異甘草酸鎂干預(yù)肝纖維化大鼠肝細(xì)胞體積與數(shù)量的體視學(xué)*

王川林 崔秋林 劉全明 楊正偉 梅小平 彭 彬

（川北醫(yī)學(xué)院，1 附屬醫(yī)院感染科，2 臨床醫(yī)學(xué)系，3 形態(tài)定量研究室，4 電鏡結(jié)構(gòu)研究室，南充 637000）

肝纖維化是指各種損傷因子慢性刺激所導(dǎo)致肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的異常沉積與過度增生的一種動(dòng)態(tài)病理改變，肝星狀細(xì)胞的活化被認(rèn)為是ECM 的主要來源[1-3]。值得注意的是，除了ECM 的過度增生，肝纖維化的進(jìn)程還伴隨著肝細(xì)胞的變性、壞死和肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生。肝細(xì)胞作為肝中最主要的細(xì)胞也參與了肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。當(dāng)肝受到病毒感染、藥物或化學(xué)藥品損傷導(dǎo)致炎癥或機(jī)械刺激損傷時(shí)，受損的肝細(xì)胞通過旁分泌釋放炎性介質(zhì)激活肝星狀細(xì)胞，并分泌大量的ECM，形成肝纖維化[3-6]。但是迄今為止，肝纖維化所伴隨的肝細(xì)胞病理改變定量數(shù)據(jù)尚未見報(bào)道，如肝細(xì)胞的總數(shù)量、總體積、肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的總體積、每個(gè)肝細(xì)胞的平均體積等。因此，本研究擬探討四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）致肝纖維化大鼠肝細(xì)胞上述形態(tài)定量指標(biāo)的變化。異甘草酸鎂（magnesium isoglycyrrhizinate，MgIG）是第4 代甘草酸制劑，已被證明具有抗炎、抗氧化、穩(wěn)定肝細(xì)胞膜以及保護(hù)肝細(xì)胞功能的作用[7-8]。因此，本研究設(shè)計(jì)了MgIG 干預(yù)組，以明確MgIG 是否會(huì)阻止肝纖維化進(jìn)程中肝細(xì)胞的病理改 變。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

3月齡健康雄性SD 大鼠16 只，體質(zhì)量160～180 g，由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組（n=5）、模型組（n=6）、治療組（n=5）。

對(duì)照組，大鼠背部皮下注射3 mL/kg 的生理鹽水，2 次/周，并同時(shí)腹腔注射生理鹽水30 mL/kg，1 次/天，連續(xù)注射5 周。

模型組，根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]制備，將CCl4（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）與橄欖油（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）按體積比2∶3 配成40% CCl4-橄欖油混懸液，按3 mL/kg 的劑量在大鼠背部皮下注射，2 次/周，并同時(shí)腹腔注射生理鹽水30 mL/kg，1 次/天，連續(xù)注射5 周。

治療組，從CCl4造模開始同時(shí)給予腹腔注射30 mL/kg 的MgIG（江蘇正大天晴藥業(yè)有限公司），1 次/天，連續(xù)注射5 周。

1.2 組織處理與切片制備

將大鼠予以腹腔注射3%戊巴比妥（50 mg/kg）進(jìn)行麻醉，剪取一小塊肝組織切成1 mm3大小的組織塊放入2.5%戊二醛固定，用于制作電鏡超薄切片。剩余肝組織放入4%的多聚甲醛（成都市科龍化工試劑廠）浸潤(rùn)固定48 h后用于制備石蠟包埋切 片。

1.3 肝密度與體積測(cè)量

采用電子天平（精度0.1 mg））稱量肝質(zhì)量，并用已知密度的不同濃度的蔗糖或乙醇溶液測(cè)量肝密度，具體測(cè)量方法如下：利用超純水、蔗糖和無水乙醇配制出不同濃度蔗糖溶液與乙醇溶液，由于濃度不同，其比重亦不同。將待測(cè)肝緩慢放入不同比重溶液中，觀察其浮沉情況：若在溶液中懸?。炔怀寥肴芤浩髅蟮撞恳膊桓〕鋈芤罕砻妫?，此時(shí)溶液密度即為肝密度。該大鼠肝總體積可由所測(cè)肝質(zhì)量除以密度得到。

1.4 石蠟切片制備

每只大鼠按照等距抽樣抽選4 個(gè)2 mm 厚的肝組織塊行石蠟包埋，每個(gè)組織塊用半自動(dòng)石蠟切片機(jī)切取2 張14 μm 厚的石蠟切片，采用Masson染色方法染色肝組織切片。Masson 染色步驟：按照Masson 三色染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司）說明書進(jìn)行。切片脫蠟處理至水，試劑 A 染色5 min，PBS 液沖洗，再滴加 1 滴試劑 C（磷鉬酸）5 min，甩干后滴加 1 滴試劑 D（苯胺藍(lán)）染色 5 min，PBS 液沖洗，滴加 1 滴分化液（試劑 B）分化 30 s；甲苯胺藍(lán)復(fù)染細(xì)胞核5～10 s；70%乙醇、無水乙醇脫水，透明，封片。

