羽毛針禾根部內(nèi)生假單胞菌XG11在小麥上的定殖動(dòng)態(tài)及促生效應(yīng)

李全芬， 張婷婷， 馬 磊

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000)

荒漠在地球上分布廣泛，荒漠化問題會(huì)影響人類的生產(chǎn)生活，危害地球的生態(tài)系統(tǒng)。羽毛針禾()是新疆沙漠上的先鋒植物，在與環(huán)境的長期斗爭(zhēng)中，形成了抗旱、耐高熱嚴(yán)寒、耐沙埋等沙生適應(yīng)特性，其根鞘內(nèi)的微生物及分泌物，能與根毛共同黏結(jié)沙粒，保水固沙。筆者所在課題組前期在羽毛針禾根部分離獲得了1株具有良好特性的內(nèi)生假單胞菌XG11。研究羽毛針禾根部微生物的作用機(jī)制，對(duì)防治沙漠化和保護(hù)生物多樣性等方面有著重要意義。

假單胞菌()分布廣泛，在土壤細(xì)菌群落中占比可高達(dá)34%，定殖能力強(qiáng)，對(duì)多種植物病原菌有較明顯的拮抗作用，能夠有效促進(jìn)植物生長和增產(chǎn)，是一類具有較大應(yīng)用價(jià)值的植物根際促生菌，常用于植物來提高其抗逆性及增產(chǎn)。其中，熒光假單胞菌應(yīng)用最廣泛。熒光假單胞菌不僅能抑制多種土傳病害病原真菌、卵菌、霉菌和線蟲，甚至通過分泌堿性磷酸酶在內(nèi)的抗病毒蛋白抑制煙草花葉病毒(TMV)侵染；還能改善植物營養(yǎng)促進(jìn)生長，提高品質(zhì)，增加產(chǎn)量。

植物根際促生菌的作用機(jī)制主要包括生物固氮、磷溶作用、產(chǎn)生鐵載體(嗜鐵素)、產(chǎn)生促生物質(zhì)、誘導(dǎo)抗性系統(tǒng)等，而且功能菌株在發(fā)揮作用機(jī)制時(shí)與其屬性、植物屬性、環(huán)境等情況相關(guān)。假單胞菌的誘導(dǎo)抗病性主要表現(xiàn)在提高寄主植株防御酶活性和影響寄主的次生代謝通路。逆境脅迫會(huì)使植物產(chǎn)生過量的活性氧自由基，同時(shí)植物會(huì)啟動(dòng)自身的保護(hù)酶系統(tǒng)來調(diào)節(jié)抗氧化酶、抗氧化劑活性等生理生化過程，清除活性氧自由基，減輕或消除其毒害。鎘脅迫時(shí)，接種銅綠假單胞菌，增強(qiáng)了水稻抗氧化酶活性，提高了類黃酮和總酚等抗氧化物質(zhì)含量，從而緩解逆境脅迫，促進(jìn)水稻生長。熒光假單胞菌FP7菌液也能提高根莖組織中過氧化物酶、過氧化氫酶等防御酶的活性，增強(qiáng)根莖抗病性，具有促生和增產(chǎn)效果。

目前，利用功能微生物促生和防治的研究較多，而促生和防治效果與其在根際的定殖能力有關(guān)，菌株發(fā)揮作用的前提和關(guān)鍵就是其在作物根際建立起一定的種群密度。研究表明，功能菌株對(duì)21種抗生素的敏感值與其在土壤中的定殖能力具有相關(guān)性，這表明采用抗生素法能夠定性地探究菌株的定殖動(dòng)態(tài)。

本研究采用抗生素標(biāo)記法標(biāo)記荒漠植物羽毛針禾根部內(nèi)生假單胞菌XG11，通過盆栽試驗(yàn)檢測(cè)該菌株在小麥植株根部、葉片及根際土壤中的定殖動(dòng)態(tài)；比較不同培養(yǎng)方式下的定殖規(guī)律，同時(shí)通過測(cè)定株高、丙二醛含量、過氧化物酶活性等指標(biāo)，鑒定該菌株對(duì)小麥植株生長發(fā)育的促生作用，旨在評(píng)價(jià)該菌株的應(yīng)用潛力，為菌株有效提高植物的抗逆性提供理論依據(jù)，為解決荒漠化問題，改善生態(tài)環(huán)境提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)：本試驗(yàn)于2020年在新疆石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進(jìn)行。

