哮喘抑制劑WHYAHNW的理性設(shè)計

張 麟，李南星

(天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350)

哮喘是先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)細胞與上皮細胞共同作用，導(dǎo)致支氣管超反應(yīng)性、黏液分泌過多、氣道壁重塑和氣道狹窄的一種慢性支氣管疾病[1-3]．目前全球哮喘患者約有3億[4]，每年有25～35萬人死于哮喘[5-6]，導(dǎo)致對哮喘疾病的大量醫(yī)療支出．哮喘疾病對世界經(jīng)濟和社會發(fā)展造成極大負面影響，是人類社會面臨的一個健康難題和挑戰(zhàn)．

嗜酸性粒細胞炎癥是哮喘中主要的炎癥類型，約占全部嚴重哮喘的40%～60%[6-8]．Galectin-10(Gal10)蛋白存在于人類嗜酸性粒細胞中[9-10]，當嗜酸性粒細胞發(fā)生活化時，Gal10蛋白從細胞質(zhì)中釋放，經(jīng)歷相變成為CLCs晶體[11-12]，引發(fā)嗜酸性粒細胞炎癥從而誘發(fā)哮喘．

課題組前期基于蛋白質(zhì)表界面研究[13]，已設(shè)計開發(fā)多種抑制劑[14-18]和病毒相關(guān)配體[19-21]，并以Gal10蛋白與溶晶抗體復(fù)合物[10]為基礎(chǔ)進行分子動力學(xué)模擬及結(jié)合自由能分析確定其結(jié)合界面的關(guān)鍵氨基酸殘基，構(gòu)建親和模型仿生設(shè)計多肽抑制劑，獲得WHYAENWY等哮喘抑制劑[22]．WHYAENWY抑制劑在分子動力學(xué)模擬中可以與Gal10蛋白結(jié)合，但抑制效果驗證中與Gal10蛋白結(jié)合情況不佳．研究中發(fā)現(xiàn)WHYAENWY和Gal10蛋白結(jié)合界面處存在鄰近的同種電荷氨基酸殘基，如WHYAENWY的E5、Y8和Gal10蛋白D49、E43，因而其靜電斥力不利于二者結(jié)合．因此，本文擬分析WHYAENWY與Gal10蛋白的結(jié)合作用表面，通過抑制劑的序列優(yōu)化設(shè)計以改善結(jié)合界面處的靜電相互作用，提高抑制劑與Gal10蛋白間的結(jié)合性能．

1 實驗?zāi)Ｐ团c方法

1.1 模 型

Gal10蛋白晶體結(jié)構(gòu)來源于Protein Data Bank(PDB ID 6GLW，http：//www.rcsb.org/pdb/)[10]，多肽抑制劑的結(jié)構(gòu)來源于課題組自編程序，程序采用C語言編寫，可根據(jù)輸入的序列和對應(yīng)氨基酸結(jié)構(gòu)生成多肽抑制劑的初始結(jié)構(gòu)，分子動力學(xué)(molecular dynamics，MD)模擬過程優(yōu)化可保證結(jié)構(gòu)合理性．采用GROMOS96 43a1力場．模擬環(huán)境為生理鹽水溶液，通過反離子平衡系統(tǒng)凈電荷，水分子采用SPC/E模型．模擬體系盒子尺寸為10nm×8nm×7nm，包含17776個水分子、53個鈉離子和51個氯離子．

1.2 分子動力學(xué)模擬

采用GROMACS 5.1.4(http://www.gromacs.org/)[23]進行20ns正則(NVT)系綜MD模擬．系統(tǒng)溫度通過velocity-rescale(v-rescale)[24]方法維持在 310.15K.使用LINCS(linear constraint solver)[25]算法限制共價鍵和鍵角的振動．使用三維周期性邊界條件．靜電相互作用通過PME(particle-mesh Ewald)[26]算法處理.相鄰原子截斷距離、庫侖截斷距離以及LJ(Lennard-Jones)勢能截斷距離都設(shè)定為1.2nm．粒子初始速度根據(jù)310.15K溫度下的Maxwell分布獲得．采用Verlet算法，積分步長設(shè)定為2fs．各體系于模擬開始前都經(jīng)歷能量最小化．模擬過程至少重復(fù)3次．

1.3 結(jié)合自由能分析

利用分子力學(xué)-泊松-玻耳茲曼方程表面積(molecular mechanics-Poisson-Boltzmann surface area，MM-PBSA)[27]自由能分析方法和g_mmpbsa[28]程序解析抑制劑與Gal10蛋白的結(jié)合界面的關(guān)鍵氨基酸．

