多菌協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)低醇玉米芯飲品的工藝研究

陸步詩(shī)，王婧璇，李新社，伍強(qiáng)

(1.邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽(yáng)，422000；2.生態(tài)釀酒新技術(shù)與應(yīng)用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽(yáng)，422000)

玉米芯富含膳食纖維、礦物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪等營(yíng)養(yǎng)成分[1]，具有防癌通便、降低膽固醇等藥理作用[2-4]。玉米芯所含的膳食纖維對(duì)人體有一定保健功效[5]，可降低人體血糖和膽固醇水平，消除外來(lái)有毒害物質(zhì)，促進(jìn)礦物元素的吸收[6-7]。有預(yù)防結(jié)腸癌、心腦血管等方面疾病的作用，然而玉米芯通常被丟棄焚燒，面臨資源浪費(fèi)、破壞生態(tài)環(huán)境等問(wèn)題。近些年，對(duì)玉米芯的開(kāi)發(fā)利用，主要通過(guò)物理、化學(xué)、生物等技術(shù)對(duì)玉米芯進(jìn)行加工處理，獲得需要的目的產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)資源的多重利用[8]。林標(biāo)聲等[9]利用菌霉協(xié)同發(fā)酵玉米芯制備飼料。冀曉珊等[10]向再生砂漿中混合粉碎后的玉米芯顆粒，制備玉米芯骨料生態(tài)混凝土。LI等[11]以玉米芯為原料，γ-戊內(nèi)酯為溶劑，利用稀硫酸做介質(zhì)催化玉米芯生產(chǎn)糠醛。

低醇飲品酒精含量通常在0.5%～7%[12]，可以加速血液循環(huán)，減少體內(nèi)脂肪沉淀。采用多菌協(xié)同發(fā)酵制備玉米芯保健飲品，具有降低膽固醇、促進(jìn)腸胃消化等功效[13]。利用玉米芯生產(chǎn)低醇保健飲料，陸步詩(shī)等[14-15]采用多菌協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)低醇玉米芯飲品，玉米芯中的不溶性膳食纖維通過(guò)發(fā)酵轉(zhuǎn)化為可溶性膳食纖維，可溶性膳食纖維能清除自由基，具有良好的抗氧化活性[16]。因此，利用多菌協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)低醇玉米芯飲品可以達(dá)到優(yōu)化資源和保健的雙重效果。

1 材料與方法

1.1 材料和菌種

干玉米芯(市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi))；黑曲霉(GDMCC 3.488)、米根霉(GDMCC 3.132)、釀酒酵母(GDMCC 2.167)均購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心；纖維素酶(酶活5萬(wàn)U/g)、半纖維素酶(酶活3萬(wàn)U/g)均購(gòu)自南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

G154DWS型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋(致微(廈門(mén))儀器有限公司)；SW-CJ-1FD單人單面垂直凈化工作臺(tái)(蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司)；IS-RSD3 臺(tái)式恒溫振蕩器(北京科偉永興儀器有限公司)；GH4500型隔水培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；3H16RI智能高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝方法

玉米芯酶解液→高壓滅菌(121 ℃，15 min)→接種(無(wú)菌條件下活化接種，根據(jù)所需以玉米芯酶解液體積分?jǐn)?shù)確定總接種量，設(shè)定釀酒酵母為總接種量的70%、黑曲霉與米根霉接種量按體積分?jǐn)?shù)配比)→搖床培養(yǎng)(設(shè)置所需的溫度和時(shí)間進(jìn)行發(fā)酵，150 r/min)→檢測(cè)理化指標(biāo)并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.2 玉米芯酶解液制備

玉米芯→粉碎、過(guò)篩(450 μm[14])→干燥(75 ℃，24 h)→混料(m玉米芯∶V蒸餾水=1∶20 (g/mL)[15])→調(diào)節(jié)pH(5.0±0.2[15])→酶解(m纖維素酶∶m半纖維素酶=13∶2，酶添加量為2.5%，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為5 h)→離心得玉米芯酶解液。

1.3.3 菌種活化與種子液制備

1)培養(yǎng)基配制。PDA培養(yǎng)基(培養(yǎng)黑曲霉和米根霉)：20%的馬鈴薯汁1 L，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，維生素B1 8 mg，瓊脂20 g，pH自然(液體培養(yǎng)基不加瓊脂)。YM培養(yǎng)基(培養(yǎng)釀酒酵母)：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，酵母粉3 g，麥芽提取物3 g，蒸餾水1 L，瓊脂20 g，pH為6.2(液體培養(yǎng)基不加瓊脂)。