1.5 肝細(xì)胞及肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴總體積的估計(jì)

采用體視學(xué)設(shè)備New Cast 系統(tǒng)（配有BX53 型生物顯微鏡）在電腦顯示器上顯示Masson 染色的肝組織顯微切片圖像（100 倍物鏡，最后放大倍數(shù)為2 240 倍），用電動(dòng)載物臺(tái)等距隨機(jī)抽選測(cè)試視野（X 和Y 軸視野間距長(zhǎng)均設(shè)定為1 200 μm），并運(yùn)用測(cè)試系統(tǒng)軟件在視野上生成3×3 測(cè)點(diǎn)（即3 排共9個(gè)等距排列的測(cè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)面積為1 625.59 μm2）。首先從肝組織切片的左上角隨機(jī)抽取第一個(gè)視野，然后按照1 200 μm 的移動(dòng)步距（等距方式）手動(dòng)抽選測(cè)試視野，分別計(jì)數(shù)落在肝細(xì)胞、肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴的測(cè)點(diǎn)數(shù)及整張切片內(nèi)的測(cè)點(diǎn)總數(shù)。將肝細(xì)胞的測(cè)點(diǎn)數(shù)或肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的測(cè)點(diǎn)數(shù)除以整張切片內(nèi)的測(cè)點(diǎn)總數(shù)，得到肝細(xì)胞或肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的體積占肝總體積的百分比，即體積分?jǐn)?shù)；將之乘以肝總體積，即得肝細(xì)胞與肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴的總體積。

1.6 每個(gè)肝細(xì)胞平均體積及肝內(nèi)肝細(xì)胞數(shù)量的估計(jì)

運(yùn)用體視學(xué)設(shè)備New Cast 系統(tǒng)在Masson 染色的肝組織切片上隨機(jī)抽選7 個(gè)視野，并運(yùn)用測(cè)試系統(tǒng)軟件在視野上生成3×3 測(cè)點(diǎn)，采用點(diǎn)取截距法測(cè)量測(cè)點(diǎn)落在肝細(xì)胞上的直徑，并算出肝細(xì)胞的平均直徑，每個(gè)肝細(xì)胞的體積無偏估計(jì)為。

將大鼠肝內(nèi)肝細(xì)胞的總體積除以每個(gè)肝細(xì)胞的平均體積可以估計(jì)肝內(nèi)肝細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素重復(fù)檢測(cè)的方差分析，并結(jié)合 Student-Newman-Keuls 法進(jìn)行兩兩對(duì)比，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCl4對(duì)肝細(xì)胞形態(tài)和膠原纖維分布的影響

對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞呈六邊形，肝細(xì)胞核居中。肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，形成肝索，極少量肝細(xì)胞內(nèi)可見脂滴。肝組織匯管區(qū)可見少量膠原纖維。模型組大鼠肝細(xì)胞明顯水腫、脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)可見較多脂滴，部分肝細(xì)胞核被擠壓至肝細(xì)胞一側(cè)，肝細(xì)胞排列紊亂。肝組織內(nèi)膠原纖維明顯增生，形成大量纖維間隔，部分假小葉形成。治療組大鼠肝細(xì)胞大量水腫變性，肝細(xì)胞明顯脂肪變性，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的脂滴，肝組織膠原纖維顯著增生，分割正常肝小葉，部分形成假小葉（圖1）。

圖1 Masson 染色示大鼠肝組織內(nèi)膠原纖維

2.2 MgIG 對(duì)肝細(xì)胞平均體積和總體積及細(xì)胞總量的影響

與對(duì)照組比較，模型組、治療組大鼠肝細(xì)胞的總體積無顯著變化；與模型組比較，治療組大鼠肝細(xì)胞的總體積無顯著變化（表1）。

與對(duì)照組比較，模型組、治療組大鼠肝細(xì)胞平均體積均顯著增加，分別增加了91.9% 和105.0%；與模型組比較，治療組大鼠肝細(xì)胞平均體積無顯著變化（表1）。

與對(duì)照組比較，模型組、治療組大鼠肝細(xì)胞總數(shù)量均顯著減少，分別減少了40.0% 和42.4%；與模型組比較，治療組大鼠肝細(xì)胞總數(shù)量無顯著變化（表1）。

表1 各組大鼠肝細(xì)胞總體積、平均體積及細(xì)胞總數(shù)量的比較（±s）

表1 各組大鼠肝細(xì)胞總體積、平均體積及細(xì)胞總數(shù)量的比較（±s）

*P＜0.05 vs 對(duì)照組

組別肝細(xì)胞總體積×1012 μm3肝細(xì)胞平均體積×103 μm3肝細(xì)胞總數(shù)量×108對(duì)照組6.81±1.326.67±0.7510.40±2.90模型組8.21±2.1212.80±1.02*6.24±1.70*治療組7.14±1.8613.70±5.50*5.99±2.72*

