黑龍江省某規(guī)?；i場偽狂犬病病毒gE和gB抗體的檢測與分析

李世念，劉婉寧，丁重陽，王金濤

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種急性、熱性、高度致死性傳染病[1]。PRV屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）、α-皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）、豬皰疹病毒I型（Suidherpesvirus）。該病最早報道于1813年美國發(fā)現(xiàn)有牛死于瘙癢，1902年Aujeszky率先分離出偽狂犬病毒，1935年Shope發(fā)現(xiàn)豬對本病傳播有重要影響，1947年我國在貓中分離到該病毒。偽狂犬病毒是家畜病原中重要的神經(jīng)系統(tǒng)病原體，可感染哺乳動物、反芻動物、嚙齒動物和食肉動物[2]。其中豬作為本病毒的主要宿主和傳染源，是唯一種能夠在PRV感染后存活，一旦感染便終生帶毒、排毒；且病豬、帶毒豬既可通過直接或間接接觸在豬群中形成水平傳播，又可通過公豬精液和母豬胎盤侵害胎兒形成垂直傳播[3]。不同階段的豬感染后臨床癥狀并不相同，如妊娠母豬會發(fā)生流產(chǎn)、死胎、弱產(chǎn)子；適齡母豬不育、返情率高；育肥豬一般為發(fā)熱、出現(xiàn)生長遲緩；仔豬突然發(fā)病，體溫升高，精神極度萎靡、發(fā)抖、運動不協(xié)調(diào)、痙攣、嘔吐、腹瀉、常出現(xiàn)神經(jīng)癥和呼吸道癥狀，致死率高達100%[4]。另外，該病毒還會破壞機體免疫系統(tǒng)，致使機體免疫能力低下，從而引起其他傳染病的繼發(fā)[5]。

由于其高致死率，對豬場經(jīng)濟效益造成了嚴(yán)重?fù)p失，因此規(guī)?；i場主要采取注射豬偽狂犬gE基因缺失弱毒疫苗進行預(yù)防。根據(jù)這種預(yù)防為主的策略，我國在豬偽狂犬病防控方面已經(jīng)取得良好的效果。但隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展壯大，規(guī)模化豬場仍存在免疫程序不合理，免疫效果不明確，養(yǎng)殖環(huán)境呈現(xiàn)惡化的趨勢，使得該病始終是危害豬群健康的主要疫病之一[6]?，F(xiàn)有的研究表明，該病毒還呈現(xiàn)遺傳變異，導(dǎo)致一些已接種了偽狂犬病毒疫苗的豬場，依然爆發(fā)該病[7]?；诖?，筆者所在課題組為了解黑龍江省某規(guī)模化豬場的豬偽狂犬病野毒感染與疫苗免疫情況，于2020年四月份和七月份兩次隨機采集該規(guī)模化豬場不同階段豬只血清共395份，進行了豬偽狂犬病病毒gE和gB抗體的檢測與對比分析。旨在探究該場豬偽狂犬病免疫程序的合理性，明確免疫效果，進而為該場豬偽狂犬病的防控提供參考數(shù)據(jù)與合理性建議。

1 材料與方法

1.1 免疫程序

該規(guī)?；i場母豬存欄1 200頭，基礎(chǔ)豬群每年進行3次免疫，每頭豬肌注2頭份；仔豬及育肥豬在70 、100日齡各免疫一次，每頭豬肌注2頭份。

1.2 樣品采集

兩次用于檢測的395份血清樣本均來自該規(guī)?；i場。具體方法為使用一次性采血器在豬前腔靜脈采集血液樣品3～5 mL，采血部位示意圖如圖1所示。

圖1 血清采集部位示意圖（圖片引自李峰論文[8]）Fig l Schematic of sites used in serum collected

1.3 血清樣品

血清按照豬群比例隨機采集，室溫靜置，待血清自然析出或離心后將其移至1.5 mL離心管內(nèi)，并按照不同階段對其編號后-20℃冷凍保存?zhèn)溆?，采血分布情況如表1和表2所示。