供試菌株：羽毛針禾根部內(nèi)生假單胞菌XG11，該菌株為筆者所在課題組前期研究分離獲得。

受試植株：津農(nóng)6號(hào)小麥，由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院惠贈(zèng)。

供試培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，含四環(huán)素、鏈霉素、羅紅霉素等抗生素的LB培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的天然抗藥性檢測(cè) 分別配制含濃度為20、50、100、200、300 μg/mL的四環(huán)素、鏈霉素、羅紅霉素的抗性LB培養(yǎng)基平板，對(duì)供試菌株XG11進(jìn)行天然抗藥性檢測(cè)。取100 μL菌懸液(1環(huán)原始菌株溶于2 mL無菌水)均勻涂布在抗性平板上，以無抗生素的LB培養(yǎng)基平板為對(duì)照，重復(fù)3次，于 28 ℃ 培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，以確定抗生素的標(biāo)記種類及濃度。

1.2.2 抗生素標(biāo)記菌株的篩選及穩(wěn)定性分析 通過對(duì)菌株的抗藥性檢測(cè)，篩選出四環(huán)素作為抗藥性突變體的標(biāo)記抗生素。逐步誘導(dǎo)菌株能在濃度為300 μg/mL的四環(huán)素抗性平板上穩(wěn)定生長。將抗性菌株連續(xù)純化8次后，將其在無抗生素LB培養(yǎng)基平板上連續(xù)接種19次，再接入300 μg/mL四環(huán)素抗性平板，若菌株能夠生長，說明獲得的抗生素標(biāo)記菌株具有良好的抗藥穩(wěn)定性。把穩(wěn)定性菌株純化，保存到 4 ℃，備用。

挑取原始菌株和單抗菌株單菌落，分別接入裝有5 mL LB培養(yǎng)基的試管中(編號(hào)分別為0、4、8、12、16、20、24 h)，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，以未接菌的LB培養(yǎng)液為空白對(duì)照。按時(shí)間取出對(duì)應(yīng)的試管，4 ℃冷藏保存，直到取完24 h的樣品后，在600 nm波長處測(cè)定吸光度()，以時(shí)間為橫軸、為縱軸繪制生長曲線，比較原始菌株和抗性菌株的生長速率。

1.2.3 抗性菌株在小麥根際的定殖動(dòng)態(tài) 將標(biāo)記菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，10 000 r/min離心10 min，收集沉淀，配制成為1.0的菌懸液，4 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

挑選籽粒飽滿、健康、大小均勻、無霉變的小麥種子，用無菌水反復(fù)清洗3遍，置于無菌的9 cm培養(yǎng)皿中，加入15 mL無菌水，于30 ℃黑暗培養(yǎng)16 h，吸取代謝物后，CK加無菌水4 mL，其他的處理組加菌懸液4 mL，繼續(xù)黑暗培養(yǎng)8 h，待其露白。

培養(yǎng)皿試驗(yàn)：在鋪有濾紙的11 cm培養(yǎng)皿中，加3 mL無菌水濕潤整張濾紙，挑選10粒露白發(fā)芽的小麥種子，種植方向、間隔保持一致，重復(fù)3次。置于人工氣候培養(yǎng)箱中，在白天28 ℃ 14 h、晚上22 ℃ 10 h的條件下培養(yǎng)。種下第1 天，CK組、菌懸液組都加6 mL無菌水，直到小麥全部發(fā)芽，CK組加 6 mL 無菌水，菌懸液組加6 mL菌懸液，此后不加菌懸液，根據(jù)實(shí)際情況，適當(dāng)增加澆水量。于接種第7天采集根、葉子，用清水清洗，吸水紙吸干后，稱取根與葉組織0.5 g，在無菌環(huán)境下，用75%無水乙醇浸泡30 s，用無菌水清洗3次后，置于無菌研缽中，加入9 mL無菌水研磨充分，裝入10 mL無菌離心管振蕩30 min，充分混勻后，靜置10 min后用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，選擇10、10、10的土樣 200 μL 均勻涂布在含300 μg/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，記錄每皿菌落數(shù)，并計(jì)算每克鮮組織中的菌落數(shù)(CFU/g)。

