基于線粒體NADH脫氫酶亞基2標記的東南太平洋不同表型間莖柔魚群體遺傳學分析

徐 豪，梁緒虹，王叢叢,2，李 綱,2

1.上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306

2.國家遠洋漁業(yè)工程技術研究中心/大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點實驗室/農業(yè)農村部大洋漁業(yè)開發(fā)重點實驗室，上海 201306

莖柔魚 (Dosidicus gigas) 隸屬于槍形目、柔魚科、莖柔魚屬，是柔魚科體型最大、資源量最為豐富的種類之一[1-2]。莖柔魚廣泛分布于東太平洋 (140°W以東, 40°N—47°S)，加利福尼亞灣至智利北部是其主要分布區(qū)域，特別是秘魯和加利福尼亞灣海域是其重要漁場[3]。目前，莖柔魚已成為世界頭足類產量最高的種類之一，也是中國魷釣漁業(yè)重要的捕撈對象。據聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織 (FAO) 統(tǒng)計，2018年莖柔魚產量已占中國頭足類產量的30%以上[4]。根據性成熟時胴長，Nigmatullin等[3]將東南太平洋莖柔魚分為3個群體：大表型群[成年雄性的胴長 (ML) 400～500 mm、雌性550～650 mm至1 000～1 200 mm]，中表型群[分別為240～420 mm和280～600 mm]和小表型群[分別為130～260 mm和140～340 mm]。研究表明，莖柔魚個體繁殖力與其個體大小密切相關，體型越大，其繁殖力也會越強[5-6]，了解不同表型莖柔魚間的群體結構是對其進行資源評估和管理必不可少的方面。同時，魷魚類又處于生態(tài)系統(tǒng)中承上啟下的中間地位，其資源的變動直接影響到整個生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[7]。因此，作為南太平洋區(qū)域漁業(yè)管理組織重要的管理對象，科學有效地對莖柔魚資源進行評估管理是維持莖柔魚漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重中之重，種群是漁業(yè)管理的基本單位，對莖柔魚種群結構及其時空分布變動的認知將直接影響資源評估結果及后續(xù)的資源管理。

東南太平洋莖柔魚分布非常廣泛，跨越不同氣壓帶、洋流系統(tǒng)和生態(tài)系統(tǒng)，棲息環(huán)境復雜多變，單一的形態(tài)學手段無法科學有效地將不同區(qū)域、不同大小以及不同環(huán)境條件下的莖柔魚群體進行劃分，而種群遺傳學研究則可通過一定的DNA標記識別離散的亞種群，從而了解種群結構、種內變異性和基因流。由于莖柔魚在漁業(yè)及生態(tài)系統(tǒng)中的重要性，近年來對莖柔魚群體遺傳學的研究也逐漸增多，如利用線粒體DNA標記COI[8]對不同區(qū)域莖柔魚群體遺傳差異的研究，Sanchez等[9]利用線粒體DNA標記ND2 和微衛(wèi)星標記對東太平洋的莖柔魚種群歷史動態(tài)的研究，以及劉連為等[10]利用線粒體DNA標記Cyt b和微衛(wèi)星標記對秘魯外海莖柔魚大型群與小型群體進行群體遺傳學的研究。中國遠洋魷釣漁業(yè)在東南太平洋的主要作業(yè)海域為赤道及秘魯外海公海海域，不同海域的性成熟莖柔魚的漁獲物胴長存在顯著差異 (3種表型)，而目前國內尚未見對大、中、小3種表型以及主要作業(yè)海域莖柔魚遺傳結構進行評估，為此本研究選取進化速率適中的線粒體NADH脫氫酶亞基2 (ND2) 基因來分析東南太平洋不同表型莖柔魚的群體遺傳結構，以期為莖柔魚漁業(yè)資源的管理和可持續(xù)開發(fā)利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和DNA提取

實驗樣本源自于舟山寧泰遠洋漁業(yè)有限公司國家遠洋漁業(yè)觀察員計劃信息船及觀察員于2018年和2019年在東南太平洋公海隨機采集的莖柔魚樣本，主要的3塊采樣區(qū)域 (A、B、C)見圖1。莖柔魚樣本經速凍、冷藏后運回上海海洋大學實驗室。選擇性成熟個體，根據胴長將樣本分成大、中、小3種表型組，并取其胴體肌肉，利用標準酚氯仿抽提法提取基因組DNA[11]，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃保存?zhèn)溆?。樣本采集時間、區(qū)域、數量以及對應體長組見表1。