2.3 MgIG 對(duì)肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴總體積的影響

對(duì)照組、模型組與治療組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴總體積分別為6.30±6.97、39.5±14.6、36.7±10.5（×109μm3）。

與對(duì)照組比較，模型組、治療組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴的總體積均顯著增加，分別增加了5.27 倍與4.83 倍；與模型組比較，治療組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴的總體積無顯著變化。

3 討論

體視學(xué)是定量形態(tài)學(xué)以及形態(tài)結(jié)構(gòu)的抽樣估計(jì)的科學(xué)[10]。本研究采用了無偏體視學(xué)方法結(jié)合光鏡技術(shù)，首先利用重量除以密度得到大鼠總體積，然后對(duì)大鼠肝按照等距隨機(jī)抽樣原則進(jìn)行抽樣。由于納入體視學(xué)測(cè)試的肝組織是通過等距隨機(jī)抽樣的方式獲得，因此通過抽樣獲得的肝組織塊能夠代表大鼠整個(gè)肝的變化。其次，采用點(diǎn)計(jì)數(shù)得到大鼠肝細(xì)胞與肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴的體積分?jǐn)?shù)。最后分別將肝細(xì)胞與肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴的體積分?jǐn)?shù)與大鼠肝總體積相乘，即為肝細(xì)胞與肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴的總體積。將肝細(xì)胞總體積除以每個(gè)肝細(xì)胞平均體積可以估計(jì)肝內(nèi)肝細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)。

CCl4是經(jīng)典的誘發(fā)肝纖維化的一種選擇性肝毒性藥物，CCl4進(jìn)入肝后在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)微粒體細(xì)胞色素P450 氧化酶激活后，生成活潑的三氯甲基自由基并引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性（如細(xì)胞氣球樣變、細(xì)胞脂肪變性等）、壞死，長(zhǎng)期反復(fù)刺激導(dǎo)致肝組織纖維化[11-12]。本研究采用每周2 次給予大鼠背部皮下注射CCl4的方式，致肝細(xì)胞反復(fù)損傷、壞死，肝內(nèi)廣泛ECM 過度增生與異常沉積，形成肝纖維化。本研究結(jié)果顯示，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠每個(gè)肝細(xì)胞平均體積顯著增加了91.9%，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴總體積增加了5.27 倍，肝細(xì)胞總數(shù)量減少了40.0%，肝細(xì)胞總體積則無明顯變化。分析其原因可能是由于CCl4的肝毒性作用致部分肝細(xì)胞變性，肝細(xì)胞大量脂肪變性，細(xì)胞水腫，單個(gè)肝細(xì)胞平均體積增大，部分肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞數(shù)量減少，因此在肝纖維化過程中，盡管肝細(xì)胞平均體積顯著增大，肝細(xì)胞總體積無顯著性變化。肝細(xì)胞數(shù)量的減少以及大量脂肪變性伴隨著肝功能的損傷甚至衰竭。本研究結(jié)果顯示，CCl4致大鼠肝內(nèi)肝細(xì)胞總數(shù)量顯著減少以及肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴體積顯著增加，從形態(tài)定量角度證實(shí)了CCl4所致大鼠肝纖維化伴隨著肝細(xì)胞腫脹、脂肪變性及肝細(xì)胞數(shù)量減少等病理改變，CCl4具有較強(qiáng)的肝毒性作用。

MgIG 是臨床中常用的保肝藥物之一，其有效成分為18α 甘草酸，具有抗炎和穩(wěn)定肝細(xì)胞膜的功能。有研究表明，MgIG 能通過降低肝纖維化大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平，提高超氧化物歧化酶和還原型谷胱甘肽的表達(dá)，從而降低氧化應(yīng)激水平，改善肝纖維化[13]。但是本研究的形態(tài)定量結(jié)果并未見MgIG 對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞損傷的病理改變指標(biāo)有明顯的改善作用，肝細(xì)胞的總體積、肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴的總體積、肝細(xì)胞平均體積及肝細(xì)胞總數(shù)量與模型組均無顯著差異。該結(jié)果提示，MgIG 沒有明顯促進(jìn)肝細(xì)胞再生與減輕肝細(xì)胞脂肪變性的作用。分析MgIG 沒有改善CCl4致肝細(xì)胞病理改變的原因可能由于本研究采用的每周2 次給予大鼠背部皮下注射CCl4誘導(dǎo)肝纖維化，同時(shí)每天1 次腹腔注射MgIG 進(jìn)行干預(yù)，CCl4對(duì)大鼠肝存在反復(fù)損傷，而臨床上MgIG 治療藥物性肝炎時(shí)，會(huì)停用一切損傷肝的藥物。這也說明如果損傷肝的因素未祛除，即使使用MgIG 干預(yù)，仍不能阻止肝纖維化大鼠肝細(xì)胞的病理改變。