血清外泌體miR-575與ER陽性乳腺癌患者他莫昔芬輔助治療預后的相關(guān)性研究

林 蝶，林傳忠，李 凡

(1.上海中醫(yī)藥大學博鰲國際醫(yī)院藥劑科，海南 瓊海 571400；2.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院胸外科，海南 ?？?570311)

乳腺癌是我國女性癌癥死亡的主要原因之一[1]。他莫昔芬屬于雌激素受體(estrogen receptor，ER)的拮抗劑，近30年來一直是ER陽性乳腺癌患者的主要輔助治療藥物[2]，然而大部分患者在初期治療成功后會產(chǎn)生耐藥性，這對于臨床治療是一個巨大的挑戰(zhàn)[3-4]。目前，他莫西芬的耐藥機制仍未明確，但有研究結(jié)果顯示異常表達的miRNAs在他莫昔芬抵抗中發(fā)揮重要作用[5]。Liu等[6]證實在獲得性他莫昔芬抗性的ER陽性乳腺癌細胞中，miR-575表達上調(diào)，并通過靶向細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B(cyclin-dependent kinase inhibitor 1B，CDKN1B)和乳腺癌易感蛋白1(breast cancer susceptibility protein 1，BRAC1)抑制腫瘤干細胞表型和他莫昔芬抗性；進一步的分子機制研究亦表明，ERα以E2依賴性方式反式激活miR-575表達，而CDKN1B和BRCA1則通過抑制細胞周期蛋白D1和ER之間的相互作用來拮抗ER活性，因此作者推斷靶向miR-575有望成為逆轉(zhuǎn)或阻止他莫昔芬耐藥的潛在策略。為了證實該推斷，本研究擬基于臨床樣本探討miR-575與他莫昔芬輔助內(nèi)分泌治療后ER陽性乳腺癌患者預后的相關(guān)性，以期為臨床ER陽性乳腺癌患者他莫昔芬耐藥的預防及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 生物信息學分析

從Broad Institute’s GDAC Firehose數(shù)據(jù)庫中下載乳腺癌隊列的臨床數(shù)據(jù)和microRNA表達數(shù)據(jù)。在TCGA數(shù)據(jù)集中，共753例患者既有miR-575的表達數(shù)據(jù)，也有存活隨訪數(shù)據(jù)，中位隨訪時間為26.02個月(0～216.6個月)。在METABRIC數(shù)據(jù)庫中，共有1 283例患者既有miR-575的表達數(shù)據(jù)，也有存活隨訪數(shù)據(jù)，中位隨訪時間為118.13個月(0～355.2個月)。生物信息學分析miR-575在乳腺癌組織中的表達情況及其與患者預后的關(guān)系。

1.2 臨床資料

收集2015年1月至2016年4月在上海中醫(yī)藥大學博鰲國際醫(yī)院接受他莫昔芬輔助內(nèi)分泌治療的162例ER陽性乳腺癌患者(年齡18～53歲)的血液樣本作為觀察組。納入標準：絕經(jīng)前女性；經(jīng)病理組織學證實為原發(fā)性乳腺癌，且免疫組化結(jié)果證實為ER陽性；行乳房切除術(shù)；完成化療或放療后，經(jīng)相關(guān)檢查證實無復發(fā)或轉(zhuǎn)移指征；至少接受5年以他莫昔芬為基礎(chǔ)的輔助內(nèi)分泌治療；患者之間在生物學上無血緣關(guān)系。排除標準：近期服用過其他內(nèi)分泌藥物；肝、腎嚴重損傷或合并嚴重心腦血管疾病。另外按照1∶1比例收集年齡與觀察組相匹配(年齡18～53歲)的165例非癌志愿者的血液樣本作為對照組。本研究已獲得上海中醫(yī)藥大學博鰲國際醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，所有參與者對本研究知情同意。