1.4 多肽抑制劑分子對接

采用AUTODOCK VINA 1.1.2(http://vina.scripps.edu/)[29]進行分子對接以評估多肽抑制劑與Gal10蛋白結(jié)合情況．Gal10蛋白作為受體，多肽抑制劑作為配體．通過打分(EVINA)評估結(jié)合作用．

1.5 多肽抑制劑與Gal10蛋白的分子動力學(xué)模擬

利用MD模擬研究結(jié)合的動態(tài)過程及微觀相互作用．MD模擬設(shè)置同第1.2節(jié)所述．使用editconf命令將多肽抑制劑與Gal10蛋白的最小距離調(diào)整為1.5nm作為初始結(jié)構(gòu)，考察多肽抑制劑與Gal10蛋白的結(jié)合過程．

1.6 多肽抑制劑抑制效果驗證

通過MD模擬考察Gal10蛋白、抗體、多肽抑制劑同時存在時抑制劑與Gal10蛋白的結(jié)合情況，以評估多肽抑制劑的抑制效果．采用20ns NVT系綜模擬，計算分子間最小距離dmin、質(zhì)心距離dcom、Coulomb勢能(EC)、LJ勢能(ELJ)，評估分子間結(jié)合過程．

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 結(jié)合自由能解析

利用MM-PBSA計算結(jié)合界面上各氨基酸殘基對結(jié)合自由能的貢獻，如圖1所示．結(jié)果顯示，Gal10蛋白的Y69、E119，多肽抑制劑WHYAENWY的W1、Y3、N6、W7、A4對結(jié)合有利，Y8與E5對結(jié)合不利．分析殘基空間分布發(fā)現(xiàn)，Y8和E5與Gal10蛋白的D49和E43攜帶相同電荷，形成靜電相斥而不利于結(jié)合．因此，擬通過WHYAENWY中的荷電殘基序列優(yōu)化以改善其結(jié)合性能．對于Y8，因其距離Gal10蛋白關(guān)鍵位點位置相對較遠，直接刪去．對于E5，使用H、K、R等帶正電的氨基酸替換，得到新抑制劑序列WHYAHNW、WHYAKNW和WHYARNW.對新抑制劑序列中替換的氨基酸進行自由能分析，替換前E5的自由能貢獻為(8.24±0.71)kJ/mol，替換后H5為(-9.33±0.38)kJ/mol，K5為(4.56±0.54)kJ/mol，R5為(1.59±0.84)kJ/mol．H5對結(jié)合產(chǎn)生有利影響，K5、R5減輕對結(jié)合的不利影響．

圖1 Gal10蛋白與WHYAENWY的相互作用界面分析Fig.1 Molecular interface between Gal10 protein and WHYAENWY

2.2 多肽抑制劑的分子對接

利用AUTODOCK VINA將優(yōu)化設(shè)計的多肽抑制劑與Gal10蛋白依次進行對接．對接結(jié)果顯示多肽抑制劑與Gal10蛋白結(jié)合的EVINA都小于-30kJ/mol，表明多肽抑制劑與Gal10蛋白結(jié)合都能自發(fā)進行且都有較強結(jié)合作用(表1)．具體結(jié)合界面如圖2所示.

表1 分子對接分數(shù)Tab.1 Molecular docking scores

圖2 多肽抑制劑與Gal10蛋白結(jié)合情況Fig.2 Binding of peptide inhibitors to Gal10 protein

2.3 多肽抑制劑的分子動力學(xué)模擬

多肽抑制劑與Gal10蛋白的結(jié)合情況如圖3所示．在生理鹽水環(huán)境下，WHYAHNW和Gal10蛋白的最小距離迅速減小，2ns后達到穩(wěn)定波動，質(zhì)心距離變化趨勢類似，在6ns后達到穩(wěn)定波動，表明抑制劑與Gal10蛋白結(jié)合迅速且穩(wěn)定．相比而言，WHYAENWY和Gal10蛋白的最小距離和質(zhì)心距離在7ns后達到穩(wěn)定波動．且WHYAHNW的最小距離與質(zhì)心距離呈現(xiàn)逐漸遞減波動至穩(wěn)定，不同于WHYAENWY經(jīng)歷較大波動后達到穩(wěn)定．3次平行模擬后取軌跡穩(wěn)定結(jié)合階段進行分析，WHYAHNW與Gal10蛋白的最小距離為(0.18±0.01)nm，與WHYAENWY的(0.19±0.01)nm相當．WHYAHNW與Gal10蛋白的質(zhì)心距離為(1.84±0.01)nm，略小于WHYAENWY的(2.04±0.22)nm．確證WHYAHNW與Gal10蛋白的結(jié)合緊密．同時，WHYAHNW的均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)值為(0.53±0.04)nm，略小于WHYAENWY的(0.66±0.08)nm，表明WHYAHNW在結(jié)合過程中構(gòu)象更加穩(wěn)定．