盆栽試驗(yàn)：在長4.8 cm、寬4.8 cm、高5.0 cm的無菌種植盤中裝入滅過2次菌的沙土，種植 10粒/孔露白發(fā)芽的小麥種子，種植方向、深度保持一致，每個(gè)處理重復(fù)5次。培養(yǎng)條件同培養(yǎng)皿試驗(yàn)。于接種7、14、21、28 d后采集土壤(1.0 g)、根(0.5 g)與葉(0.5 g)，測(cè)定菌株的定殖含量，方法同培養(yǎng)皿試驗(yàn)的菌株定殖測(cè)定。

1.2.4 菌株XG11對(duì)小麥的促生作用 參照“1.2.3”節(jié)中的方法制備=0.3的菌懸液和萌發(fā)小麥種子，并進(jìn)行小麥盆栽試驗(yàn)。每隔2 d澆灌菌懸液5 mL，根據(jù)實(shí)際情況，適當(dāng)增加澆水量。在幼苗生長7、14、21、28 d后采樣，測(cè)定株高、丙二醛含量、過氧化物酶(peroxidase，POD)活性，并記錄發(fā)芽率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019、GraphPad Prism 8.02軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并作圖，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncun’s法進(jìn)行方差分析和多重比較(<0.05)。圖中數(shù)據(jù)形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株天然抗藥性篩選結(jié)果

由表1可知，羽毛針禾根部內(nèi)生菌XG11對(duì)四環(huán)素、鏈霉素、羅紅霉素均具有天然抗性。在一定程度上，四環(huán)素具有較好的抗藥可控性。接種24 h，菌株可在含低濃度四環(huán)素的LB培養(yǎng)基平板上生長，而在較高濃度(200、300 μg/mL)下不生長。因此，本研究選用四環(huán)素對(duì)菌株進(jìn)行標(biāo)記。

表1 菌株XG11的天然抗藥性測(cè)定結(jié)果

2.2 標(biāo)記菌株的穩(wěn)定性檢測(cè)

進(jìn)一步篩選出能耐300 μg/mL四環(huán)素的標(biāo)記菌株。由圖1可知，經(jīng)19次傳代培養(yǎng)后，其仍能在含抗生素的平板上穩(wěn)定生長，而且標(biāo)記菌株(XG11)和原始菌株(XG11)的生長曲線趨勢(shì)一致。標(biāo)記菌株生長曲線略低于原始菌株，這可能是在誘變菌株時(shí)，有一定的損耗，但是不影響后續(xù)試驗(yàn)的定殖檢測(cè)，說明標(biāo)記菌株具有良好的抗藥穩(wěn)定性。

2.3 標(biāo)記菌株的定殖動(dòng)態(tài)

利用含300 μg/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基平板，檢測(cè)菌株XG11在小麥根際土壤、根與葉中的定殖數(shù)量及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。由圖2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌株在根際土壤和葉中的定殖量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；菌株在小麥根系中的定殖量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，但是低于起初(7 d后)的定殖量。

在不同部位定殖具有一定差異。在7d后，葉中的定殖量略高于根際土壤和根(2.70×10CFU/g>2.33×10CFU/g>4.50×10CFU/g)；其他時(shí)間，菌株在不同部位中的定殖量呈現(xiàn)出根際土壤>根>葉。菌株在土壤和根部能夠定殖28 d，此時(shí)含量分別為 1.70×10、1.45×10CFU/g，而在葉片中只能定殖14 d。