表1 四月份采集血清分布情況Table 1 Distribution of serum collected in April

表2 七月份采集血清分布情況Table 2 Distribution of serum collected in July

1.4 主要設(shè)備與儀器

MULiskan Go自動酶標(biāo)儀，購自美國Bio Tek儀器有限公司；303A-4恒溫培養(yǎng)箱，購自北京光明醫(yī)療儀器廠；單道及多道微量移液槍，購自美國eppendorf公司；臺式冷凍離心機，購自美國Thermo公司；DNX-9620洗板機，購自上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；Easypure IIRF便攜式超純水系統(tǒng)，購自北京宏昌信科技有限公司；豬偽狂犬病病毒gE和gB抗體檢測試劑盒，購自北京愛德士元亨生物科技有限公司。

1.5 實驗前的準(zhǔn)備

取出保存在4℃冰箱內(nèi)的豬偽狂犬病病毒gE和gB抗體檢測試劑盒，室溫下靜置1～2 h，10倍濃縮洗滌液需要用蒸餾水或去離子水進行稀釋。

1.6 PRV-gE與PRV-gB抗體ELISA檢測操作流程

（1）用樣品稀釋液把待測樣品做2倍稀釋；（2）取出抗原包被板，并在登記表上備注樣品放置的位置；（3）在2到3個適當(dāng)?shù)目字屑尤?00μL，并以1∶2的稀釋比例進行陰性對比；（4）在2個適當(dāng)?shù)目字屑尤?00μL稀釋成1∶2的比例進行陽性對比；（5）在剩余的孔中各自加入100μL稀釋過的待檢測的樣品；（6）把血清或血漿樣品放置在室內(nèi)環(huán)境下，孵育1小時；（7）搖動微孔板孔中的液體，用300μL洗滌液進板孔沖洗，反復(fù)沖洗3～5次。每次清洗都應(yīng)甩掉孔中的液體，最后一次操作之后，將孔固定在吸水紙表面，吸凈表面液體；（8）在每孔中加入酶標(biāo)記的抗體100μL，放在室溫環(huán)境下，孵育20 min；（9）將步驟7再次重復(fù)；（10）在每個孔中加入100μL TMB底物溶液，放置在18～26℃的環(huán)境下，放置15 min，注意需要避光進行；（11）在每個孔中加入50μL終止溶液終止反應(yīng)；（12）借助酶標(biāo)儀讀取樣品及對比樣品650 nm處的吸光光度值。

1.7 結(jié)果判定

PRV-gE與PRV-gB抗體ELISA檢測結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)相同，陰性對照OD650平均值-陽性對照OD650平均值≥0.30，即說明檢測有效；S/N=待檢樣本OD650/陰性對照OD650均值，當(dāng)S/N值≤0.60，判定為樣品抗體陽性；當(dāng)S/N值＞0.70，判定為樣品抗體陰性；當(dāng)0.60＜S/N值≤0.70，判定為樣品可疑，需要重測。

1.8 注意事項

（1）試劑盒使用前各試劑應(yīng)平衡至室溫，使用后放回4℃冰箱；（2）檢測板拆封后避免受潮或沾水；（3）不同批號試劑盒的試劑組分不得混用，使用試劑時應(yīng)防止試劑污染；（4）本次待檢血清樣品數(shù)量較多，應(yīng)先使用血清稀釋板稀釋完所有待檢測血清，再將稀釋好的血清轉(zhuǎn)移到檢測板，使反應(yīng)時間一致；（5）濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶應(yīng)加熱使其溶解后再使用；（6）嚴(yán)格操可以得到比較好的結(jié)果，因此實驗全過程中的移液，定時和洗滌等必須精確進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬偽狂犬病病毒gE抗體的檢測和分析

