化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)在行為神經(jīng)科學(xué)中應(yīng)用的研究進(jìn)展*

王一卓 湯家明 蔚洪恩，

（1 山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，太原 030012；2 山西中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床學(xué)院，太原 030024；3 腦疾病防治山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030012）

近年來(lái)，現(xiàn)代行為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)的突破性技術(shù)已經(jīng)成為行為神經(jīng)科學(xué)研究中非常重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)工具。隨著化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)及光遺傳學(xué)技術(shù)的引入、應(yīng)用與完善，高解剖精度的監(jiān)測(cè)和干預(yù)神經(jīng)調(diào)節(jié)過(guò)程成為可能，研究行為和認(rèn)知等復(fù)雜問(wèn)題發(fā)生機(jī)制的思路也變得更加清晰[1]?；瘜W(xué)遺傳學(xué)技術(shù)的核心是特定藥物激活特定人工設(shè)計(jì)的受體（designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs），從而對(duì)細(xì)胞群和神經(jīng)環(huán)路的活性進(jìn)行可逆性遠(yuǎn)程控制[2-3]。與光遺傳學(xué)相比，不依賴導(dǎo)入光纖控制激光的非侵襲性的優(yōu)勢(shì)，使得DREADDs技術(shù)在臨床疾病治療中更具有前景[4]。本綜述通過(guò)梳理國(guó)內(nèi)外關(guān)于DREADDs技術(shù)在行為神經(jīng)科學(xué)實(shí)際應(yīng)用的最新進(jìn)展，在揭示疾病復(fù)雜性的同時(shí)，分析總結(jié)了這一技術(shù)在解析復(fù)雜行為神經(jīng)環(huán)路的優(yōu)勢(shì)。

1 DREADDs技術(shù)的使用

通過(guò)注射藥物激活化學(xué)遺傳學(xué)受體來(lái)選擇性調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動(dòng)，該受體要成為有效的行為神經(jīng)科學(xué)工具，必須對(duì)配體有高度親和力，且相應(yīng)配體對(duì)其它內(nèi)源性受體沒(méi)有藥理作用[5]。

1.1 早期化學(xué)遺傳學(xué)受體

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）是已知最大的一類細(xì)胞表面受體，專門(mén)對(duì)合成小分子配體（例如氣味劑、光子、生物胺、脂類、肽激素等）而非天然配體產(chǎn)生反應(yīng)，是當(dāng)代DREADDs技術(shù)的前沿。Strader等[6]通過(guò)取代單個(gè)氨基酸殘基，使β-腎上腺素能受體發(fā)生突變，形成GPCR，由含有兒茶酚胺的酯類和酮類化合物激活后，改變內(nèi)源性受體結(jié)合的特異性。隨后Coward等[7]基于κ阿片受體開(kāi)發(fā)出2個(gè)衍生物，分別為Ro1和Ro2，并將這些受體稱為RASSLs（僅由合成配體激活的受體）。這2種受體的優(yōu)勢(shì)是降低了與許多內(nèi)源性配體的結(jié)合親和力和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)維持了對(duì)合成小分子激動(dòng)劑的結(jié)合能力，但RASSLs的合成配體通常對(duì)天然受體也具有高親和力，因而限制了它們?cè)隗w內(nèi)的適用性。

1.2 定向分子進(jìn)化

Armbruster等[2]利用定向分子進(jìn)化技術(shù)，對(duì)酵母的人毒蕈堿型乙酰膽堿受體多輪隨機(jī)誘變后，衍生出2種DREADDs：激活神經(jīng)元放電的hM3Dq和抑制神經(jīng)元放電hM4Di，這些DREADDs對(duì)內(nèi)源性配體乙酰膽堿幾乎沒(méi)有親和力，但可以被生物惰性配體氯氮平的氮氧化物（clozapinen-oxide，CNO）高選擇性地激活。尤為重要的是，CNO對(duì)所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶點(diǎn)缺乏親和力[2，8]，同時(shí)對(duì)乙酰膽堿受體具有高親和性、穩(wěn)定的藥代動(dòng)力學(xué)、良好的血腦屏障穿透性等特性[9]。因此，該DREADDs為最小侵入性遠(yuǎn)程修飾神經(jīng)元活性的行為神經(jīng)科學(xué)研究提供平臺(tái)。

