雷公藤甲素誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡的研究

劉夢(mèng)威 楊建霖 白明月 陳小剛

腎癌是最常見(jiàn)的十種癌癥之一，占所有癌癥的2%，且全球發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。目前腎部分切除術(shù)是治療臨床分期T1a期腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，而根治性腎切除術(shù)則是臨床分期T1b～T4期腫瘤治療的首選[2-4]。近年來(lái)，腎癌的治療策略取得了一些進(jìn)展，包括放療、化療及靶向治療，然而大多數(shù)接受治療的患者由于獲得性耐藥而發(fā)展為進(jìn)展性疾病[5]。因此，闡明腎癌進(jìn)展的分子機(jī)制至關(guān)重要，這可能有助于開(kāi)發(fā)腎癌新的治療策略與預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。

雷公藤是一種傳統(tǒng)的中草藥，屬于衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，其主要生物活性成分包括雷公藤甲素、萜類(lèi)化合物、木脂素、糖苷和生物堿等。雷公藤甲素具有強(qiáng)大的抗腫瘤、免疫抑制和抗炎活性，在過(guò)去幾十年里，雷公藤甲素因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和豐富的藥理活性在有機(jī)化學(xué)和藥物化學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注[6]。雷公藤甲素及其前體藥物米奈爾內(nèi)酯通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡在治療各種人類(lèi)腫瘤，包括實(shí)體和非實(shí)體腫瘤方面具有廣闊的應(yīng)用前景[7]。同時(shí)，通過(guò)設(shè)計(jì)和合成各種生物活性探針，確定了雷公藤甲素具有多種藥理活性和毒性的分子靶點(diǎn)，其治療潛力已進(jìn)行了臨床前評(píng)估，其臨床應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)之上的一門(mén)新興學(xué)科。在“疾病-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，揭示疾病治療的潛在靶點(diǎn)，闡明藥物的分子機(jī)制[8-9]。本文通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接和泛癌分析的方法，探究雷公藤甲素誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

雷公藤甲素購(gòu)自MedChemExpress生物公司；血清、培養(yǎng)液、青霉素購(gòu)自Thermo Fisher公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V-PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自武漢恩格雅生物科技有限公司；ACHN細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)武漢典型培養(yǎng)物保藏中心；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美谷生物公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器有限公司。

細(xì)胞活力檢測(cè)：顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌ACHN細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。96孔板每孔接種8 000個(gè)細(xì)胞，在5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12～16 h。用培養(yǎng)液將雷公藤甲素分別配成濃度為25、50和100 nmol/L的混合液備用。棄去96孔板中原有培養(yǎng)液，加入25、50和100 nmol/L三種不同濃度的混合液設(shè)置為不同雷公藤甲素濃度的實(shí)驗(yàn)組，加入等量的二甲基亞砜設(shè)置為對(duì)照組，放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h后吸出藥物培養(yǎng)基混合液。將90 μl無(wú)血清培養(yǎng)液與10 μl MTT溶液 (5 mg/ml)混合均勻制成MTT混合液后加入96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h。待測(cè)孔中每孔加入100 μl 甲瓚溶解液，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)待測(cè)孔的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞活力。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ACHN細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，6孔板每孔加入3×105個(gè)ACHN細(xì)胞，并加入培養(yǎng)液配成2 ml體系，放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h后，加入雷公藤甲素使每孔內(nèi)的雷公藤甲素濃度為50 nmol/L并設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組，加入等量的二甲基亞砜設(shè)置為對(duì)照組，放進(jìn)細(xì)培養(yǎng)箱再培養(yǎng)24 h。收集藥物處理完畢后的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。取5×105個(gè)細(xì)胞，4 ℃、300 g離心5 min。棄上清，將細(xì)胞團(tuán)用1 ml預(yù)冷的PBS輕輕混勻，4 ℃、300 g離心5 min，棄上清，重復(fù)用PBS洗滌一次。用100 μl的Binding Buffer將細(xì)胞團(tuán)混勻。在懸液中加入5 μl Annexin V-FITC染料與5 μl PI染液，輕輕混勻，室溫避光條件反應(yīng)15 min。在懸液中加入400 μl Binding Buffer混勻后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Flowjo軟件進(jìn)行分析。