2.4 2種培養(yǎng)方式下的菌株在小麥根與葉中的定殖量差異

采用土培(盆栽試驗(yàn))和水培(培養(yǎng)皿試驗(yàn))2種方式培養(yǎng)小麥。在小麥根部與葉片中的XG11定殖量及其定殖動(dòng)態(tài)不同(圖3)。在相同培養(yǎng)時(shí)間(7 d)土培方式下根與葉中的XG11定殖量遠(yuǎn)高于水培方式的定殖量。水培時(shí)，菌株XG11在根中的定殖量大于葉中；而土培時(shí)，定殖情況則相反，葉中的定殖量略高于根中。

2.5 菌株對(duì)小麥幼苗生長的影響

由圖4可知，接種假單胞菌XG11能夠促進(jìn)小麥發(fā)芽、增加株高、提高葉片POD 活性，降低丙二醛含量，對(duì)小麥幼苗生長具有促生作用。處理3 d后，菌株XG11處理組和對(duì)照組的小麥發(fā)芽率一致，此后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，菌株XG11處理的小麥發(fā)芽率均高于對(duì)照組，且菌株XG11處理組的小麥發(fā)芽率接近100%。除在14 d后外，菌株XG11處理的小麥株高均高于對(duì)照組。28 d后小麥的株高低于21 d后，可能是由于干旱脅迫加劇(沙土中利于植物生長的營養(yǎng)物質(zhì)耗盡)，小麥植株開始死亡。

隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，小麥葉片中丙二醛含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。接種菌株XG11，在7、28 d后，小麥葉片的丙二醛含量低于對(duì)照組，28 d后的丙二醛含量高于7 d后；14、21 d后與7、28 d后小麥葉片的丙二醛含量變化規(guī)律相反，菌株XG11處理組丙二醛含量高于對(duì)照組；21 d后的丙二醛含量最高，為0.030 4 μmol/g，比CK高12%；其次是28 d后的丙二醛含量，為 0.022 2 μmol/g，比CK低5%；7 d后的丙二醛含量最低，為0.013 3 μmol/g，比CK低2%(圖4)。

隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，接種菌株XG11處理組，小麥葉片POD活性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。在7、28 d后，小麥葉片POD活性高于對(duì)照組，28 d后的POD活性高于7 d后；14、21 d后與7、28 d后小麥葉片POD活性變化規(guī)律相反，POD活性低于對(duì)照組；28 d 后的POD活性最高，為13 860 U/(g·min)，比CK高2%；14 d后的POD活性最低，為 8 980 U/(g·min)，比CK低9%；7 d后的POD活性為9 860 U/(g·min)，比CK高45%(圖4)。

3 討論

植物根際促生菌在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，效果不穩(wěn)定。造成不穩(wěn)定的因素主要是植物根際促生菌的定殖能力存在差別。本試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株XG11在不同采集部位的定殖時(shí)間和定殖量及變化規(guī)律不同，在根際土壤和植株根內(nèi)的定殖時(shí)間最長，均在28 d以上，而在葉片中只能夠定殖14 d左右，說明該菌株能在小麥植株體內(nèi)和土壤中長期有效定殖。定殖量表現(xiàn)為根際土壤>根>葉，差異顯著，與姚錦愛等的研究結(jié)果一致。菌株XG11接種至小麥 21 d 內(nèi)，在根際土壤、小麥根與葉中的定殖規(guī)律一樣，均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這表明菌株的活性在降低，從而導(dǎo)致對(duì)植株的作用減弱。有研究表明，枯草芽孢桿菌在胡椒葉片上能夠定殖長達(dá)21 d，且定殖量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。熒光假單胞菌能在楊樹根際和菌根際長期穩(wěn)定定殖，定殖規(guī)律一樣呈現(xiàn)下降態(tài)。

采用不同的培養(yǎng)方式，菌株XG11在小麥根與葉片中的定殖量差異顯著，定殖量表現(xiàn)為土培>水培，與劉東平等的研究結(jié)果相似。有研究表明，在進(jìn)行菌株接種時(shí)采用灌根方式優(yōu)于涂莖方式。因此，本研究發(fā)現(xiàn)在利用功能菌株XG11提高植物的抗逆性、抗病能力的最好方式是土壤培養(yǎng)植物，將菌株菌懸液澆灌到植物根圍。

