人參皂苷Rg1對(duì)疲勞小鼠骨骼肌中TFAM和NRF-1基因表達(dá)的影響

孔凡秀，楊 琪，董佳萍，謝琳琳，王鶴霖，遲曉星

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

人參皂苷Rg1是一種重要的人參皂苷單體，目前在多領(lǐng)域都有對(duì)人參皂苷單體的功能性研究[1-4]，但在其抗疲勞作用方面的研究相對(duì)較少[5]。疲勞的產(chǎn)生伴隨著能量的大量消耗，其中包括血糖與肌/肝糖原的消耗，同時(shí)伴隨著疲勞產(chǎn)物的積累，機(jī)體調(diào)節(jié)協(xié)同機(jī)能失調(diào)等。

線粒體作為人體主要的產(chǎn)能場(chǎng)所，大量運(yùn)動(dòng)后機(jī)體內(nèi)氧化磷酸化形成超氧化物等活性氧簇，這些活性氧簇的產(chǎn)生使線粒體機(jī)能衰退，導(dǎo)致膜活性下降，影響了線粒體電子的傳遞和氧化磷酸化的進(jìn)行，導(dǎo)致ATP合成不足，造成機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力下降，誘發(fā)運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生。線粒體的功能結(jié)構(gòu)與骨骼肌的功能密切相關(guān)[6]，線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）為線粒體DNA的上游調(diào)節(jié)基因[7-8]，TFAM能夠與線粒體DNA相結(jié)合，形成一種類核復(fù)合體結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)線粒體DNA（mtDNA）免受活性氧簇的損傷。作為一種由細(xì)胞核基因編碼的線粒體蛋白質(zhì)，除可參與線粒體的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及形成擬核結(jié)構(gòu)等生物合成方面的功能外，還可以保護(hù)線粒體免受氧化損傷。核呼吸因子-1（NRF-1）參與多種核編碼基因和TFAM等的表達(dá)[9]。NRF-1和TFAM等組成的信號(hào)通路在線粒體生物合成中起著重要的調(diào)節(jié)作用，參與mtDNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[10]。

作者通過強(qiáng)制小鼠力竭游泳造成小鼠疲勞運(yùn)動(dòng)模型，觀察不同劑量人參皂苷Rg1對(duì)骨骼肌中抗氧化指標(biāo)以及與線粒體生物合成密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子TFAM和NRF-1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以期發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1的抗疲勞作用及可能的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑人參皂苷Rg1（純度98%）：南京斯道夫生物科技有限公司產(chǎn)品；環(huán)磷酰胺：江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、肝/肌糖原、蛋白質(zhì)定量試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器5424高速離心機(jī)：美國Eppendorf公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(jì)：上海INESA公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀：BioTec公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱：DRP-9162上海森信公司產(chǎn)品；ABI-7300 Real-time檢測(cè)儀：ABI公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物與分組

雄性BALB/c小鼠70只，2月齡，體質(zhì)量18~21 g，遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供。小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分7組，每組10只，灌胃給藥前，除空白靜止和空白運(yùn)動(dòng)組外，其他組小鼠注射環(huán)磷酰胺制作免疫抑制模型。

人參皂苷Rg1用生理鹽水溶解，Rg1低（L）、中（M）、高（H）劑量組的灌胃劑量分別為12.5、25、50 mg/kg[11]；空白靜止組（BSG）、空白運(yùn)動(dòng)組（BEG）和模型組（MG）按體質(zhì)量以等量生理鹽水灌胃，陽性對(duì)照組（P）生理鹽水溶解貞芪扶正顆粒，連續(xù)灌胃21 d。小鼠在溫度為（20±2）℃、相對(duì)濕度為40%～60%、光/暗循環(huán)12 h環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.3 小鼠免疫疲勞模型的建立

免疫低下和疲勞密不可分，免疫低下個(gè)體更易形成疲勞模型。將健康小鼠隨機(jī)分組后，除BSG與BEG組腹腔注射生理鹽水外，其余組腹腔注射環(huán)磷酰胺造模，根據(jù)文獻(xiàn)[13-14]確定環(huán)磷酰胺劑量為30 mg/kg，連續(xù)7 d可造成小鼠免疫低下模型。每周兩次進(jìn)行無負(fù)重游泳訓(xùn)練，如出現(xiàn)直立性游泳、眼鼻滲血等不能順利完成游泳者被淘汰。各實(shí)驗(yàn)組小鼠置于水中互不接觸，不停驅(qū)趕使之不停游泳，游泳結(jié)束后盡快擦干小鼠皮毛。訓(xùn)練時(shí)間為20 min，周期為21 d。

1.4 小鼠負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn)

