不同矮牽牛品種花香成分差異分析研究

郝瑞杰，張忠強(qiáng)，楊姝婷，張雅靜

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801）

矮牽牛（Petunia hybrida）為茄科（Solanaceae）碧冬茄屬（Petunia）植物，原產(chǎn)南美溫帶地區(qū)，矮牽?；ㄉS富、開花繁茂，是重要的園林綠地栽植花卉［1］。矮牽牛遺傳背景明晰，構(gòu)建再生體系容易，加之較大的花冠和獨(dú)特的香味，矮牽牛已成為花香、花色研究領(lǐng)域模式植物之一［2］。

花香是花卉的重要觀賞性狀，隨著氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)的深入應(yīng)用，數(shù)百種香花植物的芳香成分已被成功鑒定，研究發(fā)現(xiàn)不同香花植物之間芳香成分差異顯著，而同一花卉不同品種之間由于親本差異，其芳香性狀也各具特點(diǎn)［3］?，F(xiàn)有矮牽牛品種來源于野生原種P.axil?laris和P.integrifolia的雜交后代，二者花型及花香都具有明顯區(qū)別，Verdonk 等研究了矮牽?！甅itchell W115’的花香成分，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)物以苯環(huán)類化合物為主，由此在后續(xù)研究中逐漸確立了矮牽牛作為苯環(huán)類揮發(fā)物研究的模式植物地位［4］。

矮牽牛品種繁多，各品種間花香性狀差異較大，在當(dāng)前“康養(yǎng)”概念的助推下，芳香型矮牽牛品種越來越受到人們的青睞，因此系統(tǒng)開展矮牽牛品種花香特征研究意義重大。本研究以8 個(gè)系列12 個(gè)品種矮牽牛為試驗(yàn)材料，利用嗅覺對(duì)其香味濃淡程度進(jìn)行分類，同時(shí)采用HS-SPME 與GCMS 技術(shù)，對(duì)其盛花期花冠的花香成分進(jìn)行了檢測，并通過主成分分析與聚類分析確定了不同品系矮牽?；ㄏ愠煞值膮^(qū)別，以期為后續(xù)矮牽牛種質(zhì)評(píng)價(jià)及香花育種的開展奠定基礎(chǔ)，并為矮牽牛香花機(jī)制的闡明提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的12 個(gè)矮牽牛品種均購自美國泛美種業(yè)，分別為‘地毯藍(lán)色’、‘地毯白色’、‘海市蜃樓藍(lán)色’、‘海 市 蜃 樓 白 色’、‘輕 浪 李 紋’、‘輕 浪 紅 絲絨’、‘輕 浪 黎 明 玫 紅’、‘輕 浪 白 色’、‘二 重 唱 藍(lán)色’、‘旋轉(zhuǎn)玫紅’、‘雙瀑布藍(lán)色’。挑選長勢旺盛且一致的盆栽苗，于測試前12 h 移入實(shí)驗(yàn)室以適應(yīng)環(huán)境條件，摘取各品種盛花期花冠進(jìn)行測定，各品種花冠如圖1 所示。

圖1 12 個(gè)品種矮牽牛盛花期花冠Fig.1 Corolla of 12 P.hybrida varieties in full bloom

試驗(yàn)儀器：Trace 1300 氣相色譜儀（Thermo 公司），Trace ISQ 質(zhì)譜分析儀（Thermo 公司），TDL-4 分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）、萃取頭（Supelco，50/30 μm PDMS/DVB/CAR）、固相微萃取樣品瓶（江蘇杰島玻璃制品有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

香型分類：隨機(jī)選擇15 名志愿者對(duì)12 個(gè)品種矮牽?；ɑㄏ氵M(jìn)行感官評(píng)價(jià)，以人體嗅覺器官對(duì)其香味濃淡程度進(jìn)行描述并分類［5］。

SPME 吸附條件：固相微萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口老化10 min，老化溫度270 ℃。摘取盛花期的矮牽?；ü?.6 g 放置于15 mL 固相微萃取樣品瓶中，30 ℃條件下孵化30 min，頂空萃取10 min，自動(dòng)進(jìn)樣，在進(jìn)樣口解析5 min。

GC（Gas Chromatography）工作條件：色譜柱DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；以He 為載氣，流 速1.0 mL·min-1；初 始 溫 度40 ℃，保 持2 min，以4 ℃·min-1升溫至180 ℃，保持3 min，再以10 ℃·min-1升溫至240 ℃，保持2 min。

