丹參酮調(diào)控LncRNA DLX6-AS1對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷的作用*

余淑菁 余莉萍 李旭成 崔金濤

（1.湖北省武漢市優(yōu)撫醫(yī)院，湖北 武漢 430021；2.湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430014）

急性肺損傷發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚無有效的治療手段［1-2］。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞位于肺泡表面并可抵御外界病原體，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)等可造成細(xì)胞損傷從而促進(jìn)急性肺損傷的發(fā)生［3］。研究表明中醫(yī)藥成分具有減輕急性肺損傷作用，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明［4］。丹參酮（又稱丹參酮ⅡA）是從唇形科植物丹參中提取的一種脂溶性非醌色素類化合物，研究表明丹參酮可抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激從而減輕心肌細(xì)胞損傷［5］。但丹參酮與急性肺損傷相關(guān)研究報(bào)道相對(duì)較少。研究表明，LncRNA DLX6-AS1在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，降低其表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡從而減輕急性腎損傷［6］。但DLX6-AS1在急性肺損傷中的作用機(jī)制尚未闡明。因此，本研究采用LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞建立急性肺損傷模型，探討丹參酮是否可通過調(diào)控DLX6-AS1表達(dá)而影響LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 丹參酮（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；LPS購自美國Sigma；Trizol試劑、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen；MTT試劑、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測(cè)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑購自美國Thermo Fisher；si-NC、si-DLX6-AS1、pcDNA、pcDNA-DLX6-AS1購自上海吉瑪制藥。

1.2 細(xì)胞株 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，購自無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.3 分組與干預(yù) 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按 1×104個(gè)/孔接種于 6孔板，加入含 5 μg/mL LPS的DMEM培養(yǎng)基處理24 h［7］，記為L(zhǎng)PS組。同時(shí)將正常培養(yǎng)細(xì)胞記為空白對(duì)照組。用不同質(zhì)量濃度（5、10、20 μg/L）的丹參酮［8］與含5 μg/mL LPS的DMEM培養(yǎng)基處理24 h，分別記為L(zhǎng)PS+丹參酮L組、LPS+丹參酮M組、LPS+丹參酮H組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-NC、si-DLX6-AS1分別轉(zhuǎn)染至肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后加入含有5 μg/mL LPS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為L(zhǎng)PS+si-NC組、LPS+si-DLX6-AS1組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA-DLX6-AS1轉(zhuǎn)染至肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后加入含有20 μg/L丹參酮與 5 μg/mL LPS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為L(zhǎng)PS+丹參酮+pcDNA-DLX6-AS1組。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔添加20 μL的MTT溶液，孵育4 h后，每孔添加150 μL DMSO，避光振蕩孵育5 min。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔吸光度（A）值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 胰蛋白酶消化各組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，按照凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行雙染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.6 ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-10、TNF-α的水平 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞按照分組處理后，收集培養(yǎng)液上清，參照ELISA試劑盒步驟測(cè)定IL-6、IL-10、TNF-α的水平。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)DLX6-AS1的表達(dá)水平 取1 mL Trizol試劑q

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，兩組間計(jì)量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的比較 見圖1，表1。與空白對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），IL-6、TNF-α、IL-10的水平升高（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS+丹參酮L組、LPS+丹參酮M組、LPS+丹參酮H組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），IL-6、IL-10、TNF-α的水平降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表1 各組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的比較（±s）

表1 各組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05；與LPS+丹參酮L組比較，△P＜0.05；與LPS+丹參酮M組比較，□P＜0.05。下同。

組 別n 抑制率（%） 凋亡率（%）IL-6（pg/mL）IL-10（pg/mL）TNF-α（pg/mL）空白對(duì)照組LPS組LPS+丹參酮L組LPS+丹參酮M組LPS+丹參酮H組3 3 3 3 3 0.00±0.00 58.27±3.37*49.98±2.43#38.41±1.54#△21.98±1.21#△□7.72±0.61 23.67±1.81*20.24±1.09#16.46±0.96#△11.25±0.64#△□55.35±5.36 307.13±15.42*254.17±17.67#173.22±8.61#△119.88±13.31#△□101.92±12.13 350.89±18.91*304.42±13.11#237.74±10.84#△180.84±14.10#△□22.49±2.32 166.55±15.30*120.32±12.60#91.33±5.17#△58.90±6.78#△□

2.2 各組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中DLX6-AS1表達(dá)的比較 見表2。與空白對(duì)照組比較，LPS組DLX6-AS1的表達(dá)量升高（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS+丹參酮H組、LPS+丹參酮L組、LPS+丹參酮M組DLX6-AS1的表達(dá)量降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表2 各組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中DLX6-AS1表達(dá)的比較（±s）

