鴨呼腸孤病毒TaqMan與SYBR Green熒光定量檢測方法的建立及比較

陸 婧，李 敏，王 艷，朱盈名， 趙自亮， 鄧欣竹， 劉 霞， 張立武， 程方俊*， 趙光偉* (.西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)免疫研究中心，重慶060；.上海海關(guān)，上海 005；.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008；.重慶三捷眾新生物工程有限公司，重慶060)

新型鴨呼腸孤病毒病是由新型鴨呼腸孤病毒(novel duck orthoreovirus,NDRV)引起的一種急性傳染病，該病可發(fā)生于雛番鴨、雛半番鴨、櫻桃谷北京鴨及其他品種雛鴨[1-3]，多發(fā)于7～35日齡鴨。感染鴨出現(xiàn)精神沉郁、腹瀉、死亡鴨喙呈紫黑色等癥狀[4]。剖檢發(fā)病鴨常見肝臟明顯腫大，脾臟壞死[5]。該病在我國南方水禽飼養(yǎng)區(qū)廣泛流行，疫區(qū)有逐年擴(kuò)大的趨勢，給我國水禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

NDRV屬于呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬，為分節(jié)段的雙股RNA病毒，含有10個(gè)RNA片段：Ll、L2、L3、M1、M2、M3、S1、S2、S3、S4[7-9]。其中S1基因的第3個(gè)ORF為σC基因，該基因編碼σC蛋白，σC蛋白為NDRV結(jié)合細(xì)胞受體的主要位點(diǎn)，對病毒的吸附、增殖與合胞體的形成起重要作用[10]。而MDRV的σC是由S4基因編碼，且NDRV的S3基因與MDRV和ARV的分子特征具有很大的區(qū)別,故可以根據(jù)S1的差異對病原進(jìn)行分類[11-12]。通過對本試驗(yàn)毒株DRV-SL株(GenBank登錄號為MW196679-MW196688)測序和比對發(fā)現(xiàn)，該毒株與GenBank中已公布NDRV流行毒株親源性較近，但各片段所編碼的氨基酸序列均存在不同的差異，同源性為99.63%～94.37%，其中屬S1片段的變異性最大，同源性為94.37%～98.64%，推斷該毒株是鴨呼腸孤病毒(duck orthoreovirus,DRV)變異株的一種。

目前該病的診斷方法有中和試驗(yàn)、瓊擴(kuò)試驗(yàn)、RT-PCR等。但這些方法耗時(shí)久、準(zhǔn)確性低、且操作復(fù)雜，不適用于該病的快速診斷[13-14]。最常用的NDRV熒光定量檢測方法是TaqMan和SYBR Green法[15]。由于對NDRV致病機(jī)制的研究尚少[16]，目前各地建立的NDRV熒光定量檢測方法對于其他地區(qū)出現(xiàn)的變異株具有不可靠性[17]。為此，本試驗(yàn)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的DRV-SL株S1基因全序列，設(shè)計(jì)合成1對特異性引物和1條MGB探針，建立檢測NDRV的TaqMan探針和SYBR GreenⅠ熒光定量檢測方法，并對比兩種方法在準(zhǔn)確性、特異性、重復(fù)性、靈敏性等方面存在特點(diǎn)，最終確定適用臨床快速檢測NDRV方法。