2)菌種活化。菌種→100 mL液體培養(yǎng)基活化→轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)(黑曲霉和米根霉5 d、釀酒酵母2 d)→選取單菌落于液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至濃度為1×108CFU/mL(溫度時(shí)間同上)→4 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 單因素試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)確定釀酒酵母接種量為總接種量的70%，菌種濃度為1×108CFU/mL，設(shè)置黑曲霉與米根霉的配比分別為(1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1)、菌接種量(體積分?jǐn)?shù))分別為(0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%)、發(fā)酵溫度分別為(24 ℃，26 ℃，28 ℃，30 ℃，32 ℃)和發(fā)酵時(shí)間分別為(1 d，2 d，3 d，4 d，5 d)4個(gè)因素，確定其他3個(gè)因素條件不變，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，做3次重復(fù)的平行試驗(yàn)，檢測(cè)發(fā)酵液的酒精度、殘?zhí)橇坎⑦M(jìn)行感官評(píng)價(jià)，以確定每個(gè)因素的最佳條件。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)。以黑曲霉與米根霉菌種配比(A)、兩菌混合接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)為因素，以酒精度為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.6 測(cè)定方法

酒精度：根據(jù) GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，采用酒精計(jì)法測(cè)定；

殘?zhí)橇浚焊鶕?jù)3，5-二硝酸水楊酸法[17]測(cè)定；

感官評(píng)價(jià)：由10位食品感官評(píng)定人員對(duì)口感、氣味、色澤和體態(tài)等方面進(jìn)行評(píng)分，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種配比對(duì)酶解液發(fā)酵的影響

確定釀酒酵母接種量為總接種量的70%，黑曲霉與米根霉配比分別為1∶3，1∶2，1∶1，2∶1和3∶1，菌接種量為0.6%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為4 d的條件下進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)檢測(cè)酒精度、殘?zhí)橇坎?duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，分析菌種配比對(duì)酶解液發(fā)酵的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知：釀酒酵母利用酶解液中所含還原糖來(lái)保證自身生長(zhǎng)繁殖的代謝活動(dòng)，并進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酒[18]。添加黑曲霉與米根霉會(huì)在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)發(fā)酵液中除還原糖以外的糖類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行糖化作用。當(dāng)釀酒酵母接種量為混合菌種接種總量的70%、黑曲霉與米根霉配比為1∶2時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率最高，此時(shí)發(fā)酵液中殘?zhí)橇孔畹?、產(chǎn)酒量最高，感官評(píng)分也達(dá)到了最大值。因此，選擇菌種配比為1∶2作為最佳發(fā)酵配比。

圖1 菌種配比對(duì)酶解液發(fā)酵的影響Fig.1 Influence of strain proportion on the fermentation of enzymatic hydrolysate

2.2 菌接種量對(duì)酶解液發(fā)酵的影響

確定釀酒酵母接種量為總接種量的70%，黑曲霉與米根霉配比為1∶2，菌接種量分別為0.4%，0.6%，0.8%，1.0%和1.2%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為4 d的條件下進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)檢測(cè)酒精度、殘?zhí)橇坎?duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，分析菌接種量對(duì)酶解液發(fā)酵的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知：當(dāng)兩菌種混合接種量為0.6%時(shí)，釀酒酵母分解還原糖，使發(fā)酵玉米芯酶解液酒精度最高。當(dāng)增加黑曲霉與米根霉接種量后，黑曲霉與米根霉會(huì)進(jìn)一步分解玉米芯生成還原糖，但還原糖含量達(dá)到一定量后會(huì)對(duì)糖化酶形成反饋抑制作用[19]。且黑曲霉與米根霉接種量過(guò)高，會(huì)跟酵母競(jìng)爭(zhēng)酶解液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致酒精度下降。同時(shí)，菌種過(guò)高會(huì)使有機(jī)酸增多[20]，影響產(chǎn)品口感。因此，當(dāng)菌接種量為0.6%時(shí)，發(fā)酵效果最佳。

圖2 菌接種量對(duì)酶解液發(fā)酵的影響Fig.2 Influence of the amount of bacteria inoculation on the fermentation of enzymatic hydrolysate