種子發(fā)芽率是測(cè)試種子萌發(fā)能力強(qiáng)弱的一個(gè)指標(biāo)，為選擇優(yōu)勢(shì)種子提供理論基礎(chǔ)，甚至在逆境中，種子萌發(fā)率的高低與植株后來的生長狀況也密切相關(guān)。菌株XG11處理下，小麥發(fā)芽率趨近于100%，高于對(duì)照組，這表明菌株能提高小麥發(fā)芽率，和湯麗斯等的研究結(jié)果一致。

植物株高是描述植物形態(tài)性狀的指標(biāo)，它能夠直觀地表現(xiàn)出植物的生長狀況，并且直接影響著植物的抗逆性和抗倒伏性，甚至嚴(yán)重影響著植物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)等狀況，也是一個(gè)衡量植物長勢(shì)、健康程度的重要指標(biāo)。在7、21、28 d后，接種菌株XG11的小麥株高均高于對(duì)照組，表明菌株XG11利于植物生長。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，株高降低，可能是由于干旱脅迫加劇以及土壤養(yǎng)分減少所致，應(yīng)須額外補(bǔ)充養(yǎng)分。

丙二醛是植物細(xì)胞膜在逆境脅迫下發(fā)生膜脂過氧化的產(chǎn)物，其可以交聯(lián)脂類、核酸、蛋白質(zhì)、糖類等大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)，從而損害細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能，能夠指示植物受到逆境脅迫的傷害程度。丙二醛含量越高，受到迫害越大，抗逆性越低。本研究結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，小麥葉片的丙二醛含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，28 d后的丙二醛含量低于21 d后，這表明隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，植物受到的干旱脅迫加劇。施加菌株后，在7、 28 d 后，葉片丙二醛含量下降，說明菌株通過降低丙二醛的含量，從而緩解脅迫。

丙二醛含量與抗氧化酶活性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，能反映小麥的品種特性。本研究發(fā)現(xiàn)接種菌株XG11后，小麥葉片POD活性與丙二醛含量變化規(guī)律呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，即小麥葉片POD活性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，這可能是由于干旱脅迫加劇，植物體內(nèi)產(chǎn)生了過量的活性氧自由基，需要更多的POD，從而抵抗逆境對(duì)植物的傷害。有研究表明，低濃度的硒可提高POD活性，增加青花菜幼苗的抗氧化能力，保護(hù)植物細(xì)胞膜穩(wěn)定性，從而提高植物的抗逆性。本試驗(yàn)中在根部接入菌株XG11使得小麥的POD活性增高，提高了植物的耐旱性與之相一致。內(nèi)生細(xì)菌與氧化應(yīng)激酶有一定的聯(lián)系，在鹽濃度下番茄的POD、過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)的活性降低，而經(jīng)過內(nèi)生細(xì)菌處理后，POD等這些酶活性提升3倍，并且內(nèi)生細(xì)菌可以像植物生長調(diào)節(jié)劑一樣作用于植物，從而起到保護(hù)植物的作用。

綜上，接種菌株XG11，小麥的發(fā)芽率、株高、POD活性均高于對(duì)照組(28 d后)，丙二醛含量低于對(duì)照組(28 d后)，這可能都是由于菌株XG11在植物體內(nèi)定殖成功，從而提高了植物的抗逆性、促進(jìn)植物生長，高毓晗等的研究結(jié)果有力地支撐了此結(jié)論。

4 結(jié)論

荒漠植物羽毛針禾根部內(nèi)生菌假單胞菌XG11能在小麥根部土壤及幼苗組織中定殖，在土壤和根內(nèi)定殖時(shí)間長達(dá)28 d以上，且定殖量表現(xiàn)為根際土壤>根>葉，土壤盆栽>培養(yǎng)皿水培；能提高小麥發(fā)芽率、株高和POD活性，降低丙二醛含量，從而提高小麥的抗旱性，促進(jìn)小麥幼苗的生長發(fā)育，是一株有潛力的促生菌。