1 材料與方法

1.1 毒株新型鴨呼腸孤病毒(novel duck reovirus SL,DRV-SL)由本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)病鴨的肝臟、脾臟等組織分離獲得(GenBank登錄號為MW196679-MW196688);番鴨細(xì)小病毒(DPV)、A 型鴨甲肝病毒( DHV-1)、C型鴨甲肝病毒( DHV-3)、鴨傳染性支氣管炎(IBV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、鵝星狀病毒(JSHV)毒株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑病毒核酸提取試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ、Probe qPCR Mix、DNA Marker購自TaKaRa公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；pBLUE -T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成參照S1基因全序列，設(shè)計(jì)合成1對引物，上游引物F1：5′-TGAGACGCCTGACTACGATT-3′；下游引物R1:5′-ATGCTTGGAGTGAGACGACT-3′。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為380 bp。根據(jù)GenBank已發(fā)布的DRVS1基因序列(GenBank登錄號：MW196682)，利用NCBI的Primer引物設(shè)計(jì)功能和BLAST檢索工具，設(shè)計(jì)合成1對特異性熒光引物和1條MGB探針，上游引物P1：5′-TTGTAGGTGCAAGGGAGCTT-3′，下游引物P2：5′-GCAGACGTCCACTCTAACGA-3′；MGB探針：FAM-TCGGCGCACCACCCGA-TCGT-MGB，該探針5′端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM,3′端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為MGB。熒光引物預(yù)擴(kuò)增片段為139 bp，所有引物和探針均由華大基因科技有限公司合成。

1.4 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備按照病毒核酸提取試劑盒操作說明提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板，F(xiàn)1和F2為引物，反應(yīng)體系：rTaq Mix 12.5 μL，無菌ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s,共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增獲得特異性目的條帶，經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒切膠回收后,將目的片段克隆至pBLUE-T載體中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α細(xì)胞，接入含氨芐青霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，送華大基因科技有限公司測序。經(jīng) PCR和測序鑒定無誤后，通過NanoDrop2000分光光度計(jì)測定質(zhì)粒的DNA濃度，并按照以下公式換算為拷貝數(shù)，拷貝數(shù)=阿伏伽德羅常數(shù)×濃度×10-9/(片段大小×660)，獲得陽性質(zhì)粒的拷貝數(shù)為 1.89×1010拷貝/μL，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)程序及體系優(yōu)化以制備的陽性標(biāo)準(zhǔn)品為模板，采用20 μL反應(yīng)體系。通過矩陣法對TaqMan探針法的探針和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，同樣對SYBR GreenⅠ法的引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳反應(yīng)體系。通過設(shè)置不同的退火溫度，根據(jù)反應(yīng)擴(kuò)增曲線最小Ct值和最高熒光值為標(biāo)準(zhǔn)，確定最佳退火溫度，最終獲得最佳反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件。反應(yīng)條件：TaqMan法：95℃ 3 min；95℃ 10 s，55～60℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。SYBR Green Ⅰ法：95℃ 30 s；95℃ 5 s，55～60℃ 20 s，共40 個(gè)循環(huán)。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將制備的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按10倍倍比稀釋，獲得1×109～1×103拷貝/μL系列標(biāo)準(zhǔn)模板，利用1.5中優(yōu)化好的條件進(jìn)行TaqMan和SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以起始模板量拷貝數(shù)的對數(shù)作為橫坐標(biāo)，Ct 值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 敏感性試驗(yàn)將制備的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按10倍極限稀釋后，取1×109～1×10-2拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，同時(shí)設(shè)置無菌ddH2O為陰性對照，利用1.5中優(yōu)化好的條件分別進(jìn)行TaqMan和SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得兩種檢測方法的最低檢測限度，比較兩種方法的靈敏度。

1.8 特異性試驗(yàn)按照1.5中建立的優(yōu)化反應(yīng)體系，分別以DPV、DHV-1、DHV-3、IBV、DTMUV、JSHV核酸作為模板，以稀釋后為1×106拷貝/μL NDRV陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，以無菌ddH2O為陰性對照，以1.5中建立的最優(yōu)反應(yīng)條件分別進(jìn)行TaqMan和SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測并比較兩種方法的特異性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)取上述稀釋質(zhì)粒(109～105拷貝/μL) 共5個(gè)濃度的質(zhì)粒作為模板，用1.5中已優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行組間和組內(nèi)的TaqMan和SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。根據(jù)計(jì)算出Ct 值平均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)(CV)，從而比較兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

