素對照品適量，制成每1 ml含木蘭脂素0.30 mg的甲醇溶液，作為內(nèi)標(biāo)儲備液。

2.2.2 黃芪甲苷儲備液制備 取黃芪甲苷對照品適量，制成每1 ml含黃芪甲苷0.20 mg的甲醇溶液，作為黃芪甲苷儲備液。

2.2.3 對照品溶液制備 精密量取上述內(nèi)標(biāo)儲備液和黃芪甲苷儲備液適量，分別制成每1 ml含木蘭脂素60 μg、黃芪甲苷40 μg的70 %甲醇的低濃度對照品溶液和每1 ml含木蘭脂素60 μg、黃芪甲苷120 μg的70 %甲醇的高濃度對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液25 ml，水浴蒸干，殘渣加水25 ml溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次25 ml，合并正丁醇液，先用1 % NaOH溶液洗滌3次，每次20ml，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次25 ml，合并正丁醇液，正丁醇液中精密加入內(nèi)標(biāo)儲備液1 ml，蒸干，殘渣加70 %甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶，搖勻，濾過，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

按養(yǎng)正消積膠囊處方比例及工藝制備不含黃芪的陰性樣品，按2.3項下供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，依法進(jìn)行檢測，見圖1。結(jié)果表明，供試品溶液色譜圖中，在與黃芪甲苷和木蘭脂素色譜峰相應(yīng)位置上，有相同保留時間的色譜峰；而陰性樣品溶液在此保留時間處無干擾，即該方法專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖

2.5.2 線性關(guān)系考察 取黃芪甲苷及木蘭脂素對照品適量，精密稱定，分別制得含黃芪甲苷濃度為25.13，41.88，62.82，83.76，125.64 μg/ml及含木蘭脂素濃度為60.78 μg/ml的5個不同濃度的對照品混合溶液。精密吸取20 μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，以（ln黃芪甲苷峰面積/ln木蘭脂素峰面積）為縱坐標(biāo)，以（ln黃芪甲苷濃度/ln木蘭脂素濃度）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為：y=0.4934x-0.4474，r=0.9999。結(jié)果表明：黃芪甲苷與木蘭脂素濃度的對數(shù)比在0.7849～1.1768范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5.3 精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷和木蘭脂素混合對照品溶液及同一份供試品溶液，各進(jìn)樣5次，測定黃芪甲苷峰面積和木蘭脂素峰面積，計算其二者的峰面積的對數(shù)比。結(jié)果：對照品峰面積對數(shù)比的RSD值為0.15 %，供試品中峰面積對數(shù)比的RSD值為0.18 %，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取黃芪甲苷和木蘭脂素混合對照品溶液及同一份供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，24 h進(jìn)樣測定。均以黃芪甲苷峰面積和木蘭脂素峰面積的對數(shù)比的RSD進(jìn)行分析。結(jié)果：在24 h內(nèi)，對照品峰面積對數(shù)比和供試品峰面積對數(shù)比的RSD值分別為0.64 %和0.58 %，表明對照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，分別取高、中、低3個樣品量，每個樣品量3份，按2.3項下供試品溶液的制備方法，分別進(jìn)行提取，制備，照上述色譜條件測定，計算黃芪甲苷含量。結(jié)果黃芪甲苷平均含量為0.2052 mg/g，RSD值為2.88 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.6 回收率試驗 取已知含量的同一批樣品約1 g，共9份，精密稱定，分為3組，分別精密加入高、中、低濃度的黃芪甲苷對照品甲醇溶液50 ml，按2.3”項下供試品溶液的制備方法，分別進(jìn)行提取，制備，照上述色譜條件測定，計算回收率，黃芪甲苷的平均回收率為98.99 %，RSD為2.78 %。結(jié)果表明，方法的準(zhǔn)確度良好。具體結(jié)果見表1。

2.5.7 樣品測定 用所制定的含量測定方法，對6批樣品進(jìn)行含量測定，結(jié)果6批樣品中黃芪甲苷含量分別為0.0806，0.0734，0.0938，0.0645，0.0949，0.0638 mg/粒。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測器及內(nèi)標(biāo)法的選擇

由于黃芪甲苷為末端吸收，且響應(yīng)值較低，因此采用紫外檢測器干擾較大。ELSD是一種通用的質(zhì)量型檢測器，能檢測到半揮發(fā)性或不揮發(fā)性的化合物。ELSD的影響因素較多，因此穩(wěn)定性會受到影響，且本方中黃芪甲苷含量限度較低，曾采用HPLC-ELSD法對方中黃芪甲苷進(jìn)行含量測定，針對同一供試品，在同一天內(nèi)不同間隔時間內(nèi)進(jìn)行多次測定，含量測定結(jié)果差異很大。而采用本文中的內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測定后，重復(fù)性結(jié)果RSD能達(dá)到2.88 %?？紤]到以上因素，采用內(nèi)標(biāo)法檢測方中的黃芪甲苷含量。

3.2 內(nèi)標(biāo)物及流動相選擇

對于內(nèi)標(biāo)物的選擇，一般原則是：內(nèi)標(biāo)物應(yīng)與待測物分子結(jié)構(gòu)相近，在色譜圖中內(nèi)標(biāo)物在待測物附近出峰；樣品中不存在內(nèi)標(biāo)物，且內(nèi)標(biāo)物與待測物分離完全；內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是 純 物 質(zhì)；內(nèi)標(biāo)物與樣品互溶，且不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[10]。本文考察了甘草酸銨、白花前胡乙素、木蘭脂素等一系列化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的化合物，在乙腈-水（33:67）的色譜條件下，只有木蘭脂素的保留時間與黃芪甲苷最接近，但兩者保留時間相差仍較大，為了避免儀器的不穩(wěn)定性所造成的靈敏度差異，后采用梯度洗脫的方法，使木蘭脂素和黃芪甲苷保留時間適中，并且與雜質(zhì)峰得到較好的分離，因此選擇木蘭脂素為內(nèi)標(biāo)，以乙腈-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

3.3 供試品制備方法選擇

取供試品經(jīng)甲醇超聲提取，取濾液蒸干，殘渣加水溶解后，考察了水層用水飽和的正丁醇萃取不同次數(shù)；對正丁醇液采用堿洗和水洗；并且對堿層進(jìn)行反萃。根據(jù)考察結(jié)果確定了正文中的供試品制備項下的萃取方法。供試品制備方法中的提取溶劑用量及超聲時間也均經(jīng)考察確定。

3.4 方法耐用性試驗

取同一份供試品，對本方法柱溫、不同色譜柱、蒸發(fā)光氣體流速、漂移管溫度等均進(jìn)行了耐用性試驗考察，結(jié)果表明，各條件發(fā)生微小的變動對黃芪甲苷的含量測定結(jié)果無顯著性影響。

3.5 結(jié)論

本研究建立了養(yǎng)正消積膠囊中黃芪甲苷的含量測定方法，考察了供試品制備方法、內(nèi)標(biāo)物的選擇、方法的重復(fù)性及回收率等，并對ELSD檢測器等的參數(shù)等進(jìn)行了耐用性考察，結(jié)果均良好。使用該內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行含量測定后，對于黃芪甲苷ELSD檢測器產(chǎn)生的不穩(wěn)定情況得到了解決，此法適用于養(yǎng)正消積膠囊中黃芪甲苷的含量測定。