二、靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)PharmMapper(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)和Super-PRED(https://prediction.charite.de/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行雷公藤甲素靶點(diǎn)的篩選后取并集。使用UniProt(www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)雷公藤甲素靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范化處理。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genecards.org/)、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(therapeutic target database, TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)、孟德?tīng)柸祟?lèi)遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man, OMIM)(http://omim.org/)和藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(the pharmacogenomics knowledgebase, PharmGKB)(https://www.pharmgkb.org)中檢索腎癌靶點(diǎn)，取以上數(shù)據(jù)庫(kù)所得靶點(diǎn)的并集獲取總靶點(diǎn)。利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制韋恩圖，獲取雷公藤甲素-腎癌交集靶點(diǎn)。使用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“雷公藤甲素-靶點(diǎn)-腎癌”網(wǎng)絡(luò)。

三、蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

將雷公藤甲素-腎癌交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)中進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)后利用Cytoscape 3.8.0進(jìn)行可視化分析并篩選出雷公藤甲素-腎癌核心靶點(diǎn)。

四、基因本體論(gene ontology, GO)生物過(guò)程分析以及京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)信號(hào)通路富集分析

將雷公藤甲素-腎癌交集靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，在Image GP(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/)中作富集分析氣泡圖并將交集靶點(diǎn)富集的通路利用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建“通路-靶點(diǎn)”圖。

五、分子對(duì)接

選取PPI中度值前14的核心靶點(diǎn)用于分子對(duì)接，通過(guò)Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載配體2D結(jié)構(gòu)，在ChemBio3D 2019軟件中優(yōu)化并導(dǎo)出3D結(jié)構(gòu)，在PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載受體，再通過(guò)Pymol 4.6.0對(duì)蛋白質(zhì)去水、去殘基保存為PDB格式。在Autodock 1.5.7軟件中進(jìn)行分子對(duì)接得到結(jié)合構(gòu)象，通過(guò)Pymol 2.5.2進(jìn)行可視化處理。

六、泛癌及生存曲線分析

利用Sangerbox3.0(http://www.sangerbox.com/home.html)網(wǎng)站工具，對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行泛癌分析研究。該網(wǎng)站從加州大學(xué)圣克魯茲分校(university of california santa cruz，UCSC)(https://xenabrowser.net/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了核心靶點(diǎn)蛋白在腎乳頭狀細(xì)胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma, KIRP)、腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma, KIRC)、腎嫌色細(xì)胞癌(kidney chromophobe, KICH)等三種腫瘤中的表達(dá)數(shù)據(jù)。利用該網(wǎng)站和R軟件(版本 3.6.4)計(jì)算核心靶點(diǎn)在腫瘤組織與正常組織之間的表達(dá)差異，使用非配對(duì)威爾科克森秩和檢驗(yàn)和符號(hào)秩和檢驗(yàn)計(jì)算腫瘤組織和正常組織之間表達(dá)差異的顯著性，P<0.01且表達(dá)倍數(shù)變化值≥2被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

我們利用基因表達(dá)譜交互分析(gene expression profiling interactive analysis， GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)的單基因分析功能研究核心靶點(diǎn)的表達(dá)對(duì)KIRP、KICH、KIRC三種類(lèi)型腎癌患者存活率的影響并繪制生存曲線。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1，不同濃度雷公藤甲素處理后的實(shí)驗(yàn)組ACHN細(xì)胞與對(duì)照組ACHN細(xì)胞相比，細(xì)胞活力均有所降低且細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著雷公藤甲素藥物濃度的增加，ACHN細(xì)胞逐漸喪失活力，當(dāng)雷公藤甲素的濃度達(dá)到50 nmol/L時(shí)，ACHN細(xì)胞的活力明顯下降。

A：不同雷公藤甲素濃度ACHN細(xì)胞活力的變化；B：在雷公藤甲素濃度為50 nmol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比ACHN細(xì)胞的存活率(***表示P<0.001)圖1 ACHN細(xì)胞24 h MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為探討以上MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們采用Annexin V-FITC和PI雙染色檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組(雷公藤甲素濃度為50 nmol/L)ACHN細(xì)胞的凋亡。如圖2，位于右下象限的細(xì)胞為單獨(dú)陽(yáng)性屬于早期凋亡，位于右上象限的細(xì)胞為雙陽(yáng)性屬于晚期凋亡。以上結(jié)果證實(shí)雷公藤甲素劑量依賴(lài)性地降低腎癌ACHN細(xì)胞的活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

A：對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組ACHN細(xì)胞的凋亡實(shí)驗(yàn)；B：對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組早期凋亡、晚期凋亡與總凋亡之間的差異(**表示P<0.01)圖2 ACHN細(xì)胞24 h凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