1.10 臨床樣品的檢測利用已建立的兩種qRT-PCR檢測方法，分別對本實(shí)驗(yàn)收集的30份疑似NDRV的病料(肝臟和脾臟)進(jìn)行檢測，比較兩種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 引物的特異性及陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備以cDNA為模板，分別用F1,F2和P1、P2這2對引物進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，得到大小約380，139 bp的2條目的片段，與預(yù)期片段大小相符(圖1)。通過測序驗(yàn)證，確定為DRV。構(gòu)建的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為69.62 mg/L，經(jīng)轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)為1.89×1010拷貝/μL。

M.DL5000 DNA Marker；1.熒光引物；2.RT-PCR引物

2.2 反應(yīng)程序及體系的優(yōu)化通過改變反應(yīng)體系中引物和探針濃度、退火溫度，確定最終的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。TaqMan法：Probe qPCR Mix(2×)10.0 μL，MGB探針0.2 μL，上、下游引物(P1,P2)各0.8 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 7.2 μL，共20 μL體系。反應(yīng)程序:95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s。SYBR Green Ⅰ 法：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，上、下游引物(P1,P2)各0.8 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 6.4 μL，共20 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，共40 個(gè)循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用1.89×109～1.89×103拷貝/μL系列重組質(zhì)粒作為模板，分別進(jìn)行TaqMan和SYBR GreenⅠ熒光定量PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增動力學(xué)曲線，以起始拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式：SYBR GreenⅠ:y=-3.576 9x+34.225，相關(guān)系數(shù)R2=0.999(圖2A)。TaqMan：y=-3.028 6x+24.714,相關(guān)系數(shù)R2=0.999(圖2B)。溶解曲線呈現(xiàn)單一峰，無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，Tm值為 85.5℃左右。

A.SYBR GreenⅠ熒光定量 PCR 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線;B.TaqMan熒光定量 PCR 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 敏感性試驗(yàn)用建立的兩種方法對10倍極限稀釋的系列陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒(1.89×109～1.89×10-2拷貝/μL)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。兩種方法陽性標(biāo)準(zhǔn)品均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，陰性對照無熒光擴(kuò)增，結(jié)果表明，TaqMan法最低可以檢出的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.0×101拷貝/μL(圖3A)，SYBR GreenⅠ法最低可以檢出的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.0×100拷貝/μL(圖3B)。

A.SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量 PCR敏感性試驗(yàn);B.TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量 PCR敏感性試驗(yàn)；1～12.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度分別為1.89×109～1.89×10-2拷貝/μL；13.陰性對照

2.5 特異性試驗(yàn)用已建立的兩種方法同時(shí)對NDRV、DPV、DHV-1、DHV-3、IBV、DTMUV、JSHV進(jìn)行檢測，除了NDRV為陽性以外，其余均為陰性(圖4A,B)。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)用已建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對5個(gè)拷貝數(shù)的陽性標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行3次批內(nèi)和3次批間的重復(fù)試驗(yàn)(5A,B)，結(jié)果顯示SYBR GreenⅠ法的具有組間和組內(nèi)CV均小于2.1%(表1)，TaqMan法的組間和組內(nèi)CV均小于1.8%(表2)。

2.7 臨床樣品的檢測使用已建立的兩種熒光定量PCR檢測方法，分別對收集的30份疑似NDRV的病料(肝臟和脾臟)進(jìn)行檢測，SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢出30份(圖6A)，檢出率為100%；TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢出29份(圖6B)，檢出率為97%，兩種熒光定量PCR方法的檢測符合率為97%。

A.SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的特異性試驗(yàn)；B.TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的特異性試驗(yàn)。1～7.分別為NDRV、DHV-1、DHV-3、IBV、DTMUV、JSHV

A.SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法重復(fù)性試驗(yàn);B.TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法重復(fù)性試驗(yàn)。1～5.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度分別為1.89×109～1.89×105拷貝/μL

圖5 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)

表2 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 重復(fù)性試驗(yàn)

A.SYBR GreenⅠ 熒光定量PCR臨床檢測試驗(yàn);B.TaqMan-MGB 熒光定量PCR臨床檢測試驗(yàn)

