微小RNA-146b-5p在小膠質(zhì)細胞糖氧剝奪/復氧損傷中的作用與機制

黃 松 汪 雷 周有東 胡火軍 董元訓 馬金陽

缺血性腦卒中是常見的腦血管疾病，占所有腦卒中的80%[1]。神經(jīng)炎癥被認為是缺血性腦損傷中一種重要的病理生理因素。研究表明，過度激活的小膠質(zhì)細胞能夠釋放炎性細胞因子和加重氧化應激反應，從而導致神經(jīng)元凋亡[2-4]。因此，抑制小膠質(zhì)細胞活化是目前減輕缺血性腦損傷的重要研究方向。MicroRNA(miRNA)是一種長度在22nt左右的小型非編碼RNA，可通過與靶基因的3’非編碼區(qū)(3’-UTR)結(jié)合對mRNA的表達進行調(diào)控[5]。目前越來越多的研究表明，miRNA是多種疾病發(fā)展過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。例如，miR-146b-5p能夠通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)的表達來抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[6]；miR-146b-5p可以通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)抑制乳腺癌進展[7]；miR-146b-5p可以通過TRAF6/NF-κB信號通路抑制子癇前期母胎界面的炎癥反應[8]。然而，miR-146b-5p在小膠質(zhì)細胞糖氧剝奪/復氧(OGD/R)損傷中的作用機制尚不完全清楚，因此，本研究通過建立小膠質(zhì)細胞OGD/R體外模型，分析miR-146b-5p的表達和作用，并探究其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

小鼠小膠質(zhì)細胞系EOC 13.31(CRL-2468)購自美國ATCC[9]。

1.2 試劑與儀器

原位末端標記染色(TUNEL)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒、丙二醛(MDA)ELISA試劑盒、過氧化氫酶(CAT)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒、白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒和白細胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒均購自武漢賽培生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自美國GlpBio公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Invitrogen公司；BCA蛋白試劑盒購自美國Pierce公司；TRAF6抗體購自英國Abcam公司；MultiskanTMFC酶標儀購自美國ThermoFisher公司；BX63自動熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和OGD/R模型建立：將小膠質(zhì)細胞系EOC 13.31放置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。再將細胞置于37℃，5% CO2，95% N2缺氧箱中培養(yǎng)2.5h后，轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)環(huán)境中復氧從而建立OGD/R模型，以常規(guī)條件培養(yǎng)的細胞為Control組，OGD/R處理的細胞為OGD/R組，48h后收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2 細胞分組及處理：將miR-146b-5p模擬物、模擬物陰性對照、miR-146b-5p抑制劑和抑制劑陰性對照分別轉(zhuǎn)染至EOC 13.31細胞中，然后再分別進行OGD/R處理，記為OGD/R+miR-146b-5p mimic組、OGD/R+NC mimic組、OGD/R+miR-146b-5p inhibitor組和OGD/R+NC inhibitor組，轉(zhuǎn)染48h后，進行后續(xù)相關(guān)指標的檢查。

1.3.3 實時熒光定量(qRT-PCR)檢測miR-146b-5p的表達：使用TRIzol試劑提取OGD/R模型中總RNA，并用PrimeScriptTMRT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR-Green PCR試劑和ABI 7500 FAST Real-Time PCR儀進行qRT-PCR。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法評估m(xù)iR-146b-5p的表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.4 CCK-8檢測細胞活力：收集各轉(zhuǎn)染組細胞，以每孔1×103個細胞密度接種到96孔板中孵育48h，每孔加入15μl CCK-8試劑，37℃孵育4h，檢測490nm波長處每個孔的OD值。根據(jù)CCK-8試劑盒說明書操作，計算細胞存活率。

1.3.5 TUNEL檢測細胞凋亡率：收集各轉(zhuǎn)染組細胞上清液，PBS洗滌一次。用免疫染色固定液固定細胞30-60min，PBS洗滌一次。加入免疫染色洗滌液，冰浴孵育2min。在樣品上加TUNEL檢測液，37℃避光孵育1h，PBS洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，計算細胞凋亡率。

1.3.6 ELISA檢測MDA、SOD、CAT、TNF-α、IL-1β和IL-6含量：收集細胞上清液與RIPA裂解液均漿離心，按照ELISA試劑盒說明書操作，測定細胞中MDA、SOD、CAT、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒和ㄟ^雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸iR-146b-5p與TRAF6之間的靶向關(guān)系進行驗證。將含miR-146b-5p互補結(jié)合位點的野生(WT)型和突變型(MUT)TRAF6片段擴增并克隆到熒光素酶報告載體中，構(gòu)建TRAF6野生型(TRAF6-WT)載體和TRAF6突變型(TRAF6-MUT)載體。使用Lipofectamine 000TM將TRAF6-WT和TRAF6-MUT分別與miR-146b-5p mimic，miR-NC mimic共轉(zhuǎn)染至EOC 13.31細胞系，隨后進行OGD/R處理。轉(zhuǎn)染48h后，按照說明，在Dual-Luciferase?Reporter Assay System上測定各組細胞熒光素酶活性。

1.3.8 Western blotting檢測TRAF6蛋白表達：收集各組細胞，用RIPA裂解緩沖液提取細胞中總蛋白，使用BCA法對蛋白進行定量，10% SDS-PAGE電泳分離轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1h，加入TRAF6一抗(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)共同孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗(1∶1 000)孵育1h后使用ECL化學發(fā)光試劑盒進行顯影。以GAPDH作為內(nèi)參對照。采用圖像分析軟件ImageJ分析TRAF6蛋白條帶的灰度值。以TRAF6蛋白灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值來定量TRAF6蛋白的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-146b-5p和TRAF6在OGD/R模型中的表達

