大豆蛋白納米纖維冷凝膠對核黃素的控釋研究

關(guān)琛，李萌，李寧，周航慶，張建紅，李琳

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院）

蛋白質(zhì)自組裝纖維結(jié)構(gòu)吸引了納米技術(shù)、食品、醫(yī)學(xué)等多個研究領(lǐng)域的顯著興趣[1]。大豆蛋白[2]、乳清蛋白[3]等多種食品蛋白[4]均可在酸性條件（通常在pH2.0左右）和低離子強度下，長時間加熱自組裝成納米纖維。這些蛋白納米纖維具有高縱橫比（長度1～10μm，直徑1～10 nm），能夠在極低的蛋白質(zhì)濃度下形成自支撐水凝膠，具有更好的乳化和起泡特性，可用作增稠劑、乳化劑等[5-6]，在靶向、定點投放方面具有多種優(yōu)勢，可用于制造微膠囊、微凝膠和水凝膠等，來包封咖啡因[7]、維生素[8]等以實現(xiàn)控制釋放[9-10]。蛋白質(zhì)濃度、pH值、加熱時間和溫度、加熱方式、離子強度、離子類型[3，11]等因素都會影響納米纖維的形成和所得纖維的屬性。纖維表面存在多種反應(yīng)性的官能團，這使得它們可以被多種試劑調(diào)節(jié)。

近年來，應(yīng)用食物蛋白納米纖維制造冷固性凝膠引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。Veerman等[12]通過Ca2+誘導(dǎo)β-乳球蛋白纖維冷凝膠，主要分兩步進行。第一步是蛋白質(zhì)溶液在遠(yuǎn)離等電點和低離子強度的條件下加熱形成納米纖維結(jié)構(gòu)；在第二步中，調(diào)節(jié)pH值至中性條件后添加鹽，通過降低靜電斥力誘導(dǎo)凝膠化。該過程的蛋白濃度比熱誘導(dǎo)凝膠法或常規(guī)冷定型凝膠法低得多。Abaee等研究表明，添加少量的CaCl2可以形成透明凝膠，其微觀結(jié)構(gòu)的特征是形成細(xì)絲[13]。Mohammadian等[14-15]使用不同的二價陽離子制得乳清蛋白纖維冷凝膠，其中Zn2+-冷凝膠具有更緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在模擬胃液條件下降解的程度也更大。相同的蛋白質(zhì)濃度和pH條件下，冷固性凝膠比熱固性凝膠具有更均勻的微觀結(jié)構(gòu)，更高的凝膠強度和斷裂性能、更好的保水性和透明度[16]。

大豆分離蛋白（SPI）具有良好的凝膠性，可以用于改善食品的質(zhì)地和口感[17]。然而，傳統(tǒng)的SPI凝膠通常是通過熱處理實現(xiàn)的，這限制了它作為熱敏化合物載體的應(yīng)用。而納米載體可以為游離的生物活性成分提供許多優(yōu)點，例如增加溶解性（或分散性）和穩(wěn)定性，增強吸附，甚至改善細(xì)胞內(nèi)的滲透。目前，尚未見鹽誘導(dǎo)SPI纖維冷凝膠控釋性能的研究報道。核黃素具有較低的分子量和部分水溶性，并且與大豆蛋白沒有很強的相互作用，易于擴散和定量分析。因此，選用核黃素作為藥物模型，目的是探究SPI纖維冷凝膠作為核黃素載體，為SPI纖維冷凝膠的開發(fā)及利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆低溫脫脂豆粕；山東萬得福集團實業(yè)有限公司；化學(xué)試劑均為分析純。硫磺素T（Th T）、核黃素均為分析純，購于美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850R型高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機有限公司；ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機：德國Christ公司；KJ2300型凱氏定氮儀：瑞典Foss公司；Zetasizer Nano-ZS90粒度儀：英國馬爾文儀器公司；LVDV-II Pro型旋轉(zhuǎn)粘度計：美國Brookfield公司；U-1810型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-7000熒光分光光譜儀：日本日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

采用堿溶酸沉法自制。將低溫脫脂豆粕粉碎，按料液比1∶10加入去離子水，用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，室溫下低速攪拌2 h后離心（8 000×g，30 min）。取上清液用1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH至4.5。4℃靜置1 h至蛋白質(zhì)析出后離心（8 000×g，10 min）。取出蛋白沉淀溶于去離子水，用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。離心（8 000×g，10 min）去除不溶物。蛋白液于4℃透析48 h，凍干后得到SPI。凱氏定氮法測得蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.5%（N×6.25）。