1.3 受體的類型

目前已研發(fā)出基于人類毒蕈堿的不同DREADDs可以雙向調(diào)控神經(jīng)元活性[2-3]，其主要的3種信號(hào)途徑分別是Gq（hM3Dq）、Gi（hM4Di）和Gs（rM3Ds）。Gq通過(guò)刺激磷脂酶C，使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子大量釋放引起細(xì)胞興奮性增高，神經(jīng)元的放電增加[10]；Gi通過(guò)抑制腺苷酸環(huán)化酶的產(chǎn)生，引起細(xì)胞超極化，減少神經(jīng)元的放電[11]；Gs通過(guò)刺激腺苷酸環(huán)化酶的信號(hào)通路，引起細(xì)胞興奮性增高[10]，但Gs信號(hào)通路能在一些細(xì)胞中表現(xiàn)出一定的活性，限制了該受體的使用，故該類藥物使用較少。表達(dá)DREADDs的神經(jīng)元電生理記錄顯示，腹腔注射CNO后5～10 min開(kāi)始初步影響神經(jīng)元活動(dòng)，30 min后達(dá)到峰值，并在隨后的2 h內(nèi)下降[12]。雖然CNO的血漿水平迅速下降，但行為影響可持續(xù)9 h[3]。該時(shí)效特點(diǎn)可能與嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)給藥后CNO轉(zhuǎn)化為氯氮平有關(guān)[13-14]。同時(shí)研究證明，透過(guò)血腦屏障的為氯氮平，而不是CNO，并且氯氮平激活DREADDs的親和力及效力高于CNO[14]。然而，人類毒蕈堿的DREADDs中興奮性受體和抑制性受體均為同一配體激活，因此在同一動(dòng)物體內(nèi)選擇性雙向調(diào)控神經(jīng)元活性的研究應(yīng)用中受到了限制。

近年來(lái)，通過(guò)開(kāi)發(fā)一種由配體salvinorin B（SalB）激活的κ阿片受體來(lái)源（κ-opioid-derived）（KORD）來(lái)解決這一局限性[15]。SalB與CNO相比作用更快，全身給藥數(shù)分鐘后影響神經(jīng)元活動(dòng)，并持續(xù)1 h。SalB在神經(jīng)元中激活病毒表達(dá)的KORD可顯著減弱神經(jīng)元活性并引起行為的改變。因此在同一神經(jīng)元群體中同時(shí)表達(dá)hM3Dq和KORD的表達(dá)是可能的，故可以達(dá)到雙重調(diào)控目的。Marchant等[16]研究已經(jīng)證明，SalB完全抑制了在中腦腹側(cè)被蓋區(qū)/黑質(zhì)表達(dá)KORD的多巴胺神經(jīng)元的興奮性，減少了運(yùn)動(dòng)行為（圖1）。

圖1 化學(xué)遺傳學(xué)受體

2 DREADDs技術(shù)在行為神經(jīng)科學(xué)研究的應(yīng)用

DREADDs技術(shù)與光遺傳學(xué)技術(shù)兩者的用途均是選擇性激活或抑制某一目標(biāo)神經(jīng)元的活動(dòng)，但兩者在受體被激活的途徑上又存在差異。DREADDs技術(shù)在行為神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用有如下優(yōu)勢(shì)：①DREADDs技術(shù)不需要植入光纖，可對(duì)腦組織的損害降至最低，同時(shí)腹腔注射設(shè)計(jì)配體后，可逆性激活或抑制轉(zhuǎn)染神經(jīng)元，從而控制多個(gè)大腦區(qū)域；②DREADDs技術(shù)具有可重復(fù)性特征，改善了傳統(tǒng)方法中多次腦立體定位注射藥物對(duì)目標(biāo)腦區(qū)產(chǎn)生損傷的不足，適用于在數(shù)天內(nèi)反復(fù)且短暫操縱大腦區(qū)域的研究；③相比光遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)裝置的依賴，DREADDs技術(shù)經(jīng)濟(jì)且高效，使用的CNO對(duì)配體具有高度親和性，且其通過(guò)口服或腹腔注射等給藥途徑使得DREADDs技術(shù)更加簡(jiǎn)便可行；④DREADDs技術(shù)僅干預(yù)神經(jīng)元群體從而實(shí)現(xiàn)高效的調(diào)控，具有相對(duì)無(wú)創(chuàng)、選擇性、可逆性和副作用少的優(yōu)點(diǎn)，更有利于行為障礙疾病的治療[1]。