MS（Mass Spectrometry）工作條件：電離方式為電子電離（Electronic Ionization），傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度280 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)譜掃描范圍45~500 amu。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

揮發(fā)成分鑒定采用NIST08 譜庫檢索結(jié)合人工解析圖譜共同確定，各組分的相對(duì)百分含量依據(jù)總離子流各色譜峰面積歸一法計(jì)算。用SPSS20 進(jìn)行主成分分析，用Origin95、NTSYSpc-2.10e、Canoco5 進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 矮牽?；ü谛誀罘治?/h3>

如圖2 所示，12 個(gè)品種矮牽?；ü谠陬伾?、冠徑、香型等方面均存在較大差異。觀察各品種顏色可知，‘地毯藍(lán)色’、‘海市蜃樓藍(lán)色’、‘二重唱藍(lán)色’、‘雙瀑布藍(lán)色’均為藍(lán)色，但‘地毯藍(lán)色’顏色相對(duì)較淺，‘地毯白色’、‘海市蜃樓白色’、‘輕浪白色’、‘錦浪椰子白’均為白色，且基本無顏色差別。在冠徑方面，‘雙瀑布藍(lán)色’冠徑最大，為5.92 cm，其次為‘旋轉(zhuǎn)玫紅’、‘二重唱藍(lán)色’、‘海市蜃樓白色’、‘海市蜃樓藍(lán)色’，均在5 cm 以上。其余品種除‘輕浪白色’、‘錦浪椰子白’以外，冠徑均在4~5 cm 之間，無較大差異?！\浪椰子白’冠徑最小，僅有2.67 cm。根據(jù)試驗(yàn)者對(duì)花冠香味濃淡程度的描述，按芳香類型將12 個(gè)品種分為芳香型、清香型、淡香型3 類，其中‘地毯藍(lán)色’、‘二重唱藍(lán)色’、‘雙瀑布藍(lán)色’3 個(gè)品種香氣最濃，為芳香型；‘地毯白 色’、‘海 市 蜃 樓 藍(lán) 色’、‘輕 浪 李 紋’、‘輕 浪 紅 絲絨’、‘輕 浪 黎 明 玫 紅’、‘旋 轉(zhuǎn) 玫 紅’為 清 香 型；‘海市蜃樓白色’、‘輕浪白色’、‘錦浪椰子白’3 個(gè)品種香氣最淡，為淡香型。

圖2 12 個(gè)品種矮牽牛盛花期花冠性狀分析Fig.2 Analysis on corolla characters of 12 P.hybrida vari?eties in full flowering period

2.2 矮牽牛揮發(fā)成分類型

2.2.1 矮牽牛揮發(fā)成分種類分析

經(jīng)GC-MS 檢測，在12 個(gè)品種矮牽?；ǘ鋼]發(fā)物中共檢測出66 種成分，其中‘地毯藍(lán)色’與‘地毯白色’揮發(fā)成分最多，各含有18 種成分，而‘輕浪紅絲絨’揮發(fā)成分最少，僅含5 種。由表1 可見花香成分共包括醚類、醇類、酮類、酯類、萜類、烯類、醛類、芳香烴類、脂肪酸類、烷烴類10 大類?！靥核{(lán)色’和‘輕浪白色’所含種類最多，均為7 類；‘輕浪李紋’、‘輕浪黎明玫紅’、‘旋轉(zhuǎn)玫紅’3 個(gè)品種包含的種類最少，只有4 類。

不同矮牽牛品種間花香成分種類及數(shù)量差異較為明顯（表1），烯類物質(zhì)在12 個(gè)品種中均可檢測出來，同時(shí)也是檢測出種類最多的香氣成分，在12個(gè)品種中共檢測到17 種，其中‘輕浪白色’中檢測出的烯類化合物最多，達(dá)9 種；酯類物質(zhì)在12 個(gè)品種中共檢測出15 種，可在11 個(gè)品種中檢測到，其中含有酯類最豐富的品種是‘輕浪李紋’，達(dá)8 種。醇類物質(zhì)在12 個(gè)品種中共檢測出12 種，‘海市蜃樓藍(lán)色’中最多，有4 種。酮類、萜類、脂肪酸類化合物在12 個(gè)品種中均較少，各類僅檢測到1 種。

表1 12 個(gè)品種矮牽牛的花香種類Table1 Classification of floral components in 12 P.hybrida varieties