1.3.2 SPI纖維溶液的制備

將SPI凍干粉溶解于去離子水中，室溫攪拌2 h后，調(diào)節(jié)pH值至2.0，4℃水化過夜。離心（10 000×g，30 min）后，凱氏定氮法測定上清液的蛋白含量。用去離子水（預(yù)調(diào)pH 2.0）將蛋白上清液稀釋到60 g·L-1。將蛋白溶液置于帶密封蓋的小瓶中，85℃水浴加熱20 h。加熱結(jié)束后，將蛋白質(zhì)樣品冰浴冷卻10 min，并置于4℃保存。

1.3.3 SPI冷凝膠的制備

根據(jù)Veerman等[13]的方法，SPI樣品用1 mol·L-1和0.1 mol·L-1NaOH將pH調(diào)節(jié)至8.0。添加適量的CaCl2溶液至終濃度為50 mmol·L-1，將溶液充分混合，室溫放置24 h后測定。

1.3.4 Th T熒光測定

將8 mg Th T溶于10 mL磷酸緩沖液中（10 mmol·L-1磷酸鹽和150 mmol·L-1NaCl，pH 7.0）中，使用0.22μm濾膜過濾后制得Th T的儲備液。用磷酸鹽緩沖液稀釋50倍制得工作液。將50μL的樣品加入5 mL Th T工作液后測量。激發(fā)波長為460 nm，發(fā)射波長為490 nm。

1.3.5 ζ-電位測定

在pH 2.0～10.0范圍內(nèi)測量SPI和SPI納米纖維溶液的ζ-電位。樣品在預(yù)設(shè)的pH值下用雙蒸水稀釋到1 mg·mL-1的蛋白質(zhì)濃度，然后用0.2 mol·L-1的NaOH或HCl調(diào)整到所需的pH值。

1.3.6 表觀粘度測定

在室溫下用旋轉(zhuǎn)粘度計測量溶液的流變特性。每次測試中，將約50 mL樣品倒入溫控測量容器中，在3 s間隔內(nèi)從1～100 s-1剪切。冪律模型參數(shù)由以下方程確定以表征溶液的流動行為：

其中η是表觀粘度（Pa S），K是稠度系數(shù)（Pa Sn），γˉ是剪切速率（s-1），n是流動特性指數(shù)（無量綱）。

1.3.7 載藥率及包封率測定

核黃素以1.0 mg·mL-1的濃度溶于水中。然后將核黃素溶液加入SPI纖維溶液（pH 8.0）中，最終核黃素濃度分別為50、100、150、200、250μg·mL-1。添加適量的CaCl2、溶液至終濃度為50 mmol·L-1，將溶液充分混合，室溫放置24 h形成凝膠后離心（4 000×g，30 min）。用紫外-可見分光光度計在446 nm波長處測定核黃素滲濾液中核黃素的含量[10]。包封率（EE）和載藥率（LC）計算如下：

包封率（EE）=凝膠中核黃素/總核黃素的質(zhì)量×

1.3.8 模擬胃液和模擬腸液的制備

模擬胃液（SGF）：1.0 g NaCl及3.5 mL濃鹽酸定溶于500 mL雙蒸水，最終pH值為1.20。測定前1 h添加3.2 g·L-1的胃蛋白酶。

模擬腸液（SIF）：將6.8 g磷酸二氫鉀溶于250 mL去離子水中，加入去離子水450 mL，然后加入190 mL 0.2 mol·L-1的Na OH溶液，用0.2 mo1·L-1NaOH將pH值調(diào)至7.5，最后用雙蒸水定容至1 000 mL并于測定前1 h加入10.0 g·L-1胰蛋白酶。

1.3.9 溶脹實驗

稱取一定質(zhì)量的凝膠，然后將它們浸泡在不含酶的胃液或腸液中，定期取出，輕輕擦拭并重新稱重。溶脹度計算如下：

式中，Wt是在時間t的凝膠重量，W0是初始凝膠劑重量。

1.3.10 模擬胃腸液中的釋放性能測定

取上述制備好的載藥凝膠放入裝有200 mL SGF和SIF的三角瓶中，置于37℃恒溫振蕩器中反應(yīng)8 h，振蕩速度100 r·min-1。為保證體積不變，每次取樣3.5 mL的同時補充等量的模擬胃腸液。

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗重復(fù)3次取均值，采用Origin 8.0軟件作圖。數(shù)據(jù)處理和分析采用SPSS 19.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPI纖維形成過程中Th T及ζ-電位的變化