近年來(lái)應(yīng)用DREADDs技術(shù)進(jìn)行行為研究的增多，推進(jìn)了人們對(duì)于各種行為的全腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和功能連接的理解。最近DREADDs技術(shù)應(yīng)用的模型已經(jīng)從嚙齒動(dòng)物擴(kuò)展到非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，Eldridge等[17]為了研究眶額葉皮質(zhì)（orbitofrontal cortex， OFC）與嗅皮質(zhì)（rhinal cortex， Rh）之間的相互作用是否影響?yīng)剟?lì)行為，通過(guò)DREADDs技術(shù)可逆性中斷OFCRh區(qū)域之間的關(guān)聯(lián)，從而證明OFC-Rh區(qū)域是猴產(chǎn)生刺激-獎(jiǎng)勵(lì)關(guān)聯(lián)行為的必要條件。在本綜述中，筆者總結(jié)了DREADDs技術(shù)在高級(jí)認(rèn)知功能和情感行為研究中的應(yīng)用，包括重復(fù)刻板行為、抑郁癥樣行為、獎(jiǎng)賞效應(yīng)和聯(lián)想學(xué)習(xí)行為。

2.1 重復(fù)刻板行為

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一種早期出現(xiàn)的社交溝通障礙和重復(fù)刻板的感覺(jué)-運(yùn)動(dòng)行為的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病[18]。在多種動(dòng)物模型神經(jīng)發(fā)育障礙中，重復(fù)刻板行為是ASD的一大核心臨床癥狀，包括自我修飾、跳躍、盤(pán)旋和掩埋大理石等。多巴胺（dopamine，DA）是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，該遞質(zhì)可調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)、獎(jiǎng)勵(lì)動(dòng)機(jī)和內(nèi)分泌功能[19]。經(jīng)典的行為藥理學(xué)表明，多巴胺活性與重復(fù)刻板行為密切相關(guān)[20]。由于DA系統(tǒng)的復(fù)雜性和異質(zhì)性，目前對(duì)DA功能仍知之甚少，因此可運(yùn)用DREADDs技術(shù)解析DA調(diào)節(jié)神經(jīng)環(huán)路的分子和細(xì)胞機(jī)制，進(jìn)而揭示重復(fù)刻板行為的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理生理機(jī)制。

多個(gè)假說(shuō)提出，腹側(cè)被蓋區(qū)與黑質(zhì)中的多巴胺神經(jīng)元參與調(diào)控ASD的行為改變，通過(guò)在整個(gè)大腦中形成廣泛的神經(jīng)元連接，調(diào)節(jié)大量的突觸后神經(jīng)元進(jìn)而影響行為[21]。其中黑質(zhì)神經(jīng)元投射到背側(cè)紋狀體，形成黑質(zhì)紋狀體環(huán)路（nigrostriatal system，NS）。有大量研究表明NS控制著運(yùn)動(dòng)的失活，并參與ASD小鼠重復(fù)刻板行為[22]。Wang等[23]通過(guò)構(gòu)建Shank3B-KO小鼠自閉癥模型，研究了Shank3BKO小鼠紋狀體中D1直接途徑和D2間接途徑中型多棘神經(jīng)元的數(shù)量改變與重復(fù)刻板行為之間的關(guān)系（圖2），運(yùn)用DREADDs技術(shù)予以hM3Dq序列病毒激活背側(cè)紋狀體D2受體后，顯著減少了自我理毛行為，同時(shí)增強(qiáng)D1受體活性不影響自我理毛行為。因此Wang等[23]認(rèn)為Shank3B-KO小鼠通過(guò)增強(qiáng)D2間接途徑中型多棘神經(jīng)元活性，調(diào)節(jié)背側(cè)紋狀體神經(jīng)環(huán)路的失衡，進(jìn)而改善重復(fù)刻板行為。同時(shí)Lee等[24]運(yùn)用光遺傳學(xué)技術(shù)證明正常小鼠過(guò)度激活背側(cè)紋狀體D1多巴胺受體或基因敲除D2多巴胺受體，均會(huì)導(dǎo)致重復(fù)刻板行為明顯增多。

圖2 重復(fù)刻板行為相關(guān)的基底神經(jīng)節(jié)神經(jīng)環(huán)路

因此大量的研究證明，重復(fù)刻板行為可能與多巴胺信號(hào)通路改變引起背側(cè)紋狀體神經(jīng)環(huán)路失衡有關(guān)，DREADDs技術(shù)為進(jìn)一步研究重復(fù)刻板行為的神經(jīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