由表3可與表4可知，對兩次隨機采集的245份和120份血清樣品分別進行了豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測，發(fā)現(xiàn)該場所有被檢豬只均未檢測出PRVgE抗體。基礎(chǔ)豬群、仔豬及保育育肥豬抗體平均值相對統(tǒng)一，離散度相對較小。說明豬場現(xiàn)階段沒有感染過豬偽狂犬病毒，應(yīng)繼續(xù)保持本場現(xiàn)有的生物安全防疫措施。

表3 4月份PRV-gE抗體ELISA檢測結(jié)果Table 3 Results of PRV-gE antibody ELISA in April

表4 7月份PRV-gE抗體ELISA檢測結(jié)果Table 4 Results of PRV-gE antibody ELISA in July

2.2 豬偽狂犬病病毒gB抗體的檢測和分析

由表5和表6可知，對兩次隨機采集的245份和150份血清樣品分別進行了豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測，發(fā)現(xiàn)該場基礎(chǔ)豬群豬偽狂犬病病毒gB抗體陽性率相對理想，抗體平均值穩(wěn)定，能夠為豬群提供保護。3周齡仔豬gB抗體陽性率均為100%，說明此階段母源抗體保護力極好。4月份檢測中8周齡保育豬時gB抗體陽性率降低為25%，抗體平均值達到0.724，說明此階段豬只幾乎無保護作用。兩次檢測中育肥豬各階段隨著豬只周齡的增加，豬偽狂犬病病毒gB抗體陽性率逐漸升高，其中4月份在12周齡育肥豬60%、16周齡育肥豬74%，20周齡育肥90%，育肥豬整體抗體平均值維持在0.451；7月份在16周齡育肥豬80%，22周齡育肥豬93%，育肥豬整體抗體平均值維持在0.329，兩次檢測結(jié)果說明豬只在歷經(jīng)70日齡和100日齡疫苗免疫后豬群抗體水平逐漸升高，進而為機體提供保護。

表5 4月份PRV-gB抗體ELISA檢測結(jié)果Table 5 Results of PRV-gBantibody ELISA in April

表6 7月份PRV-gB抗體ELISA檢測結(jié)果Table 6 Results of PRV-gB antibody ELISA in July

3 討論

由于豬偽狂犬病具有潛伏感染，死亡率高，致病性強等特點，在很大程度上限制了我國豬場規(guī)?；B(yǎng)殖模式的發(fā)展，故使得該病一直都是研究熱點。這些年來我國通過免疫接種，野毒監(jiān)測及凈化等技術(shù)手段，已經(jīng)使該病在豬群中得到有效控制。但是自2011年起，豬偽狂犬病再次在我國河北和山東等養(yǎng)殖密度較大的地區(qū)暴發(fā)流行，隨后疫情蔓延至我國多地，許多規(guī)?；i場都不同程度上出現(xiàn)了傳統(tǒng)疫苗免疫失敗的情況[9]。具體表現(xiàn)為接種過傳統(tǒng)疫苗的豬群再次表現(xiàn)出疑似豬偽狂犬病的臨床癥狀，感染豬的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢。經(jīng)相關(guān)毒力基因測序表明新的豬偽狂犬病病毒變異株抗原性已發(fā)生變異分屬于一個獨立的分支，變異株屬于基因II型，而傳統(tǒng)毒株屬于基因1型。變異株與經(jīng)典強毒株相比，豬偽狂犬病病毒變異株引起的臨床癥狀更明顯、致死率更高、傳播速度更快、呈現(xiàn)出毒力增強的趨勢[10]，增加了疫情的復(fù)雜化以及豬群的病死率。