硫磺素T（Th T）可以與纖維中分子間的β-折疊緊密結(jié)合[18]，是一種可靠的淀粉樣纖維定量技術(shù)，因為產(chǎn)生的熒光信號與纖維濃度成正比。如圖1所示，天然SPI在pH為2.0時熒光強度較低。加熱能夠觸發(fā)纖維的形成[19]。當(dāng)SPI在85℃加熱時，形成的纖維可以結(jié)合到Th T上，熒光強度隨加熱時間呈S形增加（圖1），這證實了β-折疊存在于SPI纖維中。熒光在最初幾小時變化不大（滯后期），然后迅速增加（生長期），表明在加熱過程中形成了纖維，最后趨于平穩(wěn)（穩(wěn)定期），表明纖維逐漸進入成熟階段，在此期間的自組裝速率下降。Akkerman等[20]報道了SPI在85℃下加熱可形成長的纖維狀半彈性聚集體。隨后將pH從2.0調(diào)整到8.0，SPI纖維熒光強度略低（數(shù)據(jù)未顯示）。熒光強度的降低可能是由于纖維的部分β-折疊結(jié)構(gòu)被破壞所致[21]。

圖1 SPI纖維形成過程中Th T及ζ-電位的變化Fig.1 Th T fluorescence andζ-potential of amyloid-like fibril formation of SPI

ζ-電位通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)懸浮液穩(wěn)定性的指標(biāo)，ζ-電位絕對值越高，穩(wěn)定性越好[22]。SPI在pH 2.0時帶正電荷，當(dāng)pH低于其等電點時，氨基發(fā)生質(zhì)子化，并隨著加熱時間增加，表面電荷達到了新的平衡。加熱20 h后，ζ-電位值在21～25 mV之間，這與Liu等[23]結(jié)果一致。ζ-電位的增長可能是由于蛋白質(zhì)在纖維化過程中發(fā)生變性、水解和結(jié)構(gòu)單元自組裝，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的展開和帶電基團的暴露[6]。這一觀察結(jié)果與Th T熒光數(shù)據(jù)一致。

2.2 pH對SPI纖維ζ-電位的影響

如圖2所示，將SPI纖維溶液的pH從2.0增加到10.0，SPI表面電荷由正向負(fù)變化。其等電點與天然SPI的等電點非常相似（pH～4.5）。在等電點時，由于纖維內(nèi)和纖維間排斥的最小化，導(dǎo)致了纖維的不穩(wěn)定性，納米纖維發(fā)生破壞和聚集。由于沒有靜電斥力來減少纖維間和纖維內(nèi)的相互作用，蛋白原纖維聚集并斷裂成更短的片段[24]。中性pH下纖維的表面電荷量低于酸性pH下的纖維，說明帶電基團暴露較少。在pH為8.0時（高于蛋白等電點），對照體系和纖維體系的ζ-電位沒有顯著差異。有報道指出，當(dāng)β-乳球蛋白纖維溶液的pH值被調(diào)整到8時，仍然可以觀察到線性纖維[12]，纖維的斷裂是一個相對緩慢的過程，完全解離可能需要很長時間。在此條件下，加入50 mmol·L-1CaCl2后，由于纖維間靜電相互作用的屏蔽和Ca2+離子在SPI的帶電或羧基之間形成鹽橋的作用，形成冷凝膠。這種方法制備的纖維冷凝膠的最低蛋白質(zhì)濃度比用傳統(tǒng)冷凝膠法制備的最低濃度低。