表1 樣本采集區(qū)域與數量Table 1 Area and number of samples

1.2 PCR擴增及序列測定

反應體系為25 μL，其中DNA模板0.3 μL、PCRMix 12.5 μL、上下游引物各 1 μL、雙蒸水 10.2 μL。PCR擴增引物序列根據軟件Primer 5.0設計，參考序列為莖柔魚線粒體ND2序列 (Gene ID 5 469 438)，由生工生物工程(上海) 有限公司合成，具體引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

擴增ND2序列的反應條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 60 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，26 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴增后的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程(上海) 有限公司進行序列測定。

1.3 數據處理與分析

測序后的ND2基因序列在MEGA 7.0[12]軟件中選用Clustal W比對后進行裁剪得到可用的序列，并根據鄰接法(Nighbour-joining, NJ) 以鳶烏賊 (Symplectoteuthis oualaniensis)ND2基因序列作為外群繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹。通過軟件DnaSP 6.12[13]分析核苷酸組成、單倍型數 (H)、單倍型多樣性指數 (Hd)、核苷酸多樣性指數 (Pi) 并計算得到用于后續(xù)分析的單倍型數據。利用獲得的ND2單倍型數據在Network 4.0[14]軟件中制作單倍型網絡圖，并在Arlepuin 3.5.2.軟件[15]中通過AMOVA分析計算遺傳分化系數 (Fst)和基因流 (Nm) 并評估種群的遺傳多樣性水平。根據Tajiam'sD[16]、Fu'sFs[17]中性檢驗結果和核苷酸不對稱分布情況[18-19]對種群歷史動態(tài)進行分析。

2 結果

2.1 序列分析

經過Clustal W序列比對裁剪，獲得90條長度為876 bp的莖柔魚部分ND2基因序列，包含33個單倍型，其中22個單倍型分別只屬于3個群體中的某一個，所占總頻率為0.666 7。在分析的ND2基因序列中，檢測到31個可變(多態(tài)) 位點，其中包含17個單一突變位點和14個簡約信息位點。另外，90個莖柔魚樣本的C、T、A、G 4種堿基的比例分別為7.28%、22.40%、33.12%、37.2%，A+T的含量 (55.52%) 顯著高于C+G的含量 (44.48%)，其中G含量最高，C含量最低。

2.2 遺傳多樣性分析

3個表型群體莖柔魚的Hd均較高，其中中表型群的Hd(0.872) 高于另外2個表型群 (0.797和0.768)，Pi同樣如此(表3)。基于ND2基因序列的AMOVA分析結果表明來源于種群內的變異達到了100.45%，說明所有的變異都來自群體內。

表3 基于ND2序列的莖柔魚遺傳多樣性參數Table 3 Genetic diversity parameters of ND2 gene sequences in D.gigas

Fst可用來表征種群內各亞種群間的近交程度，兩兩表型群間的Fst均小于0.05且P均大于0.05，而兩兩表型群間的Nm均遠大于1，這表明東南太平洋大、中、小3種表型的莖柔魚群體間具有頻繁的基因交流，未出現(xiàn)顯著的遺傳分化 (表4)。

表4 基于ND2基因的莖柔魚群體間遺傳分化系數 (對角線下方) 和基因流 (對角線上方)Table 4 Population pairwise Fst (below diagonal) and gene flow(Nm, above diagonal) of populations based on ND2 gene sequences