1.3 樣本采集

在輔助內(nèi)分泌治療前收集血液樣本，置于含有乙二胺四乙酸二鉀的采血管中。全血標本在室溫下靜置15 min，凝固后以3 000 r/min 離心10 min，分離血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。另外收集觀察組患者術(shù)中新鮮腫瘤組織樣本，置于液氮中24 h后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清外泌體的提取和鑒定

通過超速梯度離心法從血清樣本中分離獲取外泌體：使用外泌體分離試劑，以6 000 r/min去除細胞碎片30 min；將樣本轉(zhuǎn)移至新鮮試管中，4 ℃環(huán)境下用沉淀液沉淀外泌體顆粒；以12 000 r/min 離心35 min，然后用0.22 μm濾器過濾，再以120 000 r/min超速離心2 h，獲得純化的外泌體顆粒。將分離的外泌體顆粒固定在2.5%戊二醛溶液中至少2 h。然后轉(zhuǎn)移至干凈的銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸染色后置于透射電鏡下獲得圖像。Western blot法檢測外泌體標志蛋白表達水平，小鼠抗人初級抗體購自美國CST公司，CD63、CD9、TSG101按1∶1 000稀釋。

1.5 實時熒光定量PCR法檢測miR-575表達水平

按照Trizol試劑(invitrogen,美國)說明書進行血清外泌體和組織樣本總RNA的抽提，取總RNA溶液吸光度(A260 nm/A280 nm)為1.8～2.1、濃度為 25 ～50 ng/mL的樣本，于-80 ℃保存。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(TaKaRa，日本)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并于-20 ℃保存。按照熒光定量PCR試劑盒說明書(TaKaRa，日本)進行PCR反應(yīng)(miR-575及內(nèi)參U6引物設(shè)計及合成由廣州銳博公司完成)，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 s，60 ℃ 33 s，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法以U6為內(nèi)參計算miR-575的相對表達水平。

1.6 隨訪及療效評價

ER陽性乳腺癌患者術(shù)后口服他莫昔芬治療至少持續(xù)5年，按照WHO制定的統(tǒng)一標準評估療效。所有患者在前2年每3個月隨訪1次，在第3年每6個月隨訪1次，之后每年隨訪1次直至死亡或截至2021年6月。按照實體瘤療效評價標準評估臨床療效，獲得完全緩解、部分緩解和疾病穩(wěn)定的患者視為他莫昔芬敏感，出現(xiàn)疾病進展的患者視為他莫昔芬耐藥。根據(jù)患者對他莫昔芬的耐藥情況將其分為抵抗組和敏感組，分析血清外泌體miR-575表達水平與術(shù)后疾病進展的關(guān)系。根據(jù)影像學證據(jù)，定義任何可測量的病灶維度增加超過25%，或經(jīng)活檢證實患側(cè)乳腺、胸壁或遠處器官出現(xiàn)新的病灶，或患側(cè)/非患側(cè)所屬區(qū)域出現(xiàn)腫大淋巴結(jié)為疾病進展。

1.7 統(tǒng)計學處理

利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，對miR-575相對表達量進行正態(tài)性檢驗，結(jié)果不符合正態(tài)分布，因此以中位數(shù)(四分位數(shù))表示，進行非參數(shù)檢驗，檢驗水準為α=0.05。繪制Kaplan-Meier生存曲線，并進行LogRank檢驗。采用單因素和多因素Cox回歸模型分析影響ER陽性乳腺癌患者他莫昔芬治療預后的臨床因素。繪制受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，ROC)曲線，計算曲線下面積(areaunderthecurve，AUC)。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學分析

生物信息學結(jié)果顯示，在TCGA數(shù)據(jù)庫和GSE45666隊列中，miR-575在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于正常乳腺組織(P<0.001)，見圖1a。在所有類型乳腺癌或ER陽性乳腺癌患者中，miR-575的表達水平升高與Nottingham病理學分級較高有關(guān)(P<0.001)，而這一結(jié)果在HER陽性或三陰性乳腺癌患者組織中并未得到證實(P>0.05)，圖1b。通過Kaplan-MeierPlotter在線軟件比較不同miR-575表達水平的乳腺癌患者的總體生存率，對于所有類型乳腺癌患者或ER陽性患者，miR-575高表達的患者其預后明顯差于miR-575低表達的患者(P<0.05)，而對于ER陰性患者，miR-575表達水平與預后則無顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)，圖1c。