2.2.2 矮牽牛各類揮發(fā)成分的相對(duì)含量

矮牽牛各類揮發(fā)成分的相對(duì)含量如表2 所示，醚類、醇類、脂類、萜類、烯類化合物相較于其它種類化合物相對(duì)含量較高。在‘海市蜃樓白色’、‘輕浪紅絲絨’中，醚類化合物所占比例均高于60%，在‘海市蜃樓藍(lán)色’中也高于30%；在‘海市蜃樓藍(lán)色’、‘二 重 唱 藍(lán) 色’、‘錦 浪 椰 子 白’、‘旋 轉(zhuǎn) 玫 紅’4個(gè)品種中，醇類化合物所占比例均高于20%，在‘地 毯 藍(lán) 色’、‘地 毯 白 色’、‘輕 浪 李 紋’、‘輕 浪 白色’中有少量醇類化合物；酯類化合物在‘地毯藍(lán)色’、‘地毯白色’、‘輕浪黎明玫紅’3 個(gè)品種中的相對(duì)含量極高，均高于80%，遠(yuǎn)高于其它9 個(gè)品種。萜類、烯類化合物在‘旋轉(zhuǎn)玫紅’、‘雙瀑布藍(lán)色’2個(gè)品種中的相對(duì)含量均高于20%。

2.3 矮牽牛關(guān)鍵芳香成分分析

比較12 個(gè)矮牽牛品種的主要芳香成分，由表2可見，2-甲基丁酸甲酯、三環(huán)萜、β-蒎烯、（S）-（-）-檸檬烯、苯甲酸甲酯分別為各品種主要揮發(fā)物。進(jìn)一步分析其相對(duì)含量可知（圖3），2-甲基丁酸甲酯在除‘海市蜃樓藍(lán)色’之外的11 個(gè)品種中均有揮發(fā)，但相對(duì)含量卻有很大差異，‘輕浪李紋’中2-甲基丁酸甲酯相對(duì)含量為90.22%。三環(huán)萜是矮牽?；ㄏ阒形ㄒ坏妮祁愇镔|(zhì)，在‘雙瀑布藍(lán)色’中相對(duì)含量達(dá)56.49%。（S）-（-）-檸檬烯在除‘海市蜃樓藍(lán)色’、‘二重唱藍(lán)色’之外的10 個(gè)品種中均有揮發(fā)，但在‘海市蜃樓白色’中占比最高，達(dá)26.41%。苯甲酸甲酯在‘地毯藍(lán)色’、‘地毯白色’、‘輕浪黎明玫紅’、‘錦浪椰子白’4 個(gè)品種中特異揮發(fā)，其中在‘地毯藍(lán)色’中占比極高，可達(dá)97.49%。

表2 12 個(gè)品種矮牽牛揮發(fā)成分及相對(duì)含量Table2 Volatile components and relative contents in 12 P.hybrida varieties

圖3 12 個(gè)品種矮牽牛花香關(guān)鍵成分占總釋放量百分比Fig.3 Percentage of key components accounting for total release amount in 12 P.hybrida varieties

2.4 矮牽牛芳香性狀主成分分析

主成分分析可以較為清晰的表明品種與揮發(fā)成分之間的聯(lián)系，并在一定程度上確定揮發(fā)物中的致香成分［6］。如圖4 所示，苯甲醛、苯甲醇、苯甲酸甲酯等苯環(huán)類物質(zhì)集中于第一象限，對(duì)‘地毯藍(lán)色’、‘地毯白色’、‘輕浪黎明玫紅’3 個(gè)品種有較大的正向影響；第二象限僅有‘海市蜃樓白色’、‘輕浪紅絲絨’兩個(gè)品種，其中（S）-（-）-檸檬烯、正己醚、二甲醚等物質(zhì)對(duì)其有較大的正向影響；第三象限5 個(gè)品種分布較為分散，其中三環(huán)萜與‘海市蜃樓藍(lán)色’、‘雙瀑布藍(lán)色’相關(guān)性最大，而乙醇和2-甲基丁酸甲酯則可以較好的解釋‘旋轉(zhuǎn)玫紅’、‘二重唱藍(lán)色’兩個(gè)品種，‘輕浪李紋’雖位于第三象限，但靠近原點(diǎn)，與橫軸和縱軸的距離都過近，單獨(dú)的芳香成分不能較好的解釋這一品種；位于第四象限的品種有‘輕浪白色’、‘錦浪椰子白’，β-蒎烯、3-甲基己烷、3-甲基戊烷等物質(zhì)與其的相關(guān)性較大，其中β-蒎烯與‘輕浪白色’的分布極為接近，說明其確實(shí)是‘輕浪白色’的關(guān)鍵致香物質(zhì)之一。