2.2 抑郁癥樣行為

重度抑郁癥（major depressive disorder，MDD）是一種精神疾病，核心癥狀包括情緒低落、冷漠增加和普遍喪失興趣，為很多家庭帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[25]。近年來(lái)，重度抑郁癥的發(fā)病率和抗抑郁藥物的種類不斷增加，但目前MDD藥物的療效仍存在局限性，因此提高對(duì)抑郁癥相關(guān)神經(jīng)環(huán)路的認(rèn)識(shí)，可能會(huì)促進(jìn)新的抗抑郁藥物的開(kāi)發(fā)，并在未來(lái)的研究中發(fā)揮重要作用。

前額葉皮質(zhì)是情緒處理加工調(diào)節(jié)的關(guān)鍵腦區(qū)，研究表明MDD患者的前額葉皮質(zhì)血流動(dòng)力學(xué)反應(yīng)異常[26]。Mayberg等[27]以功能性神經(jīng)影像學(xué)成像平臺(tái)為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)了一種靶向神經(jīng)調(diào)節(jié)策略，即深部腦刺激，有力證明了抑郁癥與內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（medial prefrontal cortex，mPFC）的功能下降有關(guān)；此外，Hamani等[28]對(duì)mPFC腦深部刺激產(chǎn)生抗抑郁反應(yīng)，再次表明mPFC與抑郁癥的相關(guān)性。在嚙齒類動(dòng)物中，DREADDs技術(shù)調(diào)控mPFC腦區(qū)神經(jīng)元活動(dòng)以及相關(guān)神經(jīng)環(huán)路都影響抑郁癥行為[29]。研究報(bào)道m(xù)PFC中小清蛋白（parvalbumin， PV）中間神經(jīng)元在習(xí)得性無(wú)助行為中具有引起應(yīng)激反應(yīng)的作用。為了確定PV-Cre小鼠中PV中間神經(jīng)元活性的降低是否導(dǎo)致習(xí)得性無(wú)助行為的出現(xiàn)，通過(guò)表達(dá)hM4Di選擇性抑制PV中間神經(jīng)元的活性，促進(jìn)無(wú)助感的產(chǎn)生，間接揭示了PV中間神經(jīng)元在應(yīng)激過(guò)程中促進(jìn)行為恢復(fù)[30]。

同時(shí)，在MDD的臨床前模型中，慢性抗抑郁藥物治療可以防止海馬體積縮小、結(jié)構(gòu)異常以及減少海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）顆粒神經(jīng)元的產(chǎn)生[31-32]。最近，Anacker等[33]證實(shí)，直接抑制DG中新生顆粒神經(jīng)元的活性可以增強(qiáng)對(duì)慢性應(yīng)激的抗壓能力，但仍缺乏抗抑郁作用與DG新生顆粒神經(jīng)元活動(dòng)相關(guān)的直接證據(jù)。為了明確顆粒神經(jīng)元增加與行為改變之間的關(guān)系，有研究表明在轉(zhuǎn)基因小鼠中使用DREADDs技術(shù)選擇性地操縱DG新生顆粒神經(jīng)元的活性，產(chǎn)生抑郁和類似焦慮的行為，證明了DG新生顆粒神經(jīng)元與抗抑郁作用的直接關(guān)系[34]，表明DG新生顆粒神經(jīng)元可能是抑郁癥治療的潛在靶點(diǎn)。

2.3 獎(jiǎng)賞反應(yīng)

獎(jiǎng)賞反應(yīng)對(duì)刺激的驅(qū)動(dòng)在很多精神疾病中表現(xiàn)為異常[35]，如該刺激驅(qū)動(dòng)被放大后成為強(qiáng)迫性暴飲暴食[36]、酗酒[37]或吸毒[38]的誘因，若該驅(qū)動(dòng)減弱會(huì)引起壓力、焦慮和抑郁[39]。伏隔核（nucleus accumben， NAc）作為中腦邊緣獎(jiǎng)賞系統(tǒng)的中心部分，整合了多種興奮性和抑制性刺激信號(hào)輸入，如mPFC、杏仁核、海馬及腹側(cè)被蓋區(qū)。NAc代表了一個(gè)完整的中樞，與獎(jiǎng)賞反應(yīng)對(duì)刺激驅(qū)動(dòng)行為有關(guān)，但一直以來(lái)對(duì)NAc的主要神經(jīng)調(diào)節(jié)劑乙酰膽堿的功能知之甚少。Chen等[40]關(guān)注了NAc中的膽堿能中間神經(jīng)元（cholinergic interneurons， Chls），使用DREADDs技術(shù)選擇性激活NAc中Chls活性，在確保Chls高比例表達(dá)DREADDs的基礎(chǔ)上，通過(guò)CNO慢性激活逆轉(zhuǎn)了社交回避等行為，表明Chls在控制獎(jiǎng)賞反應(yīng)和社交方面發(fā)揮著核心作用；與此同時(shí)，Collins等[41]通過(guò)DREADDs技術(shù)證明NAc中Chls對(duì)調(diào)控動(dòng)機(jī)行為具有重要作用，因此該神經(jīng)元可作為許多精神疾病，如成癮、抑郁等的潛在治療靶點(diǎn)。

