玫煙色棒束孢菌固體發(fā)酵工藝條件的研究

張微 陶西 龐宗文

(廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧530004)

玫煙色棒束孢菌(Isaria fumosorosea)是一種國際上研究和應用都較為廣泛的生防真菌，分布于世界各地，其寄主資源豐富，具有高毒力，能在環(huán)境中繁殖且不易產生抗性[1,2]。近年來，世界多個國家和地區(qū)致力于玫煙色棒束孢菌的研究，不斷有新的玫煙色棒束孢菌株被分離、鑒定和注冊登記，菌株的生長和培養(yǎng)條件、侵染途徑和機理等特征逐漸明確。目前已發(fā)現玫煙色棒束孢菌可侵染柑橘木虱[3,4]、桃蚜[5]、煙粉虱[6]、小菜蛾[7]和茶卷葉蛾[8]等一些重要農業(yè)害蟲，被廣泛應用于害蟲的生物防治中。

棒束孢菌的侵染機理主要是通過分生孢子萌發(fā)后直接穿入昆蟲體表形成芽管，然后進入昆蟲的血腔中，并在血腔中大量的增殖，最終導致昆蟲的死亡[9,10]。可見棒束孢菌分生孢子的質量和產量是防治效果的決定性因素，因此大量收集分生孢子是棒束孢菌用于防治害蟲的基礎，而分生孢子產量取決于發(fā)酵工藝[11]。目前國內外使用較廣泛的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵法、固體發(fā)酵法及液固雙相發(fā)酵法[12,13]。采用固體發(fā)酵優(yōu)勢在于固體發(fā)酵中的生長條件類似于微生物自身的天然環(huán)境，可使微生物較好地適應且固體發(fā)酵法設備和操作簡單、成本低，其培養(yǎng)基組成常采用廉價的基質如麥麩、稻殼、玉米粉和大米等農業(yè)副產品，增加了農產品附加值且提高了資源利用率[14,15]。

本研究以玫煙色棒束孢菌為出發(fā)菌株，采用固體發(fā)酵技術，先采用單因素試驗探究了麥麩和玉米粉的不同配料比及發(fā)酵條件對產孢的影響，并以產孢量為指標，采用正交試驗對其發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，確定棒束孢菌的最佳發(fā)酵工藝條件，為棒束孢菌生防菌劑的生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

玫煙色棒束孢菌(菌株保藏編號GDMCC 3.428)購自廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑

麥麩、玉米粉、馬鈴薯(市售)；吐溫-80(CP)、胰蛋白胨(BR)、葡萄糖(AR)、瓊脂(BR)購自試劑公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：稱取200g去皮的馬鈴薯切塊，加入適量自來水煮沸30min后用紗布過濾雜質并收集濾液，向其中加入20g葡萄糖，20g瓊脂，用自來水定容至1000mL，pH自然。

PPDA培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基的基礎上添加10g·L-1的蛋白胨。

PPD培養(yǎng)基：PPDA培養(yǎng)基去掉瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 一級種子液

在無菌條件下，用0.05%吐溫-80溶液洗脫在PPDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d的棒束孢菌分生孢子，振蕩均勻后用血球計數板測定，調配制成 1×107個·mL-1的孢子懸浮液，接種于20mL的PPD培養(yǎng)基，25℃、180r·min-1振蕩培養(yǎng)48h，制得一級種子液。

1.2.2 二級種子液

按照5%的接種量將一級種子液轉接入100mL PPD培養(yǎng)液中，25℃、180r·min-1繼續(xù)振蕩培養(yǎng)72h，即為二級菌種培養(yǎng)液，用于固態(tài)發(fā)酵。

1.2.3 固態(tài)培養(yǎng)基的配制

將配制好的培養(yǎng)基裝入250mL三角瓶，每瓶裝樣量為8g，8層紗布包扎放入高壓滅菌鍋121℃滅菌30min，每個處理3個重復。

1.2.4 單因素試驗

1.2.4.1 麥麩與玉米粉的不同比例對產孢的影響

固體培養(yǎng)基以麥麩為主要組分，通過添加不同比例的玉米粉為輔料，培養(yǎng)基組分及配比分別為麥麩∶玉米粉=9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5，滅菌后按10%接種量，于25℃的條件下發(fā)酵10d后測定各組合的產孢量。