圖2 pH對ζ-電位的影響Fig.2 Effect of pH onζ-potential

2.3 凝膠預(yù)溶液的粘度和流動特性

不同樣品溶液的表觀粘度隨剪切速率的變化如圖3所示，由冪律模型得到的流變參數(shù)見表1。溶液的粘度很大程度上取決于多肽的體積和分子間的相互作用。未加熱的SPI溶液粘度較低，表現(xiàn)出牛頓流體行為。纖維溶液樣品的粘度和剪切變稀程度均高于未加熱的樣品。這是由于蛋白溶液加熱后發(fā)生變性，蛋白分子展開形成納米纖維結(jié)構(gòu)，流體力學(xué)直徑增大以及形成具有高纏繞和形成密集網(wǎng)絡(luò)能力的納米纖維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致SPI纖維溶液粘度急劇增加[25]，這與Mohammadian等[26]的結(jié)果一致。將纖維溶液的pH調(diào)至8.0時，由于纖維骨架上電荷分布發(fā)生改變，導(dǎo)致分子間的相互作用減弱，n值略有上升，表明假塑性減弱，這與Zhang等[27]的結(jié)果一致。流變結(jié)果除了受分散體系中纖維的體積分?jǐn)?shù)的影響，還會受到纖維剛性、纖維長度分布和基質(zhì)的影響[3]。當(dāng)pH值高于等電點時，纖維具有凈負(fù)電荷，這有利于在pI時形成的聚集體的分散，但纖維由于中和過程發(fā)生斷裂和長度縮短。SPI纖維溶液的粘度和稠度系數(shù)K隨著pH的增加而下降，這可能是由于纖維的部分結(jié)構(gòu)被破壞，與Th T結(jié)果一致。流變學(xué)結(jié)果表明性質(zhì)，與天然蛋白相，SPI纖維溶液具有更高更大的尺寸，在pH 8.0時形成的縮短的纖維片段仍然具有較高的粘度，有助于改善凝膠性質(zhì)。纖維纏繞產(chǎn)生密集的堆積結(jié)構(gòu)，能夠抵抗剪切場方向的流動。隨著剪切速率進一步增加，納米纖維結(jié)構(gòu)逐漸解纏，表現(xiàn)出強烈的剪切變稀特性。SPI纖維的高粘度和剪切變稀表明它們具有良好的物理改性能力。

圖3 不同蛋白溶液的表觀粘度Fig.3 Apparent viscosity profiles of various soy protein dispersions

表1 SPI溶液、纖維溶液（Ph 2.0、8.0）的流變參數(shù)（n，K）Table 1 Rheological parameters（n，k）for the SPI dispersions before and after fibrillation process

2.4 溶脹實驗

溶脹能力是納米纖維凝膠的重要特征，這是由于在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在的親水基團，如羥基、氨基和羧基。這種能力使蛋白質(zhì)納米凝膠成為封裝和傳遞生物活性化合物的理想結(jié)構(gòu)，同時也是其柔軟和彈性特性的原因，是藥物釋放裝置開發(fā)過程中需要考慮的一個重要參數(shù)[28]。大豆蛋白水凝膠是pH敏感裝置，因為多肽鏈上存在酸性和堿性基團，可以接受或釋放質(zhì)子，以響應(yīng)介質(zhì)pH的變化[29]。通過未溶脹的聚合物的擴散比通過溶脹的聚合物慢得多。SGF（pH 1.2）和SIF（pH 7.5）中SPI纖維冷凝膠溶脹隨時間的演變?nèi)鐖D4所示。在酸性介質(zhì)中浸泡24 h后，SPI纖維冷凝膠的溶脹率達到10%左右，這是由于蛋白質(zhì)鏈上胺基的質(zhì)子化所產(chǎn)生的靜電斥力增強了水在網(wǎng)絡(luò)中的擴散，羧基處于非離子化狀態(tài)（-COOH），不與Ca2+交聯(lián)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)疏松，促進了凝膠網(wǎng)絡(luò)對水的吸收。放置在SIF（pH 7.5）中的凝膠，電離羧基（-COO-）可能通過與Ca2+形成鹽橋而相互交聯(lián)。鈣進一步在磷酸鹽緩沖液中沉淀，導(dǎo)致凝膠收縮，重量減少；凝膠可能會因分子重排而排出水分，減少孔隙度，從而防止溶脹。

圖4 SPI纖維冷凝膠在SGF、SIF中的溶脹24 h（25℃）Fig.4 SPI fibrillar cold gels swelling in SGF and SIF over a 24 h period at 25℃

2.5 荷載量和包封率

蛋白質(zhì)納米凝膠在食品應(yīng)用中的使用可能會給含有熱敏成分的配方帶來一些限制—特別是當(dāng)這些納米系統(tǒng)是通過熱凝膠生產(chǎn)的時候。此外，由于纖維凝膠是通過物理凝膠化產(chǎn)生的，在主干或交聯(lián)中含有不穩(wěn)定的鍵，這些鍵在生理條件下通過酶作用（在通過胃腸道的過程中）或者化學(xué)作用（通常是通過水解）容易受到破壞。因此，包埋在這種納米結(jié)構(gòu)中的成分可以被降解。納米纖維冷凝膠的形成可能為食品蛋白作為熱敏性營養(yǎng)食品化合物的載體提供機。確定包封性參數(shù)，特別是載體的包封率（EE）和載藥量（LC），對于評估系統(tǒng)對特定藥物的裝載能力以及藥物輸送系統(tǒng)的治療效果至關(guān)重要。因此，對SPI納米纖維冷凝膠的核黃素包封率（EE）和載藥量（LC）進行了測定。由圖5可以看出，隨著核黃素濃度的增加，凝膠中核黃素載藥量（LC）呈線性增加，包封率（EE）先增加后降低。當(dāng)核黃素濃度為200μg·mL-1時包封率達到86.6%，是制備核黃素納米凝膠的最佳濃度。而天然SPI在這一蛋白濃度下（60 g·L-1）加熱仍無法形成凝膠。因此，包封性參數(shù)的測定表明SPI纖維冷凝膠可以在較低蛋白濃度下用作藥物的包封體，這有助于擴大核黃素在食品和藥物制劑中的應(yīng)用。