2.3 莖柔魚歷史種群動態(tài)分析

在種群擴張模型中對3個表型群以及平均的粗糙指數(Raggedness index) 進行計算，發(fā)現(xiàn)P均大于0.05，無顯著性差異，表示這個數據適合于種群擴張模型?；贜D2基因序列的Tajima'sD和Fu'sFs中性檢驗結果見表5，所有表型群以及平均的Tajima'sD和Fu'sFs均為負數，但中表型群的Tajima'sD不存在顯著差異 (P>0.05)，所有表型群的Fu'sFs均表現(xiàn)出顯著差異 (P<0.05)。負的Tajima'sD和Fu'sFs以及兩者差異顯著的P表示種群經歷過擴張，從理論上說，F(xiàn)u'sFs方法檢驗效果要比Tajima可靠，因此，可以認為3個區(qū)域群體在歷史上經歷了種群擴張事件。同樣，基于ND2基因序列的核苷酸不配對分布結果顯示，3個表型群以及總體的核苷酸錯配分布曲線均出現(xiàn)了明顯的單峰 (圖2)，說明莖柔魚群體在歷史上經歷了種群擴張事件，與中性檢驗的結果相一致。

圖2 基于ND2基因的莖柔魚群體核苷酸不配對分布Fig.2 Mismatch distribution graphs of populations based on ND2 gene sequences

表5 中性檢驗結果和Raggedness index的計算 (包含P)Table 5 Results of neutrality tests and Raggedness index including P-values

2.4 莖柔魚群體的系統(tǒng)進化關系

利用MAGE 7.0軟件基于ND2基因序列以Kimura雙參數模型 (K-2-P) 構建NJ樹 (圖3)。莖柔魚群體NJ系統(tǒng)進化樹中無明顯分支，且分支間遺傳距離較小，3個表型群個體較隨機地分布在進化樹中，表明莖柔魚群體未出現(xiàn)遺傳分化。

圖3 基于ND2基因的莖柔魚NJ系統(tǒng)進化樹Fig.3 Rooted neighbor-joining tree of populations based on ND2 gene haplotypes

通過ND2基因單倍型序列以Network繪制網絡圖 (Median-joining network, MJ網絡圖，圖4)。發(fā)現(xiàn)H1和H3是主要的核心單倍型，通過單一突變或多步突變相連，并都包含了來自3個表型群內的單倍型。同時，3個表型群單倍型間彼此相互關聯(lián)，不存在與3個表型群對應的獨立單倍型，這也證明了3個區(qū)域群體間存在一定的基因交流。且網絡圖呈放射狀分布，這與之前的種群擴張模式相一致，進一步驗證種群擴張事件的發(fā)生。

圖4 莖柔魚ND2基因單倍型的網絡圖Fig.4 Median-joining network of ND2 gene haplotypes of D.gigas

3 討論

東南太平洋不同表型群的莖柔魚在地理分布上存在顯著的差異，大表型群主要分布在棲息范圍的南部，中表型群在整個棲息范圍內均有分布，而小表型群主要分布在赤道海域[3]。同時由于莖柔魚漁業(yè)資源分布廣、資源量大，種群的遷徙變動受到復雜的洋流體系影響，單一的形態(tài)學手段無法科學有效地識別不同區(qū)域、不同大小以及不同環(huán)境條件下的莖柔魚亞種群，而種群遺傳學的研究則可以通過一定的DNA標記識別離散的亞種群，從而了解種群結構、種內變異性和基因流。在分子標記的選取中，與能量物質腺嘌呤核苷三磷酸 (ATP) 產生直接相關的線粒體NADH脫氫酶亞基在環(huán)境因子脅迫下的適應性進化中具有適中的進化速率[20]，同時根據陳維[21]對同為頭足類的短蛸(Octopus ocellatus) 的多個NADH脫氫酶亞基的序列對比結果，ND2基因具有較高的核苷酸多態(tài)性。

基于線粒體DNA序列的遺傳分析可以得到莖柔魚群體基本的遺傳多樣性和種群遺傳結構信息。在本研究中，基于ND2基因序列測得的A+T含量 (55.52%) 顯著高于C+G含量 (44.48%)，4種核苷酸組成呈現(xiàn)不均一分布，這與其他大洋性頭足類，如阿根廷滑柔魚 (Illex argentinus) 的細胞色素氧化酶I (COI) 和細胞色素b(Cyt b) 基因[22]、柔魚(Ommastrephes bartramii) 的COI和Cyt b基因[23]等的核苷酸組成特征一致。由遺傳多樣性分析的結果可知，基于ND2基因序列測得的Hd較高，而Pi較低，根據莖柔魚種群動態(tài)分析的結果推斷這可能是因為東南太平洋莖柔魚群體在歷史上存在迅速擴張的時期，單倍型多樣性隨著莖柔魚數量的快速增加而增加，但核苷酸產生的變異沒有足夠的積累時間[24]，這種高Hd低Pi的特征常見于具有一定游泳能力的海洋生物[25-27]。