2.4 聯(lián)想學(xué)習(xí)行為

恐懼反射是聯(lián)想學(xué)習(xí)的一種形式，也稱經(jīng)典條件反射。目前已知的恐懼反射相關(guān)大腦區(qū)域包括杏仁核[42]、前額葉皮質(zhì)[43]和導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)[44]。目前背內(nèi)側(cè)前額葉皮層（dorsomedial prefrontal cortex，dmPFC）與恐懼反射相關(guān)的研究?jī)H僅是神經(jīng)成像和電生理數(shù)據(jù)，很少有因果證據(jù)表明dmPFC是恐懼反射神經(jīng)環(huán)路的組成部分。Yau等[45]通過(guò)DREADDs技術(shù)研究了恐懼反射的神經(jīng)環(huán)路，在未出現(xiàn)恐懼預(yù)測(cè)錯(cuò)誤和學(xué)習(xí)的條件下，向表達(dá)hM3Dq的dmPFC動(dòng)物注射CNO可以恢復(fù)恐懼預(yù)測(cè)錯(cuò)誤和學(xué)習(xí)等能力，從而證明了dmPFC神經(jīng)元的興奮不僅有助于恐懼反射形成，在恐懼預(yù)測(cè)錯(cuò)誤中也扮演著重要角色，隨之出現(xiàn)學(xué)習(xí)和行為的優(yōu)化。

Frontera等[44]報(bào)道小腦頂核（fastigial nucleus， FN）向腹外側(cè)導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（ventrolateral periaqueductal grey，vlPAG）傳遞谷氨酸興奮性神經(jīng)遞質(zhì)控制恐懼反射的形成。首先在FN中注入Cre依賴的腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV），同時(shí)在vlPAG中注入Cre依賴的逆行犬腺狀病毒（canine adenovirus 2，CAV2），運(yùn)用巴普洛夫經(jīng)典條件反射實(shí)驗(yàn)，條件刺激（conditioned stimulus，CS）與非條件刺激（unconditioned stimulus，US）多次結(jié)合，使其CS-US之間形成了鞏固的聯(lián)系，證明化學(xué)遺傳激活或抑制FN-vlPAG環(huán)路對(duì)空白條件下小鼠的靜止?fàn)顟B(tài)沒(méi)有影響；然后通過(guò)用CNO激活或抑制表達(dá)DREADD的FN-vlPAG投射神經(jīng)元，在恐懼條件反射訓(xùn)練中，該通路的激活降低了恐懼記憶的形成強(qiáng)度，而抑制該通路則增加了恐懼記憶的形成強(qiáng)度；最終表明FN-vlPAG環(huán)路雙向控制恐懼記憶的形成強(qiáng)度。

綜上所述，DREADDs技術(shù)在體內(nèi)操縱特定的細(xì)胞亞群，提高空間和時(shí)間分辨率，同時(shí)其在解析神經(jīng)環(huán)路方面提供了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，允許有針對(duì)性、慢性抑制或激活神經(jīng)元活性，是探究特定行為相關(guān)腦區(qū)的理想方法。但DREADDs技術(shù)仍存在特異性較低以及實(shí)際應(yīng)用到人體中出現(xiàn)病毒的轉(zhuǎn)染效率低和可行性低等不足。

近年來(lái)，通過(guò)局部注射帶有Cre重組酶的特異性病毒載體達(dá)到提高病毒特異性的目的[46-47]，這種細(xì)胞類型的特異性可以精準(zhǔn)地操縱其解剖投射的神經(jīng)元，使得對(duì)復(fù)雜行為能有更精確理解，并可以消除相似神經(jīng)元在目標(biāo)區(qū)域調(diào)節(jié)其他行為引起的功能異質(zhì)性，但其應(yīng)用至臨床治療還需要長(zhǎng)期觀察?？傮w而言， DREADDs技術(shù)的不斷成熟和發(fā)展、行為干預(yù)治療的更大進(jìn)展將允許通過(guò)結(jié)合DREADDs技術(shù)進(jìn)行腦刺激，為疾病的臨床治療提供新思路和新方案。