圖5 不同核黃素濃度的SPI纖維冷凝膠載藥量和包封率Fig.5 Drug encapsulations，loaded efficiencies of SPI fibrillar cold gels in different riboflavin concentrations

2.6 核黃素在模擬胃腸液的釋放行為

給藥系統(tǒng)的一個重要屬性是其藥物釋放過程，藥物釋放過程受到不同因素的影響，例如材料基質(zhì)的性質(zhì)（組成、結(jié)構(gòu)、膨脹和降解）、釋放介質(zhì)（pH、溫度、離子強度和酶）以及藥物（溶解性、穩(wěn)定性、電荷和可能與基質(zhì)的相互作用。而在模擬生理條件下測定藥物釋放系統(tǒng)的藥物釋放行為是非常重要的，因為它與所獲得的載體對人體健康的有效性密切相關(guān)。在模擬胃腸道條件下，核黃素從SPI纖維冷凝膠的體外釋放行為如圖6所示。凝膠中的核黃素均隨著消化時間的延長而釋放。在初始120 min內(nèi)，核黃素釋放最快，釋放量達到43.6%；當(dāng)消化240 min時，核黃素釋放量基本趨于穩(wěn)定，釋放量達到55%。說明大豆蛋白纖維冷凝膠載體在SGF中對核黃素起到了控制-釋放作用。釋放率的變化結(jié)果與凝膠溶脹的觀察結(jié)果一致。SIF中凝膠的破壞有助于核黃素釋放速率的增加，而SGF中較小的溶脹則轉(zhuǎn)化為緩慢的擴散。此外，SGF中基質(zhì)對水的吸收有助于稀釋內(nèi)部核黃素濃度，降低核黃素從基質(zhì)流向溶解介質(zhì)。劉晶等[30]的研究表明蕓豆蛋白的纖維凝膠對咖啡因的具有緩釋效果。

圖6 添加酶前后載藥SPI纖維冷凝膠在SGF、SIF中的核黃素釋放率Fig.6 Riboflavin release from SPI fibrillar cold gels in stimulated gastric fluid（SGF）and stimulated intestinal fluid（SIF）with and without enzyme

消化酶的存在是影響蛋白質(zhì)凝膠控釋性能的另一個重要因素。這是由于消化酶能夠分解蛋白質(zhì)基質(zhì)，從而加速分子的釋放。添加胃蛋白酶能夠提高核黃素的釋放量，主要是由于胃蛋白酶水解蛋白凝膠，使得凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白質(zhì)之間的相互作用減弱，核黃素迅速擴散。與SGF中核黃素的釋放曲線類似，SPI纖維冷凝膠在初始120 min內(nèi)，快速釋放核黃素；當(dāng)消化240 min時，核黃素釋放量為66%且基本趨于穩(wěn)定。添加胰蛋白酶后核黃素的釋放量升高至88%。體外評價表明，SPI纖維冷凝膠在胃腸道模擬介質(zhì)中表現(xiàn)出明顯的緩釋行為，這可以擴大其在生物活性化合物和藥物的定點遞送方面的應(yīng)用。

3 結(jié)論

SPI在pH 2.0下加熱20 h后形成的纖維，導(dǎo)致Th T熒光、ζ-電位、表觀粘度上升。然后將pH調(diào)至8.0，并加入CaCl2制得冷凝膠。與傳統(tǒng)的SPI凝膠相比，這種纖維冷凝膠可以在較低的蛋白濃度下形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，可將其用作核黃素載體。隨著核黃素濃度的增加，凝膠中核黃素載藥量呈線性增加，包封率先增加后降低。當(dāng)核黃素濃度為200μg·mL-1時包封率達到86.6%，是制備核黃素納米凝膠的最佳濃度。在模擬胃腸道條件下的核黃素體外釋放實驗也表明，SPI纖維冷凝膠表現(xiàn)出明顯的緩釋行為，可以用作核黃素的包封體。綜上所述，SPI纖維冷凝膠可以作為一種潛在的多功能載體，在較低的蛋白濃度下，將核黃素引入到食品的配方中，從而改善其保健屬性。