3 討論

NDRV、MDRV和ADV都是禽正呼腸孤病毒，生物學(xué)特征表現(xiàn)基本相同，但是臨床和抗原性表現(xiàn)有很大不同，NDRV感染宿主譜更廣，可引起各品種鴨及鵝感染發(fā)病，且致病性也更強(qiáng)[18-19]。其次，在L、M和S群基因組片段中，S群基因組片段序列變異性最大，S1基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白σC和非結(jié)構(gòu)蛋白P10序列變異性最大[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，造成NDRV致病性增強(qiáng)、致病宿主譜擴(kuò)大的原因可能與結(jié)構(gòu)蛋白σC的變異有關(guān)[22]。隨著NDRV致病性的增強(qiáng)和宿主范圍的不斷擴(kuò)大，對NDRV的防控難度也不斷增大。建立一種快速、準(zhǔn)確、敏感的NDRV檢測方法是臨床上防控該病的前提。

熒光定量PCR方法因?yàn)槠淇焖佟⒛芏?、且靈敏度高于普通PT-PCR的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床診斷[23]。目前常用于檢測NDRV的熒光定量PCR方法主要是探針法和染料法(如TaqMan和SYBR GreenⅠ/Ⅱ)[24]。TaqMan-MGB探針是一種新型的TaqMan探針類型，與其他類型相比，MGB探針具有本身不發(fā)光的優(yōu)點(diǎn)，且由于MGB基團(tuán)的修飾，可以使探針的Tm值在不增加堿基數(shù)的前提下增加10℃左右，既降低了合成成本，也使得探針的設(shè)計(jì)成功率大大提高[25]。SYBR Green Ⅰ法是現(xiàn)在最常用的一種熒光定量檢測方法，具有操作簡單成本低的特點(diǎn)[13]。為了建立一種最快速、準(zhǔn)確的NDRV熒光定量檢測方法，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)DRV-SL的S1全基因序列設(shè)計(jì)合成了1對特異性引物和1條特異性MGB探針，通過對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了基于TaqMan探針和SYBR GreenⅠ檢測模式的兩種熒光定量PCR方法。這兩種方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好(R2=0.999),其中TaqMan方法的最低檢測限度為101拷貝/μL，SYBR GreenⅠ為100拷貝/μL，后者比前者的敏感度高了1個(gè)數(shù)量級。兩種方法對DPV、DHV-1、DHV-3、IBV0、DTMUV、JSHV的檢測結(jié)果均為陰性，僅NDRV的檢測結(jié)果為陽性，說明兩種方法都具有很好的特異性。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，SYBR GreenⅠ和TaqMan法的組間和組內(nèi)變異系數(shù)均分別小于2.1%和1.8%，說明TaqMan具有更好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。利用已建立的兩種熒光定量PCR方法對30份NDRV疑似病料進(jìn)行檢測，TaqMan方法檢出29份陽性，檢出率為97%；SYBR GreenⅠ方法檢出30份陽性，檢出率為100%，TaqMan方法與SYBR GreenⅠ方法的符合率為97%?？傮w來看本試驗(yàn)建立的兩種檢測方法中，SYBR GreenⅠ法更優(yōu)于TaqMan法。

由于TaqMan與SYBR GreenⅠ 兩種方法的檢測原理和方法不同，導(dǎo)致這兩種熒光定量檢測方法具有各自的特點(diǎn)，如探針法的檢測時(shí)間比SYBR GreenⅠ短，準(zhǔn)確性也更高，但是在反應(yīng)體系中額外加入探針溶液，增加了反應(yīng)體系被污染的風(fēng)險(xiǎn)，且探針的成本比SYBR GreenⅠ高。SYBR GreenⅠ方法雖然容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和引物二聚體但可通過優(yōu)化引物最大程度的避免，且SYBR GreenⅠ法操作簡單，被污染的可能性較探針法小，所以SYBR GreenⅠ法更適合用于NDRV臨床樣本的檢測。本試驗(yàn)將有助于選擇合適的NDRV檢測方法，對NDRV的防治起到一定作用。