因此大量研究人員對我國不同省份的豬偽狂犬病病毒展開相關(guān)研究，報道了我國華南、華北、華東等地豬偽狂犬病病毒基因變異，毒力在發(fā)生改變的相關(guān)情況。如石遠菊等[11]對豬偽狂犬病病毒貴州部分流行株的gE基因突變中發(fā)現(xiàn)gE基因核苷酸序列存在很多堿基替換；左玉柱等[12]對河北省豬場偽狂犬病病毒感染情況調(diào)查及gE基因遺傳變異分析中發(fā)現(xiàn)，河北省近幾年流行的豬偽狂犬病病毒主要為毒力增強的變異毒株；孟帆等[13]對豬偽狂犬病病毒山西分離株gE全基因的遺傳變異多樣性及流行特點分析中得出，山西豬偽狂犬病病毒gE基因發(fā)生了一定程度的變異；劉杰等[14]研究表明中國偽狂犬病病毒新變種的廣泛重組和種間快速傳播。面對豬偽狂犬病的現(xiàn)狀，馮哲[15]提出規(guī)?；i場可采取活疫苗加死疫苗的免疫防控策略，但方法無法解決規(guī)?；i場潛在感染問題，且耗時耗力，所以并不被廣泛適用，目前全球養(yǎng)豬業(yè)領(lǐng)域主要采用豬偽狂犬病病毒gE基因缺失活疫苗，并配套有豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測試劑盒，試劑盒對豬偽狂犬病病毒抗體極其敏感，非常微量的抗體水平就能夠產(chǎn)生準(zhǔn)確的結(jié)果[16]。同時基因缺失疫苗與傳統(tǒng)滅活苗相比，其優(yōu)勢也比較明顯，優(yōu)勢主要表現(xiàn)在基因缺失疫苗穩(wěn)定、不易發(fā)生毒力返祖增強、PRV基因缺失株毒力低但免疫原性強、保護時間長[17]。隨著基因缺失疫苗的研究和應(yīng)用，通過對免疫程序、免疫方式、免疫佐劑等的改變，結(jié)合血清學(xué)抗體檢測技術(shù)和野毒鑒別技術(shù)，可用于疫苗免疫豬群與自然感染豬群的鑒別診斷[18]，從而判斷豬場偽狂犬病野毒感染情況。

從試驗來看，規(guī)?；i場也采取接種豬偽狂犬病病毒gE基因缺失活疫苗的方法，同時在兩次檢測中各階段豬只豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測陽性率均為0，說明該場現(xiàn)階段并無豬偽狂犬病野毒感染的發(fā)生，且4月份和7月份兩次檢測豬只豬偽狂犬病病毒gE抗體平均值均顯著高于試劑盒0.6的判斷標(biāo)準(zhǔn)，這也說明該豬場偽狂犬病防控效果較為理想，應(yīng)繼續(xù)推進相關(guān)防疫措施的落實，以保證防疫效果穩(wěn)定的狀態(tài)。因兩次檢測的各階段豬只血清gE抗體陽性率為0，所以gB抗體檢測結(jié)果更能評估該規(guī)?；i場的豬偽狂犬病的免疫狀況。從兩次對該規(guī)?；i場gB抗體檢測檢結(jié)果來看，基礎(chǔ)豬群豬偽狂犬病病毒gB抗體陽性率維持在較高水平，抗體平均值相對均一，說明該豬場基礎(chǔ)豬群偽狂犬疫苗免疫效果良好，但免疫后一個月的效果略好于免疫后兩個月；3周齡仔豬時，gB抗體陽性率均為100%，4月份8周齡保育豬、12周齡育肥豬、16周齡育肥豬、20周齡豬育肥豬gB抗體的陽性率分別為25%、60%、74%、90%；7月份gB抗體的陽性率分別為16周齡育肥豬80%，22周齡育肥豬93%；兩次檢測結(jié)果均表明經(jīng)過兩次免疫后機體能夠產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，抗體水平顯著上升，進而為機體提供保護。根據(jù)陽性率再結(jié)合表5與表6中列出的抗體平均值可看出保育育肥豬只gB抗體陽性率和平均值出現(xiàn)了較為明顯的波動，這與楊依波[19]報道的不同日齡豬偽狂犬病毒抗體檢測陽性率始終維持在100%，抗體平均值均一、整齊的結(jié)果并不一致。3周齡時，母源抗體水平較理想，保護效果好，8周齡時母源抗體大幅降低，疫苗對保育豬幾乎無保護，這與2016年王金濤等[20]對遼寧省某規(guī)?；i場豬偽狂病的檢測中g(shù)B抗體陽性率在12、15周齡大幅下降的結(jié)果也不一致，因此規(guī)?；i場應(yīng)結(jié)合豬場實際情況，查明導(dǎo)致8周齡豬只gB抗體大幅下降的原因，同時應(yīng)增加8周齡前后豬只的采血檢測，確定母源抗體的維持時間，從而確定豬只的首免日齡，制定出更加合理的免疫程序和防疫措施，以降低該周齡段豬群被感染的幾率。