2.2 血清外泌體的鑒定

從血清樣本中分離得到外泌體顆粒，通過透射電鏡和特異性蛋白標記物CD63、TSG101進行鑒定，外泌體囊泡呈圓形或橢圓形，粒徑為80～120 nm；納米顆粒跟蹤分析顯示，囊泡的平均大小為100 nm，密度約為2.5×107/mL；外泌體蛋白標志物CD63、CD9、TSG101呈陽性表達(圖2)。

2.3 觀察組和對照組血清外泌體miR-575表達差異

經(jīng)實時熒光定量PCR法檢測，觀察組患者血清外泌體miR-575相對表達水平高于對照組[1.834(1.168，2.519)vs.1.003(0.901，1.217)，Z=-8.871，P<0.001]。觀察組患者血清外泌體與乳腺癌組織miR-575相對表達水平呈正相關(guān)(rs=0.726，P<0.001)，見圖3。

2.4 觀察組患者血清外泌體miR-575表達水平與術(shù)后疾病進展的關(guān)系

隨訪5年，110例患者對他莫昔芬耐藥，納入抵抗組，52例患者對他莫昔芬敏感，納入敏感組。抵抗組血清外泌體miR-575相對表達水平明顯高于敏感組[2.097(1.700，3.163)vs.1.168(0.947，1.524)，Z=-7.164，P<0.001]。根據(jù)血清外泌體miR-575相對表達水平將患者分為高表達組(>中位值1.834)和低表達組(≤中位值1.834)，繪制Kaplan-Meier曲線，高表達組患者中位疾病進展時間為36.0個月(6.0～57.0個月)，短于低表達組的51.0個月(18.0～60.0個月)(χ2=14.267，P<0.001)，見圖4。

圖4 Kaplan-Meier曲線

2.5 單因素和多因素Cox回歸分析

經(jīng)分析，TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、HER2陽性表達以及血清外泌體miR-575高表達均是ER陽性乳腺癌患者接受他莫昔芬輔助內(nèi)分泌治療預后不良的獨立危險因素(P<0.05)，見表1。

表1 單因素和多因素Cox回歸分析影響ER陽性乳腺癌患者他莫昔芬治療預后的臨床因素

2.6 ROC曲線分析

對于觀察組患者，血清外泌體miR-575表達水平預測5年疾病進展的AUC為0.850(95%CI:0.789～0.910)，Cut-off值為1.622，在該閾值下，靈敏度和特異度分別為78.8%和82.7%，見圖5。

圖5 ROC曲線

a：TCGA隊列(乳腺癌組織：n=87；正常乳腺組織：n=87)和GSE45666隊列(乳腺癌組織：n=101；正常乳腺組織：n=15)分析；b：miR-575表達水平與Nottingham病理分級的關(guān)系；c：Kaplan-Meier分析不同miR-575表達水平患者的總生存率

a：透射電鏡下觀察(黑色箭頭：外泌體顆粒)；b：納米顆粒跟蹤分析；c：Western blot檢測蛋白表達

a:血清外泌體和乳腺癌組織中miR-575的表達；b:血清外泌體與乳腺癌組織miR-575表達的相關(guān)性

3 討論

乳腺癌內(nèi)分泌治療無論是作為術(shù)后預防復發(fā)轉(zhuǎn)移的輔助治療，還是復發(fā)轉(zhuǎn)移后的解救治療都有十分重要的意義[7]。眾所周知，雌激素具有促進乳腺腫瘤形成和增殖的能力，通過ERα信號通路抑制雌激素促腫瘤作用是他莫昔芬等靶向療法成功的原因[8-9]。盡管這些療法有效，但大約50%的ER陽性乳腺癌患者表現(xiàn)出新生耐藥性[10]，導致腫瘤復發(fā)和治療失敗，因此若要改善ER陽性乳腺癌患者的預后，降低耐藥性仍然是一個重大的臨床挑戰(zhàn)。

miRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的長度約為22 nt的內(nèi)源性短鏈RNA，其不編碼蛋白質(zhì)，可通過與編碼蛋白質(zhì)的mRNA互補結(jié)合，誘導翻譯抑制或轉(zhuǎn)錄降解，從而調(diào)控細胞分化、生長、增殖、代謝、凋亡等[11]。miRNAs作為最有前景的用于液體活組織檢查的標志物之一，有助于疾病早期檢測，這對于癌癥的及時發(fā)現(xiàn)具有重要意義。有報道稱miRNAs可通過直接與ESR1 mRNA的3’ UTR結(jié)合來抑制ERα的表達，使雌激素/ERα靶向治療產(chǎn)生耐藥性；反之，雌激素/ERα激活可以調(diào)節(jié)miRNAs的表達，這可能促進ER陽性乳腺癌的發(fā)生[12]。因此，靶向調(diào)控特定miRNAs逐漸成為治療ER陽性乳腺癌的一種有效策略，并能夠顯著提高患者對內(nèi)分泌治療的敏感性。miR-575是位于4q21.22位點的miRNAs，于2009年被首次報道，因其在包括癌癥在內(nèi)的不同類型疾病中發(fā)揮重要作用而備受關(guān)注[13]。Wang等[14]的研究表明，bh3樣含基序蛋白是miR-575非小細胞肺癌發(fā)生的直接靶點，并且其在肺癌的發(fā)展過程中具有關(guān)鍵作用。Qin等[15]發(fā)現(xiàn)miR-575在膽囊癌患者的腫瘤組織中顯著過表達，其下調(diào)可通過靶向p27Kip1顯著抑制膽囊癌的發(fā)生。以上研究均說明miR-575作為促癌因子參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展。Liu等[6]分析了20個原發(fā)性乳腺癌組織樣品和不同乳腺癌細胞中miR-575的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)ER陽性乳腺癌組織和細胞中miR-575表達上調(diào)，這與雌激素/ERα可上調(diào)miR-575表達有關(guān)；經(jīng)過進一步研究發(fā)現(xiàn)，CDKN1B/p27和BRCA1是miR-575的下游靶點。BRCA1是抑制雌激素誘導的ER信號轉(zhuǎn)導并阻斷轉(zhuǎn)錄活性的重要因子，而CDKN1B通過抑制核移位和Cyclin D1相互作用拮抗ER活性，因此CDKN1B/p27和BRCA1可能是阻止ER進入細胞核轉(zhuǎn)錄miR-575表達的原因，這為本研究提供了基礎(chǔ)分子機制支持。本研究首先通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，miR-575在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于正常乳腺組織，在ER陽性患者中，miR-575的表達水平升高與Nottingham病理學分級較高和預后不良有關(guān)；進一步通過實時熒光定量PCR法實驗發(fā)現(xiàn)，ER陽性乳腺癌患者血清外泌體miR-575相對表達水平高于非癌對照人群；同時，Kaplan-Meier曲線、Cox回歸分析以及ROC曲線等方法證實，血清外泌體miR-575高表達是ER陽性乳腺癌患者接受他莫昔芬輔助內(nèi)分泌治療預后不良的獨立危險因素。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)治療前血清外泌體miR-575表達水平較高的ER陽性乳腺癌患者經(jīng)他莫昔芬治療5年內(nèi)疾病進展風險較高，且預后不良。因此，治療前血清外泌體miR-575表達水平可作為預測ER陽性乳腺癌患者他莫昔芬敏感性的一個重要參考指標，有望成為生物學治療的重要靶點，可為ER陽性乳腺癌患者制訂合理、合適的治療方案提供新的理論支持，對延長患者的生存期及提高患者生活質(zhì)量具有重要意義。