圖4 12 個(gè)品種矮牽?；ㄏ愠煞諴CA 分析Fig.4 PCA analysis of floral components in 12 P.hybrida varieties

2.5 聚類分析

以12 個(gè)矮牽牛品種的66 種揮發(fā)成分為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)建立遺傳相似矩陣，分別用數(shù)字0 和1 表示某一揮發(fā)成分的有無，含有此種揮發(fā)成分的數(shù)據(jù)賦值為1，沒有或未檢測到該種香氣成分的數(shù)據(jù)賦值為0，以此進(jìn)行聚類分析［7］。如圖5 所示，相似系數(shù)0.68 附近第一次分支，矮牽牛12 個(gè)品種被分為兩類：第一大類包括11 個(gè)品種，第二大類僅1 個(gè)品種：‘輕浪白色’。在相似系數(shù)0.72 附近又將第一大類分為兩類：第Ⅰ類包含2 個(gè)品種，‘地毯藍(lán)色’、‘地毯白色’，第Ⅱ類為其余9 個(gè)品種。在相似系數(shù)0.79 附近，又可將第Ⅱ類9 個(gè)品種分為3 小類：‘海市 蜃 樓 藍(lán) 色’、‘海 市 蜃 樓 白 色’、‘輕 浪 李 紋’、‘輕浪 紅 絲 絨’、‘輕 浪 黎 明 玫 紅’、‘二 重 唱 藍(lán) 色’、‘旋轉(zhuǎn)玫紅’被聚為1 小類，‘錦浪椰子白’與‘旋轉(zhuǎn)玫紅’2 個(gè)品種各為1 小類。分析可知同一系列品種間遺傳關(guān)系基本較為接近，如‘地毯系列’、‘海市蜃樓系列’，但在‘輕浪’系列中，‘輕浪白色’與其余3 個(gè)品種卻顯示出較遠(yuǎn)的遺傳距離。

圖5 12 個(gè)品種矮牽?；ㄏ愠煞值木垲怓ig.5 Cluster dendrogram of floral components in 12 P.hybrida varieties

續(xù)表

續(xù)表

3 討論與結(jié)論

花香是觀賞植物重要的觀賞性狀之一，近年來已經(jīng)成為國內(nèi)外觀賞植物的熱門研究領(lǐng)域。根據(jù)芳香成分的合成途徑，植物花香主要由萜烯類、苯環(huán)類及苯丙素類、脂肪酸及其衍生物等組成［8］。本研究利用GC-MS 技術(shù)對(duì)12個(gè)品種的矮牽牛盛花期花冠的揮發(fā)成分進(jìn)行測定，共檢測出66 種化合物，分屬酯類、萜類等10類揮發(fā)物，這與袁媛在9個(gè)蕙蘭品種花朵中檢測到10類揮發(fā)物的結(jié)果相似［9］，但是矮牽牛各品種之間揮發(fā)物類型區(qū)別較大，結(jié)合各品種花香的嗅覺評(píng)價(jià)，具有芳香性狀的‘地毯藍(lán)色’系列揮發(fā)物類型較多，與百合［10］、芍藥［11］等的研究一致，芳香型品種都擁有更為豐富的揮發(fā)物類型。揮發(fā)成分多屬于植物次生代謝產(chǎn)物，其生物合成需要通過復(fù)雜的代謝通路完成［12］，花朵各類型揮發(fā)物往往處于各代謝通路中的不同節(jié)點(diǎn)，而酯類物質(zhì)多屬于代謝終端產(chǎn)物［13］，本研究發(fā)現(xiàn)芳香型矮牽牛品種能大量揮發(fā)酯類物質(zhì)，且相關(guān)品系矮牽牛揮發(fā)物類型更為豐富。