二、雷公藤甲素及腎癌靶點(diǎn)的篩選及可視化分析

在PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)和Super-PRED數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲取到282個(gè)和132個(gè)雷公藤甲素相關(guān)靶點(diǎn)，對(duì)以上靶點(diǎn)取并集后獲得總靶點(diǎn)396個(gè)，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)雷公藤甲素靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范化處理后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“雷公藤甲素-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)有397個(gè)節(jié)點(diǎn)，396條邊。在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得腎癌靶點(diǎn)111個(gè)，TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得腎癌靶點(diǎn)60個(gè)，Pharm-GKB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得腎癌靶點(diǎn)29個(gè)，GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“相關(guān)度≥10”為篩選條件獲得腎癌靶點(diǎn)1 219個(gè)，對(duì)以上數(shù)據(jù)庫(kù)所得靶點(diǎn)取并集獲得腎癌總靶點(diǎn)1 283個(gè)。利用韋恩圖獲取雷公藤甲素-腎癌的交集靶點(diǎn)共126個(gè)。利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“腎癌-靶點(diǎn)-雷公藤甲素”網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)有142個(gè)節(jié)點(diǎn)，209條邊(圖3)。

注：綠色多邊形表示腎癌，圓形節(jié)點(diǎn)表示共同靶點(diǎn)，藍(lán)色三角形表示雷公藤甲素，邊表示相互作用圖3 “腎癌-靶點(diǎn)-雷公藤甲素”網(wǎng)絡(luò)

三、PPI網(wǎng)絡(luò)的建立及核心靶點(diǎn)的篩選

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)定物種為“人類(lèi)(Homo sapiens)”、置信度≥0.900，除去未參與相互作用的靶點(diǎn)得到PPI網(wǎng)絡(luò)。以“中心度值≥中間值0.003 178 506，親中心度值≥中間值0.4，度值≥2倍中間值12”為條件篩選核心靶點(diǎn)并利用Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行可視化分析，該網(wǎng)絡(luò)顯示核心靶點(diǎn)之間存在相互作用且連接緊密。按度值從大到小進(jìn)行排序，位列前5的靶點(diǎn)為PIK3R1、MAPK1、SRC、STAT3和HSP90AA1。其中度值定義為該靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)的連接數(shù)，該指標(biāo)反映了靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵程度。

四、GO、KEGG富集分析

使用David 6.8數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)126個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，GO分析對(duì)生物過(guò)程(biological process, BP)、細(xì)胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular-function, MF)進(jìn)行了富集。GO-BP共有83條通路，選取20條通路做氣泡圖(篩選標(biāo)準(zhǔn)為P值<1e-10，圖4A)；GO-CC共有58條通路，選取20條通路做氣泡圖(篩選標(biāo)準(zhǔn)為P值<1e-4，圖4B)；GO-MF共有98條通路，選取20條通路做氣泡圖(篩選標(biāo)準(zhǔn)為P值<1e-5，圖4C)。GO-BP富集分析結(jié)果顯示交集靶點(diǎn)富集于“凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控”，這表明雷公藤甲素與細(xì)胞凋亡過(guò)程密切相關(guān)。

A：GO-BP富集分析；B：GO-CC富集分析；C：GO-MF富集分析(條形圖的長(zhǎng)度和氣泡的大小表示富集靶點(diǎn)的數(shù)量，顏色越深表示P值越大)圖4 GO富集分析圖

KEGG通路富集分析共獲得160條通路，以P值<1e-16，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<1e-15為篩選條件選取排名前20的通路。20條通路共有543個(gè)靶點(diǎn)，對(duì)刪除重復(fù)項(xiàng)后剩余的78個(gè)靶點(diǎn)繪制KEGG信號(hào)通路富集分析圖，該網(wǎng)絡(luò)有98個(gè)節(jié)點(diǎn)，542條邊(圖5)。KEGG富集分析結(jié)果表明核心靶點(diǎn)主要富集于PI3K-AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、癌癥中的蛋白聚糖信號(hào)通路和Ras信號(hào)通路。

A：KEGG富集分析氣泡圖，條形圖的長(zhǎng)度和氣泡的大小表示富集靶點(diǎn)的數(shù)量，顏色越深表示P值越大；B：富集通路-靶點(diǎn)圖，圓形節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，藍(lán)色矩形表示前20個(gè)富集通路圖5 KEGG富集分析圖

五、分子對(duì)接結(jié)構(gòu)

對(duì)PPI中度值前14的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接并可視化處理，其中RHOA、HRAS、EGFR與雷公藤甲素有4條氫鍵連接，SRC、MAPK14、ESR1、AKT1、NFKB1與雷公藤甲素有3條氫鍵連接(圖6)，這表明雷公藤甲素與核心靶點(diǎn)的結(jié)合較穩(wěn)定。