表2 各組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中DLX6-AS1表達(dá)的比較（±s）

組別空白對(duì)照組LPS組LPS+丹參酮L組LPS+丹參酮M組LPS+丹參酮H組n33333 DLX6-AS1 1.00±0.00 4.00±0.11*3.35±0.07#2.53±0.07#△1.78±0.11#△□

2.3 各組DLX6-AS1轉(zhuǎn)染后DLX6-AS1轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè) 見表3。與si-NC組比較，si-DLX6-AS1組DLX6-AS1的表達(dá)量降低（P＜0.05）；與pcDNA組比較，pcDNA-DLX6-AS1組DLX6-AS1的表達(dá)量升高（P＜0.05）。

表3 各組DLX6-AS1表達(dá)的檢測(cè)（±s）

表3 各組DLX6-AS1表達(dá)的檢測(cè)（±s）

注：與si-NC組相比，*P＜0.05；與pcDNA組相比，#P＜0.05。

組別si-NC組si-DLX6-AS1組pcDNA組pcDNA-DLX6-AS1組n 3333 DLX6-AS1 1.00±0.00 0.37±0.04*1.00±0.00 3.68±0.09#

2.4 各組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的比較 見圖2，表4。與LPS組、LPS+si-NC組比較，LPS+si-DLX6-AS1組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），IL-6、IL-10、TNF-α的水平降低（P＜0.05）。

表4 沉默DLX6-AS1對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響（±s）

表4 沉默DLX6-AS1對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響（±s）

注：與LPS組比較，*P＜0.05；與LPS+si-NC組比較，#P＜0.05。

組別LPS組LPS+si-NC組LPS+si-DLX6-AS組n 3 3 3抑制率（%）58.35±3.64 58.38±3.77 15.49±1.06*#凋亡率（%）23.77±1.97 23.88±2.07 9.76±0.58*#IL-6（pg/mL）307.98±16.99 306.10±18.78 84.34±6.74*#IL-10（pg/mL）352.56±23.45 353.40±25.97 141.39±11.25*#TNF-α（pg/mL）164.50±18.65 161.08±16.92 38.28±3.46*#

2.5 過表達(dá)DLX6-AS1對(duì)丹參酮處理的LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響 見圖3，表5。與LPS+丹參酮組比較，LPS+丹參酮+pcDNADLX6-AS1組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），IL-6、IL-10、TNF-α的水平升高（P＜0.05）。

表5 過表達(dá)DLX6-AS1可逆轉(zhuǎn)丹參酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響（±s）

表5 過表達(dá)DLX6-AS1可逆轉(zhuǎn)丹參酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響（±s）

注：與LPS組比較，*P＜0.05；與LPS+丹參酮組比較，#P＜0.05。

組別LPS組LPS+丹參酮L組LPS+丹參酮+pcDNA-DLX6-AS1組TNF-α（pg/mL）161.11±20.19 58.14±7.94*138.41±9.00#n 3 3 3抑制率（%）58.49±3.91 22.10±1.21*51.52±4.44#凋亡率（%）23.75±1.97 11.15±0.87*21.05±1.27#IL-6（pg/mL）312.88±16.33 118.22±12.90*270.67±14.55#IL-10（pg/mL）349.21±33.38 178.67±18.22*311.01±24.80#

3 討 論

據(jù)研究，丹參酮可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡從而減輕心肌細(xì)胞損傷［9］，可抑制炎癥反應(yīng)從而減輕腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷［10］，也可抑制β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激從而減輕細(xì)胞損傷［11］。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率升高，TNF-α、IL-6、IL-10水平升高，與已有研究結(jié)果相似［12］，提示成功建立急性肺損傷模型。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著丹參酮濃度的升高，LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率降低，并可降低IL-6、IL-10、TNF-α的水平。

沉默DLX6-AS1可減輕腦缺血/再灌注損傷［13］。DLX6-AS1在肝癌［14］、喉癌［15］中表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中DLX6-AS1的表達(dá)量升高，丹參酮處理后LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中DLX6-AS1的表達(dá)量降低，提示丹參酮可能通過抑制DLX6-AS1表達(dá)而減輕急性肺損傷。同時(shí)本研究結(jié)果顯示DLX6-AS1過表達(dá)可減弱丹參酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，并降低LPS對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的增殖抑制作用。

綜上所述，丹參酮可通過下調(diào)DLX6-AS1表達(dá)來抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。DLX6-AS1可能作為丹參酮治療急性肺損傷的潛在靶點(diǎn)。