植物花朵芳香特征往往由花朵關(guān)鍵揮發(fā)成分決定，通過一種或多種芳香成分形成其具有識(shí)別性的芳香特征。梅花中乙酸苯甲酯與丁子香酚共同構(gòu)成了梅花的典型梅香［14］，香茅醇、苯乙醇等共同構(gòu)成了玫瑰的芳香特征［15］。本研究通過主成分分析確定了各品種的關(guān)鍵芳香成分，但是各關(guān)鍵成分表現(xiàn)出了不同的嗅覺特點(diǎn)，萜烯類物質(zhì)中三環(huán)萜、β-蒎烯、（S）-（-）-檸檬烯在矮牽?；ㄖ姓加休^高的比重，該類物質(zhì)在細(xì)莖石斛花朵［16］、黃連木葉片［17］中均有揮發(fā)，但并沒有表現(xiàn)出鮮明的芳香特征。‘地毯’系列主要揮發(fā)酯類物質(zhì)，尤其是苯甲酸甲酯的揮發(fā)量占到了全部揮發(fā)量的95%以上，主成分分析結(jié)果也表示苯甲酸甲酯與‘地毯系列’和‘輕浪黎明玫紅’有最高的相關(guān)性。苯甲酸甲酯具有強(qiáng)烈的芳香氣味，可以用作香水的基礎(chǔ)液［18］，且在芳香型矮牽牛中的揮發(fā)量極高，因此有理由相信苯甲酸甲酯是本次研究對(duì)象芳香型矮牽牛品種的特征芳香成分。

不同矮牽牛品種中花香成分的揮發(fā)量均存在較大差異，主成分分析結(jié)果表明二甲醚是‘海市蜃樓白色’、‘輕浪紅絲絨’的關(guān)鍵成分，聚類分析結(jié)果顯示二者遺傳關(guān)系密切。2-甲基丁酸甲酯在所有品種中幾乎都有揮發(fā)，但其相對(duì)含量在‘輕浪李紋’中高達(dá)90.22%，而在‘地毯藍(lán)色’中卻僅占0.35%，聚類分析結(jié)果也顯示，二者遺傳關(guān)系相距較遠(yuǎn)。矮牽牛野生原種P.axillaris和P.integri?folia性狀差異較大，P.axillaris具有白色花冠，通過晚上散發(fā)苯環(huán)類物質(zhì)吸引天蛾類昆蟲授粉，P.integrifolia具有紫色的花冠，香味不明顯，一般以蜜蜂授粉。2 個(gè)祖先親本之間的香味差異，使現(xiàn)代矮牽牛在花香性狀明顯分離［19］，本研究中各品種之間花香差異明顯，通過聚類也表現(xiàn)出明顯的分群現(xiàn)象。Robert 等［20］研究矮牽牛品種‘Mitchell’發(fā)現(xiàn)苯甲酸苯甲酯是其主要揮發(fā)成分之一，本研究中同為苯環(huán)類物質(zhì)的苯甲酸甲酯在‘地毯藍(lán)色’中相對(duì)含量達(dá)97.49%，這說明芳香型矮牽牛更多的遺傳了P.axillaris的特征。

花香、花色與花形一直是觀賞植物育種關(guān)注的重要性狀，但是在香石竹中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)代香石竹品種由于多注重花形、花色的選擇，大多品種失去了香氣特征。本研究中所選各品種在花香、花徑和花色上也表現(xiàn)出不同規(guī)律，雖然花色、花形比較豐富，但是大多數(shù)品種香氣較淡，這與現(xiàn)代矮牽牛品種缺乏濃郁芳香型品種的現(xiàn)狀切合。育種過程中、雖然差異篩選會(huì)導(dǎo)致一些不被重點(diǎn)關(guān)注的性狀退化，但我們在研究中也發(fā)現(xiàn)各性狀存在一定的相關(guān)性，白色矮牽牛品種多為淡香型，其揮發(fā)成分種類較少，而藍(lán)色品種香味較濃，揮發(fā)成分種類豐富、揮發(fā)量大，其關(guān)鍵成分多為苯環(huán)類芳香物質(zhì)。在鴛鴦茉莉研究中也證明花徑、花色與花香存在關(guān)聯(lián)，花色變淡的同時(shí)，其苯環(huán)類特征芳香成分揮發(fā)量也逐漸變少［21］。結(jié)合本研究結(jié)果，在今后的芳香矮牽牛育種工作中，深入闡明性狀之間的相關(guān)性，更有可能培育出色、香、形俱佳的品種。

矮牽牛不同品種釋放的花香成分在類型及相對(duì)含量等方面均存在較大差異，這些差異形成了矮牽牛香味特征各異的品種群體，這為矮牽牛的園林應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究通過GCMS、主成分分析與聚類分析等手段對(duì)矮牽牛花揮發(fā)物進(jìn)行了系統(tǒng)分析，其結(jié)果不僅能在矮牽牛品種鑒別、康養(yǎng)園藝療法等方面發(fā)揮重要作用，也可以為芳香植物育種工作提供新的思路。