與Control組細胞相比，OGD/R組細胞中miR-146b-5p的表達顯著降低(P<0.01)，TRAF6蛋白的表達顯著增高(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義。見表2、圖1。

表2 兩組細胞中miR-146b-5p和TRAF6蛋白表達水平

圖1 Control組和OGD/R組TRAF6蛋白表達(Westren blotting)

2.2 miR-146b-5p對OGD/R細胞增殖和凋亡的影響

與OGD/R+NC mimic組相比，OGD/R+miR-146b-5p mimic組細胞存活率顯著增高(t=8.322，P<0.01)，凋亡率顯著降低(t=8.356，P<0.01)；與OGD/R+NC inhibitor組相比，OGD/R+miR-146b-5p inhibitor組細胞的存活率顯著降低(t=9.593，P<0.01)，凋亡率顯著升高(t=3.781，P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義。見表3、圖2。

表3 各組細胞存活率及凋亡率

圖2 各組細胞TUNEL熒光染色圖像(比例尺75μm)

2.3 miR-146b-5p對OGD/R模型氧化應激和炎癥反應的影響

與OGD/R+NC mimic組相比，OGD/R+miR-146b-5p mimic組細胞中MDA含量顯著降低(t=13.080，P<0.01)，SOD、CAT含量顯著增高(t=6.907、5.376，P<0.01)，TNF-α，IL-1β，IL-6含量顯著降低(t=3.383、4.476、7.561，P<0.05或P<0.01)；與OGD/R+NC inhibitor組相比，miR-146b-5p inhibitor組細胞中MDA含量顯著增高(t=6.460，P<0.01)，SOD、CAT含量顯著降低(t=6.326、4.449，P<0.01)，TNF-α，IL-1β和IL-6含量顯著升高(t=5.154、3.905、6.467，P<0.05或P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義。見表4、表5。

表4 各組細胞氧化應激指標水平

表5 各組細胞炎癥反應指標水平

2.4 miR-146b-5p與TRAF6的關(guān)系

通過TargetScan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p與TRAF6的3’UTR區(qū)存在互補結(jié)合位點(圖3)。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果表明，與OGD/R+NC mimic組相比，OGD/R+miR-146b-5p mimic組中含TRAF6-WT的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而對含TRAF6-MUT組則無影響(P>0.05)，見表6。Western blotting結(jié)果表明，與OGD/R+NC mimic組相比，OGD/R+miR-146b-5p mimic組TRAF6蛋白表達顯著降低(t=7.723，P<0.01)；OGD/R+NC inhibitor組相比，OGD/R+miR-146b-5p inhibitor組TRAF6蛋白表達顯著增加(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖4、表7。

圖3 miR-146b-5p與TRAF6存在結(jié)合位點

表6 兩組TRAF6雙熒光素酶活性

圖4 各轉(zhuǎn)染組中TRAF6的蛋白表達水平(Westren blotting)

表7 各組TRAF6蛋白相對表達量

3 討 論

缺血性腦損傷的發(fā)病率和致死率極高，因此，缺血性腦損傷的基礎(chǔ)和臨床研究一直是研究和關(guān)注的熱點。缺血性腦損傷中最重要的病理機制之一就是炎癥反應和氧化應激[10]。抑制炎癥反應和氧化應激對減少缺血性腦損傷具有重要意義。

眾所周知，小膠質(zhì)細胞是大腦中主要的免疫細胞，小膠質(zhì)細胞的激活被認為是神經(jīng)炎癥反應的一個特征，參與多種腦疾病的發(fā)病機制。研究表明，mRNA作為內(nèi)源性RNA，主要通過形成功能性miRNA誘導的沉默復合物來抑制mRNA翻譯或誘導其降解，進而參與到生理反應的調(diào)節(jié)中[11，12]。miR-146b-5p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖并促進其凋亡[13]。另外，在新生兒缺血性腦病中，miR-146b-5p靶向IRAK1，可降低炎性因子和氧化應激的表達，減輕神經(jīng)元損傷[14]。本次研究發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p在小膠質(zhì)細胞OGD/R模型中顯著下調(diào)，miR-146b-5p模擬物可顯著促進小膠質(zhì)細胞OGD/R模型細胞增殖并抑制細胞凋亡、炎癥反應和氧化應激。miR-146b-5p抑制劑則顯示出相反的效果。生物信息學和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示在小膠質(zhì)細胞OGD/R模型中，TRAF6是miR-146b-5p的下游靶基因。TRAF6是TRAF家族中的一員，在催化反應中可以通過硫酯鍵與泛素結(jié)合，并將泛素傳遞到相應底物，從而參與一系列信號轉(zhuǎn)導。TRAF6與免疫和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如卒中，顱腦外傷，神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)性疼痛)密切相關(guān)，研究報道TRAF6可以通過Toll受體4(TLR4)和NF-κB/MAPK信號通路，在免疫和炎癥反應中起著非常重要的作用[15，16]。TRAF6通過抑制自噬和促進氧化應激影響了蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的程度[17]。本研究發(fā)現(xiàn)在小膠質(zhì)細胞OGD/R模型中，miR-146b-5p可與TRAF6結(jié)合并負向調(diào)控TRAF6的表達。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p通過負向調(diào)控TRAF6蛋白表達水平保護小膠質(zhì)細胞OGD/R損傷，該研究為小膠質(zhì)細胞OGD/R損傷提供了一個潛在的靶點。

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