1.2.4.2 含水量對產孢的影響

以篩選出的最佳培養(yǎng)基配方作為固體培養(yǎng)基，在固體基質中加入一定量的水，使培養(yǎng)基含水量分別為45%、50%、55%、60%、65%、70%，滅菌后按10%接種量，于25℃條件下發(fā)酵10d后測定各含水量條件下的產孢量。

1.2.4.3 接種量對產孢的影響

在明確最優(yōu)培養(yǎng)基和含水量后，在此基礎上設置接種量為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%，于25℃條件下發(fā)酵10d后測定各接種量條件下的產孢量。

1.2.4.4 發(fā)酵溫度對產孢的影響

在明確培養(yǎng)基配方、含水量和接種量的基礎上，發(fā)酵溫度設置為20℃、25℃、28℃、30℃、32℃，發(fā)酵10d后測定各溫度條件下的產孢量。

1.2.4.5 初始pH對產孢的影響

在優(yōu)化以上條件的基礎上，調整培養(yǎng)基用水的pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，發(fā)酵10d后測定各pH條件下的產孢量。

1.2.4.6 發(fā)酵時間對產孢的影響

根據上述步驟確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方、含水量、接種量和溫度的基礎上，發(fā)酵時間分別為5d、6d、7d、8d、9d、10d、11d，發(fā)酵終止后測定各發(fā)酵時間條件下的產孢量。

1.2.5 正交試驗設計

根據單因素確定的對產孢量有顯著影響的培養(yǎng)條件(含水量、溫度和時間)進行L9(33)正交試驗，各因素和水平的選擇見表1。

表1 正交試驗的因素和水平設計

1.2.6 檢測方法

產孢量的檢測：培養(yǎng)完成后，準確稱取1g固體發(fā)酵基質放入250mL的三角瓶中，加入50mL體積分數為0.05%吐溫-80中和若干玻璃珠，置于25℃、180rpm搖床震蕩3h后取出，用紗布過濾洗脫孢子，利用血球計數板對濾液中的孢子進行計數。另準確稱取5g固體發(fā)酵基質置105℃烘干至恒重，測定固體發(fā)酵基質的含水量，通過計算得到1g干曲所含孢子數。

2 結果與分析

2.1 麥麩與玉米粉的不同比例對產孢的影響

以未添加玉米粉的培養(yǎng)基為對照，麥麩與玉米粉的不同比例對棒束孢菌產孢的影響見圖1。從圖1可以看出，當麥麩∶玉米粉為7∶3時產孢量最高。隨著玉米粉量的增加，產孢呈先增加后遞減的趨勢，其原因可能是培養(yǎng)基中添加適量的玉米粉后可提供菌體生長所需的營養(yǎng)物質，而玉米粉過多時，培養(yǎng)基粘性過大，透氣性降低，不利于菌株的生長產孢。

圖1 麥麩與玉米粉的不同比例對產孢的影響

2.2 含水量對產孢的影響

含水量對棒束孢菌產孢的影響見圖2，從圖2可以看出，當含水量為60%，最有利于菌株的生長和產孢?；|中含水量過低時，培養(yǎng)基較干燥，菌株不能更好地利用培養(yǎng)基的營養(yǎng)，菌體因缺水而造成生長受到限制，進而影響產孢量。當含水量過高時，培養(yǎng)基容易結塊，透氣性降低，不易通風，散熱性差，局部溫度高容易造成燒曲，從而影響產孢量。

圖2 含水量對產孢的影響

2.3 接種量對產孢的影響

接種量對棒束孢菌產孢的影響見圖3，從圖3可以看出，在一定范圍下隨著接種量的增加產孢量逐漸增加，當接種量為10%時，產孢量最高，當接種量超過10%時，產孢量隨著接種量的增加逐漸減少。這可能是因為接種量過少時，無法滿足菌株的生長要求，菌體生長較為緩慢，因此產孢量不高；當接種量過高時，發(fā)酵前期菌絲大量生長，營養(yǎng)物質消耗快，影響后期發(fā)酵孢子的產生，因而產孢量降低。

圖3 接種量對產孢的影響

2.4 發(fā)酵溫度對產孢的影響

發(fā)酵溫度對棒束孢菌產孢的影響見圖4，從圖4可以看出，菌株在20～32℃條件下均能生長，產孢量隨著溫度的提高呈先上升后下降的趨勢，當溫度為25℃產孢量達到最高。分析其原因可能是當溫度過低時菌株生長緩慢，產生的菌體量少，不利于產孢。溫度過高時，酶活性降低，菌株的生長受到抑制，進而影響產孢，故產孢量較低。