疲勞模型建立之后，除空白靜止組外，小鼠進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)，末次灌胃半小時(shí)后，將小鼠尾巴根部綁緊其自身體質(zhì)量5%的鉛皮，放入水深35 cm、水溫為（25±1）℃的游泳箱中，用秒表記錄時(shí)間，沉沒后10 s仍不能浮出水面，該時(shí)間為小鼠的力竭游泳時(shí)間[15-17]。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 疲勞和抗氧化生化指標(biāo)測(cè)定小鼠處死后取肝臟、骨骼肌等組織，生理鹽水漂洗后濾紙吸干，按試劑盒說明測(cè)定丙二醛（TBA法）、乳酸脫氫酶（微量酶標(biāo)法）、肌/肝糖原（比色法）等生化指標(biāo)。

1.5.2 小鼠骨骼肌中TFAM mRNA和NRF-1 mRNA表達(dá)水平測(cè)定取骨骼肌組織，提取總RNA，RT-PCR測(cè)定小鼠骨骼肌中TFAM mRNA和NRF-1 mRNA表達(dá)水平。

1）基因序列

管家基因引物序列：

目的基因引物序列：

2）骨骼肌RNA提取和鑒定 取小鼠骨骼肌100 mg，加TRIZOL提取RNA。通過變性瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，并在紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的質(zhì)量濃度及純度。

3）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取3μg RNA，以oligo（dT）為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行cDNA合成。20μL體系中含有5×RT緩沖液4μL，2.5 mmol/L dNTP混合液4μL，1μL RNA酶抑制劑，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，3.5μmol/L oligo（dT）引物1μL，RNA 3 pg，反應(yīng)條件：37℃1 h，然后95℃保持5 min，冰上放置5 min，備用。

4）熒光定量PCR反應(yīng) 樣品按以下反應(yīng)體系進(jìn)行：10×PCR緩沖液2.5μ，MgCl2溶液3 pL，dNTP混合液3 pL，Taq聚合酶3 U，0.25 X Sybergreen，上游引物F（20 pmol/L）0.5 pL，下游引物R（20μmol/L）0.5 pL，cDNA 1μL，加ddH2O至總體積為25μL。反應(yīng)條件為：95℃反應(yīng)20 s，60℃反應(yīng)20 s，72℃反應(yīng)20 s，87℃反應(yīng)10 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，電腦自動(dòng)分析熒光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換為Ct值。結(jié)合RNA濃度，將熒光定量PCR定量結(jié)果進(jìn)行換算，得出待測(cè)樣本的RNA表達(dá)量。

5）PCR產(chǎn)物定量分析的校正 采用Beta-actin作為內(nèi)參照。將TFAM、NRF-1和內(nèi)參基因Ct值之間的差值來計(jì)算基因表達(dá)差異。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以組間方差分析P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠負(fù)重游泳的力竭時(shí)間

從表1可以看出，與空白組相比，各劑量組小鼠負(fù)重游泳的力竭時(shí)間均有不同程度的延長，尤以中劑量組效果最為明顯。與空白組和模型組相比，中劑量（25 mg/kg）的人參皂苷Rg1可顯著延長小鼠的力竭游泳時(shí)間，增長率為271.4%，差異有顯著性（P<0.01）。

表1 小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間Table 1 Exhausted time of mice swimming with load

2.2 小鼠肝臟和骨骼肌中糖原水平

如圖1所示，各組間肌糖原濃度無顯著差異性。與模型組比較，中劑量人參皂苷Rg1組可明顯增加小鼠肝糖原濃度（P<0.05），說明在中劑量時(shí)人參皂苷Rg1增加疲勞小鼠肝糖原的效果較好。

圖1 人參皂苷Rg1對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原濃度的影響Fig.1 Effects of ginsenoside Rg1 on glycogen levels of liver and skeletal muscle of mice

2.3 小鼠骨骼肌中MDA、LDH的水平

如圖2所示，與MG組比較，人參皂苷Rg1各劑量組小鼠骨骼肌中MDA質(zhì)量摩爾濃度均明顯下降，差異具有顯著性（P<0.01）。與空白靜止組相比，模型組、空白運(yùn)動(dòng)組和低劑量組骨骼肌中LDH活性下降明顯（P<0.01）；與模型組和空白組相比，中、高劑量組小鼠骨骼肌中LDH活性增加顯著（P<0.01）。

圖2 人參皂苷Rg1對(duì)小鼠骨骼肌中MDA和LDH的影響Fig.2 Effects of ginsenoside Rg1 on MDA and LDH content in skeletal muscle of mice