圖3 Gal10蛋白與抑制劑相互作用情況Fig.3 Molecular interactions between Gal10 protein and inhibitors

從首次結(jié)合時間分析，WHYAHNW與Gal10蛋白發(fā)生結(jié)合的平均時間為(0.9±0.1)ns，小于WHYAENWY的(5.4±2.7)ns，表明WHYAHNW結(jié)合更迅速．

能量分析顯示，Gal10蛋白和WHYAHNW間的Coulomb勢能和LJ勢能在2ns后開始降低為負值，表明Coulomb勢能和LJ勢能均利于其結(jié)合過程．3次模擬后取軌跡穩(wěn)定結(jié)合階段進行分析，WHYAHNW的Coulomb勢能為(-211.66±86.55)kJ/mol，LJ勢能為(-185.25±33.26)kJ/mol，分別低于WHYAENWY的Coulomb勢能(-148.15±13.70)kJ/mol，LJ勢能(-90.52±13.32)kJ/mol，確證WHYAHNW結(jié)合優(yōu)于WHYAENWY．而且，結(jié)合構(gòu)象(圖3(c))表明WHYAHNW結(jié)合在Gal10蛋白的關(guān)鍵位點區(qū)域．

2.4 多肽抑制劑抑制效果驗證

Gal10蛋白、抗體、多肽抑制劑同時存在時抑制劑與 Gal10蛋白的結(jié)合情況如圖 4所示.WHYAHNW與Gal10蛋白間的最小距離波動后減小，2ns后達到0.1nm并保持在該值附近波動，質(zhì)心距離變化趨勢類似，表明WHYAHNW與Gal10蛋白迅速結(jié)合并達到穩(wěn)定．相比而言，最小距離和質(zhì)心距離顯示W(wǎng)HYAENWY與Gal10蛋白在16ns后才達到穩(wěn)定結(jié)合．3次模擬后取軌跡穩(wěn)定結(jié)合階段進行分析，WHYAHNW與Gal10蛋白的最小距離和質(zhì)心距離分別為(0.17±0.01)nm和(2.10±0.06)nm，均小于WHYAENWY的(0.24±0.12)nm和(2.74±0.14)nm．首先表明，在抗體存在的情況下，本文設(shè)計的多肽抑制劑也能夠結(jié)合到Gal10蛋白．其次，確證WHYAHNW與Gal10蛋白結(jié)合更好．

圖4 Gal10蛋白、抑制劑與抗體相互作用情況Fig.4 Molecular interactions of Gal10 protein，inhibitors，and antibody

從首次結(jié)合時間分析，WHYAHNW與Gal10蛋白發(fā)生結(jié)合的平均時間為(0.5±0.9)ns，小于WHYAENWY的(3.8±6.5)ns，表明WHYAHNW的結(jié)合更迅速．

能量分析顯示，WHYAHNW與Gal10蛋白間的Coulomb勢能和LJ勢能在2ns降低為負值，表明Coulomb勢能和LJ勢能均利于其結(jié)合過程．3次模擬后取軌跡穩(wěn)定結(jié)合階段進行分析，WHYAHNW的Coulomb勢能為(-121.70±23.21)kJ/mol，LJ勢能為(-125.87±17.90)kJ/mol，分別低于WHYAENWY的Coulomb 勢能(-96.98±62.63)kJ/mol，LJ勢能(-55.84±31.72)kJ/mol，確證WHYAHNW的結(jié)合優(yōu)于WHYAENWY．因此，確證WHYAHNW相比于WHYAENWY進一步優(yōu)化與Gal10蛋白的親和作用.

3 結(jié) 語

以前期設(shè)計的多肽抑制劑WHYAENWY為基礎(chǔ)，分析結(jié)合自由能及殘基空間分布確定抑制劑中E5、Y8氨基酸殘基由于和Gal10蛋白的D49、E43帶有相同電荷，導(dǎo)致靜電斥力從而對結(jié)合不利．本文通過序列重設(shè)計使用帶有相反電荷的氨基酸替代E5，刪去Y8，篩選后得到新抑制劑WHYAHNW．WHYAHNW分子對接EVINA＝-35.6kJ/mol，與Gal10蛋白具有較強相互作用．在分子動力學(xué)模擬和抑制效果驗證中，WHYAHNW與Gal10蛋白結(jié)合更迅速穩(wěn)定，優(yōu)于序列改造前抑制劑WHYAENWY，有望作為具有高親和力的哮喘抑制劑為后續(xù)哮喘藥物的設(shè)計與開發(fā)奠定基礎(chǔ)．