A、B、C、D、E、F、G、H分別表示雷公藤甲素與RHOA、HRAS、EGFR、SRC、MAPK14、ESR1、AKT1、NFKB1靶點(diǎn)結(jié)合的3D結(jié)構(gòu)，左側(cè)背景大分子代表核心靶點(diǎn)，右側(cè)放大的小分子代表雷公藤甲素，黃色虛線代表氫鍵圖6 雷公藤甲素與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)構(gòu)

六、泛癌及生存曲線分析

針對(duì)PIK3R1、MAPK1、SRC、STAT3和HSP90AA1的泛癌分析提示這5個(gè)靶點(diǎn)在腎癌組織與正常組織中的表達(dá)具有顯著差異，表明這5個(gè)靶點(diǎn)在腎癌中具有重要的生物學(xué)作用。生存曲線分析表明PIK3R1、MAPK1、HSP90AA1高表達(dá)與SRC、STAT3低表達(dá)腎癌患者的預(yù)后較好(圖7)。

A、B、C、D、E分別表示PIK3R1、MAPK1、SRC、STAT3、HSP90AA1蛋白的泛癌分析圖和生存曲線圖，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1，核心靶點(diǎn)蛋白高表達(dá)標(biāo)示為紅色，核心靶點(diǎn)蛋白低表達(dá)標(biāo)示為藍(lán)色圖7 泛癌分析圖與生存曲線圖

討 論

雷公藤甲素是一種從中草藥雷公藤中提取的二萜三氧化二酯，具有抗炎、免疫抑制和抗腫瘤作用[10]。近年來(lái)有研究表明雷公藤甲素在多種癌癥包括腎癌、前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌中可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，其中腎癌相關(guān)的研究表明其可誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡，具有成為腎癌新治療藥物的潛力[11-13]。

本研究通過(guò)對(duì)腎癌ACHN細(xì)胞的細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可誘導(dǎo)ACHN細(xì)胞凋亡。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)推測(cè)雷公藤甲素誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡的核心靶點(diǎn)蛋白為PIK3R1、MAPK1、SRC、STAT3和HSP90AA1等，主要的信號(hào)通路為PI3K-AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、癌癥中的蛋白聚糖信號(hào)通路和Ras信號(hào)通路。研究表明，PIK3R1在腎癌中表達(dá)下調(diào)，尤其是在晚期腎癌和轉(zhuǎn)移性腎癌中。PIK3R1的下調(diào)促進(jìn)了腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化并獲得干細(xì)胞樣表型，同時(shí)可能通過(guò)激活PI3K/AKT/GSK3b/CTNNB1通路促進(jìn)腎癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，而上調(diào)PIK3R1的表達(dá)可以促進(jìn)腎癌細(xì)胞的凋亡[14]。MAPK1是MAP激酶家族的成員，在絲裂原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵作用，是MAPK級(jí)聯(lián)的重要組成部分，通過(guò)調(diào)節(jié)MAP激酶信號(hào)通路可誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡，對(duì)治療腎癌具有重要意義[15]。PI3K-AKT信號(hào)通路經(jīng)證實(shí)可以通過(guò)下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)有效地抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)也可以通過(guò)下游細(xì)胞周期蛋白D(cyclin D)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4(CDK4)等靶蛋白使細(xì)胞周期阻滯，是當(dāng)前被廣泛認(rèn)可的腎癌治療通路[16-17]。MAPK信號(hào)通路包含4個(gè)不同的級(jí)聯(lián)通路且MAPK信號(hào)通路廣泛表達(dá)，在細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和分化等許多生物過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18-19]。同時(shí)，GO-BP富集分析的結(jié)果顯示雷公藤甲素與腎癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程密切相關(guān)。泛癌與生存曲線分析表明PIK3R1、MAPK1、SRC、STAT3和HSP90AA1這5個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白在KIRP、KIRC、KICH中與正常組織中的表達(dá)有顯著差異，并與腎癌患者的存活率存在相關(guān)性。

綜上，本文通過(guò)對(duì)腎癌ACHN細(xì)胞的細(xì)胞活力檢測(cè)及細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可以誘導(dǎo)腎癌ACHN細(xì)胞凋亡，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接、泛癌和生存曲線推測(cè)雷公藤甲素可能與PIK3R1、MAPK1等核心靶點(diǎn)蛋白穩(wěn)定結(jié)合，通過(guò)PI3K-AKT、MAPK等信號(hào)通路誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡，提高腎癌患者的存活率，這為后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及臨床應(yīng)用提供了理論參考與支撐。