在莖柔魚的系統(tǒng)進化關系研究中，基于ND2基因的莖柔魚個體NJ進化樹和MJ單倍型網絡圖的結果呈現(xiàn)一致性，較小分支中的個體 (M42、M15、M31、M12、S24、L7) 分屬單倍型H17、H23、H15和H5，來自不同表型的莖柔魚樣本在單倍型網絡圖中相互交織，未出現(xiàn)獨立的進化分支。同時，在MJ單倍型網絡圖中，以核心單倍型H3和H1為中心，其他單倍型呈放射狀分布，呈現(xiàn)較為典型的星狀圖譜，這與劉連為等[10]基于COI基因的秘魯外海莖柔魚的單倍型網絡圖分析結果相吻合 (亦呈現(xiàn)有2個核心單倍型構成的星狀圖譜)。

莖柔魚是高度洄游的大洋性頭足類，游泳能力強，受到東南太平洋復雜的洋流系統(tǒng)影響，在東南太平洋有著廣闊的洄游范圍和復雜的洄游路徑[28]。同時，由于洋流周期性循環(huán)，使得東南太平洋的莖柔魚在秘魯沿岸形成了較為集中的產卵場[29]，有助于不同表型群的莖柔魚間頻繁的基因交流 (Nm>1)，最終使得莖柔魚不同表型群在遺傳上未出現(xiàn)分化 (Fst<0.05,P>0.05)。與現(xiàn)有的研究結果對比，劉連為等[10]利用線粒體DNA與微衛(wèi)星2個分子標記對秘魯外海莖柔魚大型群與小型群的遺傳變異進行研究，認為2個群體不存在顯著的遺傳分化；Sanchez等[9]基于ND2序列和微衛(wèi)星標記的秘魯寒流系統(tǒng)中莖柔魚大小兩群體間遺傳分析也得出了相同的結論。生物體表型特征一般由自身的遺傳信息決定，并轉錄表達，但也存在同種基因型對不同環(huán)境因素產生響應，Tafur等[30]研究表明，實際上可能不存在這3類性成熟長度，這可能是對環(huán)境變化和食物供應的一種響應，而Arkhipkin等[31]則認為莖柔魚早期生活史(3—6月) 所經歷的水溫條件最終決定了其年齡和胴長，結合本研究結果，遺傳變異導致的莖柔魚表型性狀差異可能性較小。考慮到生物體可能通過對環(huán)境因子的響應調控基因的轉錄而產生不同的表型特征即表型可塑性，因此，不同表型群的莖柔魚在性成熟胴長大小上存在的差異可能與不同的洄游路徑和所處的棲息地條件有關。

4 結論

本研究利用線粒體ND2基因序列對東南太平洋不同表型的莖柔魚群體遺傳結構進行研究，以期為莖柔魚漁業(yè)資源的評估和管理提供重要依據。研究表明不同海域大、中、小3種表型的莖柔魚群體間不存在顯著的遺傳分化，建議將東南太平洋的莖柔魚群體劃為一個種群進行評估管理。同時，考慮到莖柔魚不同表型產生的原因，綜合考慮其生活史及其對應的棲息條件將有助于更加合理地保護與開發(fā)利用莖柔魚資源。然而，線粒體標記本身相對于全基因組序列而言包含的遺傳信息較少，且多態(tài)性水平較低，對準確反映莖柔魚整體的遺傳信息具有一定的局限性。其次，受到采樣條件的限制，大表型群體的樣本數量較少，因此，東南太平洋不同表型莖柔魚群體間的遺傳關系仍存在不確定性，需要在提高樣本數量的同時，利用單核苷酸多態(tài)性 (Single nucleotide polymorphism, SNP) 標記等基因組覆蓋面更廣的分子標記對其群體遺傳結構進行對比研究。