面對豬偽狂犬病的現(xiàn)狀，有研究人員對新出現(xiàn)的PRV變異株進行了進一步的研究，已制備出PRV-gB和PRV-gE的單克隆抗體[21-22]。有望建立廣泛適用的評價疫苗免疫效果的抗體ELISA試劑盒，并為抗病毒藥物設(shè)計和疫苗研發(fā)提供指導(dǎo)，當(dāng)然這還需要一定的時間。因此規(guī)?；i場想要擺脫豬偽狂犬病的威脅，除了制定完善的免疫程序與疫苗評估體系外，還應(yīng)加強飼養(yǎng)管理和消除傳播媒介等幾個方面著手[23]。首先要基于豬場具體的檢疫情況制定合理的免疫程序，通常以豬場陽性率10%作為臨界水平，陽性率高于10%時一般采取密集免疫形式，低于10%時采取一般免疫形式。同時定期對豬群PR陽性率進行監(jiān)測，并根據(jù)監(jiān)測結(jié)果及時調(diào)整免疫程序，根據(jù)毒株流行情況指導(dǎo)疫苗選擇[24]，對于疑似隱性帶毒豬要制定合理的免疫方案并嚴(yán)格按照免疫程序執(zhí)行。同時利用ELISA法檢測豬群抗體水平掌握豬群潛伏感染情況，對于陽性豬，隱性帶毒豬一律采取淘汰，撲殺的處理方式，從源頭上阻斷PRV的感染和傳播。同時加強飼養(yǎng)管理，基于飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)針對豬群制定科學(xué)合理的飼養(yǎng)方案[25]，滿足機體的營養(yǎng)需求。同時營造干凈衛(wèi)生的飼養(yǎng)環(huán)境，對豬舍進行定期消毒以預(yù)防病原傳播，消毒時以多種消毒藥物交替使用為宜。消除傳播媒介對于PRV感染的防控同樣重要，規(guī)模化養(yǎng)豬場要構(gòu)建一套適用于豬場自身條件的生物安全體系，根據(jù)豬種類的不同實行分群飼養(yǎng)對進入豬場的車輛和人員進行嚴(yán)格消毒。另外鼠類作為PRV的主要帶毒者和傳播媒介應(yīng)給予高度重視。在做好定期滅鼠工作的同時也要注意飼料保存，避免用于投喂的飼料被鼠代謝物污染。并處理好病死豬，以及動物糞便，對種豬和仔豬都要進行定期免疫，對于繁育豬和育肥豬，外來引進豬群要進行定期血清學(xué)檢測，做到對感染情況的及時管控，從而阻隔豬偽狂犬病的蔓延。

4 結(jié)論

綜上所述，該規(guī)模化豬場各階段豬只偽狂犬病病毒gE抗體檢測陽性率均為零，豬場基礎(chǔ)豬只偽狂犬病病毒gB抗體陽性率較理想，雖然8周齡保育豬gB抗體陽性率較低，感染風(fēng)險較大，但是經(jīng)過兩次免疫后抗體水平逐漸上升，并對機體提供了保護。