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)酶解液發(fā)酵的影響

確定釀酒酵母接種量為總接種量的70%，黑曲霉與米根霉配比為1∶2，菌接種量為0.6%，發(fā)酵溫度分別為24 ℃，26 ℃，28 ℃，30 ℃和32 ℃，發(fā)酵時(shí)間為4 d的條件下進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)檢測(cè)酒精度、殘?zhí)橇坎?duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，分析發(fā)酵溫度對(duì)酶解液發(fā)酵的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知：當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)，不利于霉菌生長(zhǎng)代謝，隨著溫度升高，產(chǎn)酒量增加。當(dāng)溫度升高到30 ℃后，繼續(xù)升高會(huì)加速酵母的生長(zhǎng)速度，使釀酒酵母的死亡加快，產(chǎn)生酸敗使酒精度下降[21]。因此，選擇30 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)酶解液發(fā)酵的影響Fig.3 Influence of fermentation temperature on the fermentation of enzymatic hydrolysate

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶解液發(fā)酵的影響

確定釀酒酵母接種量為總接種量的70%，黑曲霉與米根霉配比為1∶2，菌接種量為0.6%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間分別為1，2，3，4和5 d的條件下進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)檢測(cè)酒精度、殘?zhí)橇坎?duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，分析發(fā)酵溫度對(duì)酶解液發(fā)酵的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知：發(fā)酵時(shí)間為1 d時(shí)，酶解液本身有玉米香氣，但沒(méi)有酒精味，繼續(xù)發(fā)酵，隨著霉菌糖化變大，酒精含量也增大。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到4 d后，發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)增加，酒精含量增加不明顯，霉菌活性也有所降低[22]，因此，選擇4 d作為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響Fig.4 Influence of fermentation time on reducing sugar content

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果以菌種配比、菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為變量因素，以酒精度作為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定多菌協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)低醇玉米芯飲品的最佳發(fā)酵工藝條件，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

將表3中數(shù)據(jù)用Design-Expert.V8.0.6.1軟件經(jīng)過(guò)回歸擬合后，得到的二次多項(xiàng)回歸方程：W=5.56-0.18×A+0.23×B+0.13×C+0.68×D+0.080×AB+0.60×AC-0.36×AD-0.62×BC-0.14×BD-0.032×CD-0.65×A2-0.62×B2-0.38×C2-0.81×D2。回歸方程中，W為酒精度，A為菌種配比、B為菌接種量、C為發(fā)酵溫度、D為發(fā)酵時(shí)間。通過(guò)軟件進(jìn)行分析后得到關(guān)于此模型的回歸系數(shù)及其方差分析結(jié)果，見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)的方差分析結(jié)果

2.5.2 影響因素的交互作用分析

影響因素的交互作用見(jiàn)圖5。由圖5可知：隨著菌種配比、菌接種量、發(fā)酵溫度和時(shí)間的增加，多菌協(xié)同發(fā)酵玉米芯酶解液產(chǎn)生的酒精度是逐漸增加的，但增加到一定程度后，酒精度呈下降趨勢(shì)。菌接種量與發(fā)酵溫度間的交互作用是極顯著的，與模型中方差分析結(jié)果無(wú)異。且等高線(xiàn)圖的橢圓和稀疏程度與3D響應(yīng)面圖的彎曲程度都與模型預(yù)測(cè)一致[23]。

圖5 各因素交互作用等高線(xiàn)及響應(yīng)曲面圖Fig.5 Contours and response surfaces of the interaction of various factors

2.5.3 最優(yōu)條件的選取與驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面模型的預(yù)測(cè)結(jié)果，由黑曲霉、米根霉和釀酒酵母協(xié)同發(fā)酵玉米芯酶解液的最佳發(fā)酵條件是：總接種量為0.68%，其中，釀酒酵母為總接種量的70%，黑曲霉與米根霉接種量配比為1∶1.47，發(fā)酵溫度為28.83 ℃，發(fā)酵時(shí)間為4.52 d，此條件下響應(yīng)面軟件預(yù)測(cè)的酒精度為5.79%。為驗(yàn)證回歸模型預(yù)測(cè)，選擇總接種量為0.68%，其中，釀酒酵母接種量為總接種量的70%，黑曲霉與米根霉接種量配比為1∶2，發(fā)酵溫度為29 ℃，發(fā)酵時(shí)間為4.5 d的條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果取平均值后得到的酒精度為5.65%，與模型預(yù)測(cè)的結(jié)果相差不大，表明該模型可以有效反映各因素對(duì)酒精度的影響，模型可行。

因此，選用多菌種協(xié)同對(duì)玉米芯酶解液進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定多菌協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)低醇玉米芯飲品的最佳條件為：菌種總接種量為0.68%，釀酒酵母接種量為菌種總接種量的70%，黑曲霉與米根霉接種量配比為1∶2，發(fā)酵溫度為29 ℃，發(fā)酵時(shí)間為4.5 d，此條件下得到的玉米芯發(fā)酵液酒精度為5.65%，殘?zhí)橇繛?.88 mg/mL，感官評(píng)分為92分。