圖4 發(fā)酵溫度對產孢的影響

2.5 初始pH對產孢的影響

初始pH對棒束孢菌產孢的影響見圖5，從圖5可以看出，菌株對初始pH值不是很敏感， 產孢量變化不大，pH在4.0～8.0都能很好的生長，其中當pH為6.0時，產孢量達到最高。因培養(yǎng)基本身的自然pH值為6.0左右，故后續(xù)試驗中將采取自然pH值。

圖5 初始pH對產孢的影響

2.6 發(fā)酵時間對產孢的影響

發(fā)酵時間對棒束孢菌產孢的影響見圖6，從圖6可以看出，發(fā)酵時間為8d左右時，達到最大的產孢量。培養(yǎng)時間小于8d時，菌株處于快速生長期，發(fā)酵不完全，菌體不能充分產孢，因此產孢量較低。而當發(fā)酵時間超過8d，產孢量呈下降趨勢，可能是培養(yǎng)時間過長，孢子散落粘附在瓶壁上，造成孢子量測定時的取樣誤差。

圖6 發(fā)酵時間對產孢的影響

2.7 正交試驗結果分析與驗證

在單因素優(yōu)化試驗的基礎上，選擇對發(fā)酵結果影響最大的3個因素含水量(A)、溫度(B)、發(fā)酵時間(C)，以產孢量為試驗指標，設計3因素3水平L9(33)的正交試驗進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，其試驗設計方法和結果如表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結果與分析

表3 方差分析結果

由表2和表3可知，3個因素對產孢量的影響順序A>B>C，即溫度對產孢量的影響最大，其次是含水量，影響最小的是發(fā)酵時間。方差分析結果表明，溫度對棒束孢菌的產孢量具有顯著影響(P<0.05)，含水量和發(fā)酵時間對該菌的產孢量影響都沒達到顯著性。通過正交試驗設計得到，溫度、含水量和發(fā)酵時間的最佳配比為A2B1C2，即溫度為25℃，含水量為55%，發(fā)酵時間為9d。

2.8 正交試驗驗證

3 結果與討論

隨著棒束孢菌殺蟲劑需求量的不斷增加，研究者越來越重視棒束孢菌的生產方法。固體發(fā)酵是一種極好的發(fā)酵工藝方法，可充分利用低成本的農業(yè)副產品進行生產。而培養(yǎng)基是影響棒束孢菌固體發(fā)酵的重要因素之一，培養(yǎng)基的優(yōu)劣直接決定了菌株的產孢性能。張婧迪等[16]通過單因素篩選出金龜子綠僵菌菌株 CY-1的最佳固體發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉:稻殼=8∶2，產孢量可達7.45×109孢子·g-1。鄧小軍[17]等利用麥麩、紅壤、谷糠為作為球孢白僵菌BbⅢ22發(fā)酵固體培養(yǎng)基發(fā)現，在m(麥麩)∶m(谷糠)∶m(紅壤) =2∶4∶4時產孢量最高，但在谷糠基質中不生長。本研究采用麥麩為主，加入一定量的玉米粉的培養(yǎng)基配方進行了初步研究，通過添加一定量的玉米粉可以有效提供充足養(yǎng)分，發(fā)現當麥麩和玉米粉為7∶3時產孢量最大?？梢姽腆w發(fā)酵基質的不同，產孢量也不近相同。同時，菌體的生長受含水量、接種量、溫度、發(fā)酵時間和pH等因素的影響。冀媛媛等[18]分析了接種量、初始含水量、培養(yǎng)時間和初始pH對放線菌SC1-1產孢的影響，得到最佳發(fā)酵條件為初始含水量400mg·g-1、接種量0.4mL·g-1、溫度28℃、培養(yǎng)時間192h、初始pH 7.6。景芳等[18]研究表明，當發(fā)酵條件為含水量60%、接種量30%、溫度28℃、pH 5.6時長枝木霉T6生防菌劑產孢量最高。因此，選擇適合菌株自身生長的最佳發(fā)酵條件，有利于提高菌體產量，使菌株的生防潛力獲得充分的發(fā)揮。本研究通過單因素試驗和正交試驗獲得了棒束孢菌產孢量的最佳培養(yǎng)基配方及發(fā)酵工藝條件，為工業(yè)化生產棒束孢菌生防菌劑奠定了基礎。

4 結論