2.4 小鼠骨骼肌中TFAM和NRF-1基因表達(dá)水平

從圖3可以看出，與模型組相比，中劑量人參皂苷Rg1可顯著增加小鼠骨骼肌中TFAM mRNA和NRF-1 mRNA表達(dá)水平，說明人參皂苷Rg1在25 mg/kg的劑量下，對(duì)骨骼肌中線粒體相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用最好，從而提高線粒體的生物合成，使線粒體氧化供能增強(qiáng)。

3 結(jié) 語

目前已有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1主要是通過加速自由基清除率、增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化物酶活性、維持血糖水平、促進(jìn)糖原合成等方面共同協(xié)作發(fā)揮抗疲勞作用。疲勞的產(chǎn)生通常伴隨著能量的大量消耗，其中包括血糖與肌/肝糖原的消耗，同時(shí)伴隨著疲勞產(chǎn)物的積累，機(jī)體調(diào)節(jié)協(xié)同機(jī)能失調(diào)等[18]。本研究結(jié)果顯示，中劑量的人參皂苷Rg1顯著增加了小鼠肝糖原濃度，可有效減少能量消耗。有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，小鼠灌胃人參提取物后可延長力竭負(fù)重游泳時(shí)間，具有抗疲勞作用。宋姌和劉濤[19]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可明顯降低慢性疲勞綜合征大鼠脂質(zhì)過氧化物丙二醛的含量，同時(shí)增強(qiáng)抗氧化酶SOD的活性，說明人參皂苷Rg1能夠提高抗氧化酶系統(tǒng)活性并減輕脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物的堆積，具有良好的抗疲勞作用。王瑩等研究表明，人參皂苷Rg1能顯著延長小鼠力竭游泳時(shí)間，降低血清中尿素氮水平，同時(shí)維持血糖水平，增加肌糖原和肝糖原儲(chǔ)備，顯著降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸濃度，以上研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。在本實(shí)驗(yàn)中，小鼠游泳運(yùn)動(dòng)后與正常運(yùn)動(dòng)組小鼠比較，肝和骨骼肌中MDA質(zhì)量摩爾濃度并無顯著性差異。在給予人參皂苷后，各劑量組的人參皂苷對(duì)骨骼肌組織中的MDA質(zhì)量摩爾濃度均有降低作用。

圖3小鼠骨骼肌中TFAM mRNA和NRF-1 mRNA表達(dá)水平Fig.3 Expression of TFAM mRNA and NRF-1 mRNA in skeletal muscle of mice

TFAM基因的啟動(dòng)子上具有多種調(diào)節(jié)因子的識(shí)別位點(diǎn)，其中NRF-1占主導(dǎo)位置，二者與DNA結(jié)合后可增高其mRNA的表達(dá)及升高TFAM的蛋白質(zhì)合成，從而增加線粒體進(jìn)行生物合成[9]。NFR-1的主要作用是調(diào)控mtDNA的表達(dá)，包括線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM），其中TFAM在調(diào)控mtDNA表達(dá)及線粒體基因組復(fù)制中起重要作用。TFAM是mt DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄的直接調(diào)控子[21]，學(xué)者通過敲除了TFAM基因的大鼠發(fā)現(xiàn)，mtDNA的復(fù)制明顯減少，并且線粒體電子傳遞能力受到損傷[22]。線粒體功能的改善可能與TFAM的大量表達(dá)相關(guān)聯(lián)，其作用還有參與調(diào)節(jié)線粒體的轉(zhuǎn)錄機(jī)制[20]。NRF-1能調(diào)控多種線粒體蛋白質(zhì)的表達(dá)[12]。TFAM可在NRF-1的作用調(diào)節(jié)下激活，對(duì)mtDNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄起著重要的調(diào)控作用。趙婷婷等研究證實(shí)，一次長時(shí)間大鼠游泳后能促進(jìn)骨骼肌中PGC-1α與TFAM mRNA的共同表達(dá)，黃芪丹參復(fù)合物可通過p38MAPK-PGC-1α-NRF-1-TFAM途徑促進(jìn)線粒體生物發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同劑量的人參皂苷Rg1可同時(shí)上調(diào)NRF-1和TFAM基因的表達(dá)，以中劑量組（25 mg/kg）效果最明顯，說明人參皂苷Rg1可激活NRF-1在線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄功能，而TFAM是線粒體生物合成的直接調(diào)控因子，因此證明人參皂苷Rg1可改善線粒體功能和修復(fù)肌細(xì)胞的損傷，對(duì)骨骼肌肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

人參皂苷Rg1對(duì)疲勞模型小鼠的疲勞相關(guān)指標(biāo)肝/肌糖原以及骨骼肌中抗氧化指標(biāo)有很好的調(diào)節(jié)作用，并能有效調(diào)節(jié)骨骼肌中線粒體合成過程中的重要因子的表達(dá)水平，從而起到抗疲勞的作用。